孙建义[1]2003年在《耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究》文中指出饲料在制粒时温度70～80℃，易造成木聚糖酶大量失活，所以提高热稳定性直接关系到其在饲料工业中的应用前景，是当前急待解决的重大难题。本研究筛选出能产木聚糖酶的微生物；克隆并在大肠杆菌中表达了木聚糖酶基因或cDNA，对产物特性进行了系统研究；在此基础上，设计、构建并表达了耐热木聚糖酶杂合基因HX，系统地评价了表达产物活性和耐热性能。主要研究结果如下： 采用RBB-木聚糖水解透明圈技术，筛选出具有木聚糖酶活性的不同微生物。单位发酵液中木聚糖酶活性由高到低依次为黑曲霉FS6(木聚糖酶ANXW)、枯草芽孢杆菌2(酶BSXW)、环状芽孢杆菌BC(酶BCXW)和褐色高温单孢菌TF(酶TfxW)；对其主要生化特性研究表明，酶TfxW、BSXW、BCXW和ANXW最适反应pH分别为6.0、6.0、5.0和5.0，最适反应温度分别为70℃、60℃、50～60℃和50℃；酶BSXW、BCXW和ANXW在低温下活性较高，而TfxW在高温下酶活相对较高。 采用基因克隆技术，分别克隆了枯草芽孢杆菌2、环状芽孢杆菌BC和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA。枯草芽孢杆菌2和环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因长度均为702bp，开放阅读框架(ORF)为39bp～680bp，编码213个氨基酸；褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因长度为1067bp，ORF为31bp～1047bp，编码338个氨基酸；黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA长度为720bp，该序列是一个初级转录本，含有一个49bp(265bp～313bp)的内含子，外显子cDNA序列编码211个氨基酸。上述基因或cDNA与T-vector连接后，分别获得了重组克隆载体pGEM~(?)-T Easy BSX Vector、pGEM~(?)-T Easy BCX Vector、pGEM~(?)-T Easy Tfx Vector和pGEM~(?)-T Easy ANX Vector。 采用亚克隆技术，以pET-30(a)+为表达载体，在E. coli BL21中表达了枯草芽孢杆菌2和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA，分别获得了阳性重组表达子E. coli BSX、E. coli Tfx和E. coli ANXE，其中E. coli ANXE表达产物为包涵体，经复性具有木聚糖酶活性。 分离和纯化了基因工程菌E. coli BSX和E. coli Tfx表达产物，对它们的生化特性进行了系统研究。E. coli BSX和E. coli Tfx在LB培养基中37℃下分别培养16h，单位发酵液中木聚糖酶活性分别为10.18U/ml和27.63U/ml。SDSPAGE凝胶电泳检测表明，木聚糖酶BSX分子量为20.31kDa，Tfx分子量为31.98kDa，它们均为成熟肽。BSX的最适反应温度为50～60℃，低温时酶活高于高温，40℃以下相对稳定，50℃以上酶活损失较大。Tfx的最适反应温度为70℃，低温条件下活性较低；60℃以下相对稳定，70℃以上酶存活率迅速下降。BSX的低温酶活性优于Tfx，但Tfx的耐热性能优于BSX。BSX最适反应pH为6.0，耐热木聚糖政杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究博士学位论文在pHS.0~7.0之间酶活性较高，pH4.0一7.0之间较为稳定;T丘的最适反应pH为6.0，在pHS.0~7.0之间酶活性较高，pHS.0一9.0之间较为稳定。 通过对木聚糖酶BSX和T丘的成熟肤氨基酸序列同源性和二级结构单元的分析，设计并构建了耐热杂合木聚糖酶分子，通过表达获得了耐热杂合木聚糖酶基因工程菌E.coli HX，分离和纯化了表达产物，进而系统研究了其酶学特性。以pGEM叱T Easy BSX Veetor为模板，SRBsX02、3RBsX01(含限制性内切酶劝01)为引物扩增出532bp基因片断;以pGEM吼T EasyT丘Vector为模板，5拙sxol(含限制性内切酶B田刀Hl)、3盼sx02为引物扩增出1一7bp基因片断;以这两个基因片段为模板，SRBsX01、3RBsX01为引物，采用基因拼接技术(SOE)构建了长度为628bp的木聚糖酶杂合基因，获得了含杂合基因的重组质粒 poEM叱T Easy HX Veetor。将经BamHI和乃01双酶切获得的杂合基因连接到经相同酶切的pET 30a(+)表达载体中，并导入到E.coli BL21中表达。采用RBB一木聚糖水解透明圈技术，获得了基因工程菌E.coli HX菌株。在LB培养基中37℃下培养16h，该基因工程菌单位发酵液酶活性为288U/ml;与出发菌株的枯草芽抱杆菌2和褐色高温单抱菌TF及其基因工程菌E.coli BSX和E.coli Tfx相比，酶活分别提高了3.77倍、6.50倍、27.29倍和9.42倍。酶学特性研究表明，杂合木聚糖酶HX分子量为27.2 kDa，最适反应温度为50一60℃;模拟饲料制粒温度，经70℃、80℃和90℃处理Zmin，HX存活率分别为96%、74%和48%，而亲本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分别为17%、9%、2%和78%、40%、12%，与BSX和Tfx相L匕，HX分别提高了4.65倍、7.22倍、23.00倍和0.23倍、0.85倍、3.00倍。杂合木聚糖酶HX最适反应pH为6.0一7.0;最稳定pH为5.0一7.0。在37℃、pH6.0(模拟动物小肠生理环境)条件下，相同酶活的HX在RBB一木聚糖平板上的水解透明圈显着大于木聚糖酶Tfx和BSX;在pH6.o、400C保温4omin，HX使木聚糖粘度下降2 5.15%，而BSX和Tfx分别下降9.09%和0%。
刘明启[2]2007年在《提高木聚糖酶热稳定性、催化活性和结合水解纤维素能力的研究》文中认为为了提高木聚糖酶的热稳定性、催化活性和底物的结合水解性能,本研究以G／11家族黑曲霉木聚糖酶A(Aspergillus niger xylanase A, AnxA)和褐色高温单孢菌木聚糖酶A(Thermomonospora fusca xylanase A, TfxA)为亲本,设计出两种杂合木聚糖酶基因,并系统研究了毕赤酵母表达的杂合木聚糖酶及其亲本酶的酶学性质。主要研究结果如下：1杂合木聚糖酶基因atx的分子设计和表达为了提高AnxA的热稳定性和催化活性,其催化结构域N-末端序列被TfxA中相应序列所取代,获得的杂合木聚糖酶基因atx在大肠杆菌中的表达产物EATx主要以包涵体形式存在。atx在毕赤酵母中获得表达,其表达产物PATx和AnxA具有相同的催化活性中心。经0.25%甲醇诱导培养96h,基因工程菌pPATx86发酵上清液中木聚糖酶PATx活性为633.0 U／mg,分别是酵母表达黑曲霉木聚糖酶A (reAnxA)和酵母表达褐色高温单孢木聚糖酶A (reTfxA)的3.6倍和5.4倍。因此,通过N-末端序列替换显着提高了AnxA的催化活性。进一步分析表明,IPATx、reAnxA和reTfxA均无纤维素酶活性。2杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的酶学性质PATx的最适温度和最适pH分别为60℃和pH5.0；在70℃、pH5.0条件下处理2 min,残余酶活为72%；在pH3.0.9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。reAnxA的最适温度和最适pH分别是50℃和pH5.0；在70℃、pH5.0条件下处理2 min,残余酶活为42%；在pH3.0-8.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。reTfxA的最适温度和最适pH分别是60℃和pH6.0；在70℃、pH6.0条件下处理2 min,残余酶活为70%；在pH5.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。SDS-PAGE结果表明,IPATx的相对分子量为20.78 kDa,与理论推算的分子量(21.04 kDa)相吻合。杂合木聚糖酶PATx具有较好的pH稳定性。通过与TfxA的N-末端序列替换显着提高了AnxA的热稳定性,表明reTfxA的N-末端序列与酶蛋白的热稳定性密切相关。小麦木聚糖酶抑制剂TAXI-I对PATx、reAnxA和reTfxA均具有抑制活性。相同酶活的PATx、reAnxA和reTfxA分别与TAXI-I在20℃下作用30 min,其残余酶活分别为35.0%、18.0%和85.3%。表明,TfxA的N-末端序列替换提高了AnxA对小麦木聚糖酶抑制剂的抗性。采用高效液相色谱(HPLC)法,对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物的分析表明,杂合木聚糖酶PATx水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物分别为木糖至木五糖、木糖至木六糖,其主要产物均为木叁糖；reAnxA水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物分别为木糖至木五糖、木糖至木六糖,其主要产物均为木叁糖；而reTfxA水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物均为木糖至木六糖,其主要产物均为木二糖。以低聚木糖为底物对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的水解模式研究表明,杂合木聚糖酶PATx为内切型木聚糖酶,其对木二糖和木叁糖没有水解活性,能够水解木四糖、木五糖和木六糖,最小水解单元为木四糖；reAnxA和reTfxA均能水解木二糖至木六糖,二者最小水解单元均为木二糖；且PATx、reAnxA和reTfxA均具有转糖苷化活性。3杂合木聚糖酶基因atxx的分子设计和表达为了提高杂合木聚糖酶PATx对纤维素类底物的结合和水解能力,将TfxA的连接序列和木聚糖结合域(XBD)融合在PATx的C-末端,获得的杂合木聚糖酶基因atxx在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物为PATxX。经0.25%甲醇诱导培养96h,基因工程菌pPATxXl发酵上清液中PATxX的木聚糖酶活性和纤维素酶活性分别为452.1 U／mg和19.3 U／mg。4杂合木聚糖酶PATxX的酶学性质PATxX木聚糖酶的最适温度和最适pH分别为60℃和pH5.0,与杂合木聚糖酶PATx相同。PATxX在70℃、pH7.0下处理2 min,残余酶活为66%；在pH4.0-9.0,25℃下处理1h,残余酶活均不低于80%。PATxX木聚糖酶与小麦木聚糖酶抑制剂作用后其残余酶活为41.0%。杂合木聚糖酶PATxX水解桦木木聚糖产物为木糖至木五糖,主要产物为木叁糖；PATxX水解小麦麸皮不溶木聚糖产物为木糖至木六糖,主要产物为木六糖,其次为木二糖和木叁糖。IPATxX为内切型木聚糖酶,对木二糖至木六糖均具有水解活性,最小水解单元为木二糖,并具有转糖苷化活性。25℃,结合3h后,PATxX和reTfxA对1%微晶纤维素的结合率分别为3.7%和7.6%,而PATx和reAnxA无结合微晶纤维素的能力。PATx、reAnxA和reTfxA均无纤维素酶活性。PATxX纤维素酶的最适温度和最适pH分别为60℃和pH6.0。SDS-PAGE结果表明，PATxX的相对分子量为33.01 kDa,与理论推算的分子量(32.15 kDa)相吻合。通过与TfxA的连接序列和木聚糖结合域融合,使PATx具备了结合水解纤维素的能力。
张慧敏[3]2013年在《计算机辅助设计提高宇佐美曲霉GHF11木聚糖酶热稳定性的研究》文中进行了进一步梳理β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一类从木聚糖主链的内部随机切割β-1,4木糖苷键的水解酶，简称木聚糖酶。近年来，随着人们对自然界半纤维素资源的开发和低聚木糖生理功能的发现，木聚糖酶获得了广泛的应用。宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) E001可产具高催化活性的中温木聚糖酶，为了进一步提高木聚糖酶的活力，并探讨其耐热机制，本论文克隆和表达了来自A. usamii E001的糖苷水解酶11家族(GHF11)木聚糖酶AusXyn11D及AusXyn11A的基因序列。并以具高比酶活的AusXyn11A为研究对象，通过分子动力学模拟的方法指导其N端替换，以改善其热稳定性，此外，还分析了杂合木聚糖酶的耐热机制及水解产物特性。以曲霉基因组中的木聚糖酶保守序列为基础，利用多种PCR技术获得A. usamiiE001木聚糖酶基因Ausxyn11D的完整cDNA和DNA序列，其GenBank登录号分别为JQ219105和HQ724287。氨基酸序列同源性分析结果表明AusXyn11D具有GHF11木聚糖酶高度保守的氨基酸片段及催化活性中心，且与A. usamii E001中两种已知的GHF11木聚糖酶的同源性分别为58%和37%。同源建模结果显示，AusXyn11D具有GHF11木聚糖酶典型的“右手”型结构，表明AusXyn11D属于GHF11木聚糖酶。依据Ausxyn11D的cDNA序列设计引物，利用RT-PCR技术克隆其成熟肽基因，同时根据GenBank中A. usamii E001GHF11木聚糖酶AusXyn11A的基因序列，扩增得到成熟肽基因Ausxyn11A，然后，成功构建毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115重组子GS115/Ausxyn11D及GS115/Ausxyn11A。经甲醇诱导表达后，重组木聚糖酶reAusXyn11D、reAusXyn11A的比酶活分别达到150.3U/mg和22,714U/mg； reAusXyn11D和reAusXyn11A的Topt分别为55℃和50℃，分别在50℃和45℃以下稳定，最适pH值均偏酸性，且pH稳定范围分别为3.5~6.5和4.0~8.0。但与reAusXyn11D相比，reAusXyn11A具有高比酶活的优点，因此具有重要的工业应用价值。此外，为了获得高产木聚糖酶的基因工程菌株，对GS115/Ausxyn11A的发酵条件进行优化，reAusXyn11A的酶活最高可达912.6U/mL，是优化前的2.14倍。对文献报道的耐热木聚糖酶EvXyn11TS基因序列进行毕赤酵母密码子优化，人工合成其优化基因Syxyn11，并在P. pastoris GS115中获得表达，重组木聚糖酶reSyXyn11的比酶活为363.2U/mg，Topt可高达85℃，并在80℃以下稳定，最适pH值为6.5，在pH4.5~9.0的范围内稳定，是目前最耐热的GHF11木聚糖酶之一。通过分子动力学模拟的方法分析AusXyn11A和EvXyn11TS的N端序列，确定用EvXyn11TS的Asn1-Arg38区域替换AusXyn11A中的Ser1-Ala33区域，以此构建杂合酶AEXynM。重组杂合木聚糖酶reAEXynM的比酶活为19,237U/mg，稍低于reAusXyn11A。reAEXynM的Topt为70℃，75℃以下稳定，较reAusXyn11A有显着性提高，其Tm值可高达91.6℃，虽略低于文献报道的EvXyn11TS的Tm值，但比reAusXyn11A提高了34.0℃，表明杂合酶的热稳定性大大提高了。采用分子动力学模拟的方法分析AEXynM与AusXyn11A中的差异氨基酸，并结合分子间作用力的分析，推测与AEXynM热稳定性相关的位点为Cys5、Pro9及His14，以此构建突变酶基因，获得重组突变酶reAEXynMC5T、reAEXynMP9S和reAEXynMH14N。叁种突变酶的热稳定性均出现一定程度的下降，其中reAEXynMC5T的热稳定性最差，证实N端二硫键(Cys5-Cys32)的添加是AEXynM热稳定性提高的主要原因之一；而reAEXynMP9S和reAEXynMH14N则表现出相对微弱的下降，结构分析表明，Pro9可提高β-转角的刚性，而His14与Phe17可形成氢键，加固了β-折迭B1与B2之间的连接，是影响AEXynM热稳定性的重要因素。以玉米芯木聚糖及桦木木聚糖为底物，研究AEXynM的水解过程及产物，研究结果显示玉米芯木聚糖的水解产物以木二糖和木叁糖为主，分别占水解产物总量的42.33%和38.76%；而桦木木聚糖的水解产物主要以木二糖为主，可占水解产物总量的58.56%；两种底物的水解液中仅有少量木糖被检出，表明其在低聚木糖制备方面具有极大的应用潜力。
何军[4]2009年在《高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶酶学性质与功效研究》文中进行了进一步梳理为获得较为优良的木聚糖酶基因工程菌株,本研究以里氏木霉木聚糖酶Ⅱ(Xyn2)的cDNA为目的基因,分别构建了大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体,并成功实现了异源表达;在此基础上,为改善重组酶热稳定性,将海栖热袍菌木聚糖酶A(Thermotoga maritima,XynA)的耐热结构域A2融合至Xyn2基因N-末端,实现了杂合基因在毕赤酵母中的分泌表达;系统研究了重组酶酶学性质,并初步评定了该酶在动物生产中的应用效果。主要研究内容及结果如下:1.里氏木霉Xyn2基因的克隆和序列分析利用RT-PCR技术成功从里氏木霉Rut C-30中扩增出Xyn2的cDNA序列,经序列分析证实,该cDNA开放阅读框全长573 bp,编码191个氨基酸;Rut C-30的Xyn2基因序列与另一诱变株VTT-D-79125完全相同;与野生型菌株QM6α相比,两个变异株Xyn2基因内部有两处碱基发生突变,分别是第13位的C变为T,第272的G变为A;这两个位点的突变导致Xyn2第15位氨基酸残基由His突变为Tyr,而91位的Gly则变为Gln;序列分析证实了这两个突变并非来自PCR扩增,而是在菌株的诱变选育过程中形成的。2.里氏木霉Xyn2基因在大肠杆菌中的表达及重组酶酶学性质分析将Xyn2基因分别克隆到E.coli高效表达载体pET28α(+)和pET30α(+)上,转化宿主菌后获得了能够诱导产生重组木聚糖酶的E.coli基因工程菌BL21-pET28α-Xyn2和BL21-pET30α-Xyn2,它们表达产生的重组酶Xyn228和Xyn230分子量分别为25kDa和27 kDa;对细胞破碎液酶活分析表明,其产量分别达到21.9 U/mL和39 U/mL;Xyn228和Xyn230最适反应温度均为50℃,最适反应pH均为5.0;与亲本酶相比,两种重组酶的热稳定性较好,在60℃下保温30 min后,Xyn228和Xyn230相对酶活分别维持在71%和65%。3.里氏木霉Xyn2基因在毕赤酵母中的分泌表达及重组酶酶学性质分析将Xyn2基因克隆到P.pastoris高效表达载体pPICZαA上,转化野生型毕赤酵母X-33后获得了一株基因工程PX-1,在甲醇诱导下,其表达产物PTX2能够有效分泌至培养基中,并且杂蛋白分泌量极少;重组酶PTX2分子量约为21 kDa,与亲本酶一致,在普通摇瓶中诱导,其产酶水平达到了近300 U/mL;PTX2最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0;该酶在50℃下相当稳定,在此温度下保温30 min后,其相对酶活可维持在90%以上;而在60℃下保温30 min后,PTX2相对酶活仅维持在30%左右;PTX2对燕麦木聚糖的亲和力强于桦木木聚糖,其K_m值分别0.9 mg/mL和1.2mg/mL;与亲本酶一样,PTX2不能与纤维素有效结合,但能与木聚糖结合;PTX2为内切型木聚糖酶,当以燕麦木聚糖为底物时,其水解产物主要为木二糖及木二糖以上的木寡糖,另有少量木糖。4.耐热木聚糖酶基因Xyn2-A2的构建及其在毕赤酵母中的表达通过基因全序列合成,将海栖热袍菌XynA的耐热结构域A2融合至Xyn2基因N-末端,成功构建了耐热木聚糖酶基因及其毕赤酵母表达载体pPICZαA-Xyn2-A2,转化毕赤酵母后获得了能够分泌表达耐热木聚糖酶的基因工程菌PXC-1;其重组酶PTXC2分子量大小为27 kDa,在普通摇瓶中进行诱导获得了约90 U/mL的表达水平:PTXC2最适反应温度为65℃,最适反应pH为6.0;该酶耐热性较PTX2有明显改善,在60℃下保温30 min后,PTXC2残余酶活高达74%;与PTX2和亲本酶相似,PTXC2对纤维素几乎没有结合能力,但PTXC2对木聚糖的结合力强于PTX2。5.重组木聚糖酶小规模发酵制备及其应用效果评定利用15 L自动发酵系统对毕赤酵母基因工程菌PX-1进行小规模诱导培养,重组酶PTX2产量提高了近一倍,最高达到了560 U/mL,且纯度较高;在仔猪饲粮中添加液体重组酶PTX2(500 U/kg),仔猪平均日增重提高了16.9%;饲粮粗蛋白、灰分、钙和粗纤维的表观消化率分别提高了1.7%、3.4%、2.5%和2.6%,该结果表明,重组酶PTX2能够部分消除饲粮中木聚糖的抗营养作用,改善动物生产性能。综上所述,本研究构建了木聚糖酶E.coli基因工程菌,其重组酶活性较强,但表达水平偏低;利用毕赤酵母表达系统成功构建了可实现高效分泌表达的基因工程菌PX-1,其产酶量远高于原核表达系统,且重组酶纯度较高,热稳定性较亲本酶也有一定改善;经动物试验初步评定证实,该重组酶具有较好的应用效果;通过对木聚糖酶基因(Xyn2)结构的改造(耐热域融合)可显着改善重组酶热稳定性,但其表达水平偏低。因此如何兼顾重组酶产量与热稳定性是今后仍需要进一步解决的问题。
何瑶[5]2016年在《通过N-端置换及定点突变提高木聚糖酶AoXyn11A耐热性的研究》文中研究表明近年来,随着人们对自然界半纤维素资源的开发利用,木聚糖酶作为一种绿色高效环保的生物催化剂,已被广泛应用于饲料、食品、造纸、医药、纺织及能源等诸多工业领域。它主要作用于木聚糖主链,随机切割木聚糖内部的β-1,4糖苷键,水解产生不同聚合度的木寡糖和少量木糖。虽然国内外已有大量木聚糖酶被克隆表达,但多数为中温木聚糖酶,对于工业化应用的高温环境来说,木聚糖酶的使用受到了很大的限制。因此中温木聚糖酶的耐热性改造具有重要意义。本实验室前期已克隆并表达了一种源于米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶(GH)11家族中温木聚糖酶AoXyn11A,此酶活性高、pH范围广且金属离子耐受性好,但耐热性差。本课题以AoXyn11A为研究对象,通过N-端置换和定点突变方法,以改善其耐热性并探讨木聚糖酶耐热机理。根据AoXyn11A和一个源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同家族耐热木聚糖酶pXYL11的序列比对及分子动力学模拟B-factor值的计算结果,确定用pXYL11 N-端区域的氨基酸片段(A1~T42)置换AoXyn11A相对应的片段(S1~V41),采用大引物PCR技术扩增杂合酶ATX11A基因(ATx11A),并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达,结果表明,杂合木聚糖酶ATX11A的最适反应温度(Topt)为65℃,较原酶(AoXyn11A)提高15℃,在60℃下,ATX11A的半衰期t1/260为55 min,较AoXyn11A(t1/260=1.3 min)延长了41.3倍。根据AoXyn11A与其他5种11家族耐热木聚糖酶(包括pXYL11)的多序列比对结果,进一步将ATX11A“cord”结构区域内的氨基酸96NPGSG100突变为RPT,构建突变酶ATX11AM基因(ATx11AM),并在P.pastoris GS115中表达。结果表明,ATX11AM的Topt与ATX11A的相同,但ATX11AM的t1/260由ATX11A的55 min提高到了83 min。ATX11AM的t1/265为31 min,是ATX11A(t1/265=17 min)的1.8倍。另外,测得ATX11A和ATX11AM的熔解温度(Tm)分别为72.7和77.9℃,分别较AoXyn11A(Tm=60.2℃)提高了12.5和17.7℃。根据对一级和叁维结构的分析,发现在ATX11A的N-端引入了两个盐桥(H10-D11和D11-K49)和两个N-糖基化位点(N5-E-T7和N34-Y-S36)。为了探讨木聚糖酶ATX11A的耐热机理,首先,利用定点突变法,将D11突变成原酶AoXyn11A中的N,以同时去除两个盐桥,构建突变酶基因ATx11AD11N,并在P.pastoris GS115中表达,结果显示,ATX11AD11N的Topt由突变前的65℃降为60℃,在55和60℃下分别保温60 min后,ATX11A残余酶活性分别为初始酶活性的79.4%和49.9%,而ATX11AD11N的仅为42.3%和17.8%。说明引入的N-端盐桥是影响ATX11A耐热性的原因之一。然后,利用定点突变法,将N5和N34均突变成原酶AoXyn11A中的S,以去除两个N-糖基化位点,构建突变酶基因ATx11AS,并在P.pastoris GS115中表达,结果显示,ATX11AS的Topt并没有下降,仍为65℃;与突变前相比,在55和60℃下分别保温60 min后,ATX11AS的残留酶活性变化均不明显,说明N-糖基化对ATX11A耐热性影响不大。
汪俊卿[6]2014年在《宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表达及耐热性的改造研究》文中进行了进一步梳理随着人们对自然界中生物质资源和农业副产品开发利用的重视和低聚木糖生理功能研究的深入，作为生物质资源降解酶系主要成员的木聚糖酶也成为近几年研究的热点。β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)能够作用于木聚糖主链内部，通过随机切割的方式将木聚糖降解为低聚木糖和少量木糖。作为一种绿色高效的生物催化剂，木聚糖酶已被广泛应用在饲料、造纸、医药、能源及食品等工业领域中。虽然目前国内外已有大量木聚糖酶已被克隆和表达，但多数酶常常难以满足工业应用中经常遇到或需要的高温环境，因而限制了该酶的应用范围。论文克隆了宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) E001GH10家族木聚糖酶AusXyn10A的完整cDNA和DNA序列，将该酶成熟肽的编码基因实现了在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115和大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中的异源表达，并在此基础上利用计算机辅助设计通过N/C端片段替换、二硫键添加以及点突变对该酶的热稳定性进行了理性/半理性改造研究，主要研究结果如下：(1)构建了一种发卡结构介导的PCR (HSO-PCR)技术，结合3′-RACE和5′-RACE方法获得了AusXyn10A基因完整的cDNA和DNA序列；cDNA序列长度为1,235bp，包括80bp的5′-端非翻译区、984bp的开放读码框和171bp的3′-端非翻译区，可编码327个氨基酸；其DNA长度为2,255bp，包含9个长度为52-62bp的内含子；生物信息学分析的结果表明AusXyn10A包括19个氨基酸残基的信号肽、6个氨基酸残基的前导肽和302个氨基酸残基的成熟肽。(2)构建了一种蛋白天然N端表达质粒pPIC9KM，并应用该质粒将AusXyn10A成熟肽的编码基因整合到P. pastoris GS115基因组中，获得的高拷贝重组子GSX10A4-14产酶活性高达100.8U mL-1；经优化后GSX10A4-14在接种量8%、初始pH值7.0、甲醇诱导量2.5%、温度30℃及诱导时间120h的表达条件下产酶水平可达368.6U mL-1，是优化前酶活性的3.25倍；结果表明，reAusXyn10A的最适反应pH和温度分别为5.5和50℃、在45℃以下及pH值4.5~8.5之间具有较好的稳定性；除Mn2+离子外，其它所测的金属离子及EDTA对该酶的酶活性没有明显的影响；以桦木木聚糖为底物，reAusXyn10A的Km和Kcat值分别为2.25mg mL-1和3,419.4s-1；以玉米芯木聚糖为底物，优化后的水解条件为：底物浓度50g L-1，酶添加量300U g-1，反应时间10.0h后体系中的还原糖量可达15.45g L-1，TLC分析显示其水解产物以木叁糖为主，表明该酶具有制备低聚木糖的应用潜力。(3)根据海栖热袍菌(Thermotoga maritima) MSB8中的嗜热木聚糖酶TmxB和AusXyn10A的序列比对结果，将AusXyn10A C端的A300NA302替换为TmxB中的KEVLEKKIEER，利用大引物PCR技术构建出AusxynCRC1并在P. pastoris中表达；结果表明，reAusXynCRC1的最适温度为50℃，与原酶reAusXyn10A一致，但该酶在50℃下的半衰期仅为5min，较原酶的40min有明显的降低；根据叁维结构比对结果，在AusXynCRC1的基础上引入突变H13L和A12K，构建AusXynCRC2并在P. pastoris中表达；结果表明，突变酶reAusXynCRC2在50℃的半衰期由reAusXynCRC1的5min提高到8min，在50℃下保温10min后残余相对酶活由0%提高到40%；此外，reAusXynCRC2的比酶活较原酶提高38%。(4)根据分子动力学模拟和B因子(B-factor)值计算，确定用嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)中嗜热木聚糖酶TaXyn10N端区域的氨基酸片段YTLTKDSKTP替换AusXyn10A相对应的片段N24RLTTGKNA32，构建N端片段替换酶AusXynCRN1基因并在P. pastoris中表达；结果表明reAusXynCRN1的最适温度与原酶reAusXyn10A一致，在55℃下半衰期由6.9min提高到了8.0min；根据叁维结构比对分析结果，在AusXynCRN1中同时引入突变S286G和H288F，构建突变酶AusXynCRN2并在P. pastoris中表达；结果表明，reAusXynCRN2的最适温度为60℃，较原酶提高了10℃，在55℃的半衰期由6.9min提高到了72min，是原酶的10.4倍，此外reAusXynCRN2的比酶活为8,129U mg-1，较原酶reAusXyn10A提高49%，该结果也表明基于分子动力学模拟的热稳定性预测具有一定的可行性。(5)根据Disulfide by Design V1.20软件和分子动力学模拟预测结果，筛选出RMSD值低于原酶AusXyn10A的二硫键突变酶D7C/G42C和S246C/A297C并分别在P. pastoris中表达；结果表明，reS246C/A297C的最适温度为55℃，较原酶提高了5℃，且在50℃保温60min残余酶活大于80%，较原酶（残余酶活39%）有明显提高，表明246-297位二硫键的添加能够大幅提高酶的热稳定性；reD7C/G42C的最适温度和热稳定性较原酶则有一定程度的下降。(6)通过表达质粒pET-28a实现AusXyn10A在E. coli BL21中的表达，并使用PCR仪和酶标仪对其酶学性质进行分析，结果表明，经E. coli BL21表达的AusXyn10A的最适反应温度为44℃，最适pH值为5.5，在pH6.6~7.8的范围内稳定，为后续的高通量筛选打下基础；根据B-factor值计算结合多序列比对分析，选择R59、S278和S280叁个位点实施饱和突变或定点突变；经转化、高通量筛选及热稳定性分析，获得S280V、S278A、N111S和R59C/A35G四株热稳定性提高突变子；它们的最适温度较原酶AusXyn10A (44℃)均提高了约2.0℃，T5020值较AusXyn10A分别提高了2.0℃、2.0℃、0.8℃和0.7℃；根据论文中所有突变子的分析结果，将N端片段替换(含突变S286G/H288F)及D7C/G42C二硫键突变进行组合，获得的突变酶reXynCRN2-S246C/A297C的t1/260值为19min，是reAusXynCRN2t1/260值的1.6倍，表明该突变酶热稳定性较reAusXynCRN2有了进一步的提升。
徐馨[7]2016年在《解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A基因在毕赤酵母中的分泌表达及其定向进化研究》文中认为β-1,4-内切木聚糖酶(以下称木聚糖酶)是木聚糖最关键的水解酶之一,可广泛应用于食品、饲料和造纸等领域。多数常规的野生型或重组木聚糖酶的催化活性较低、稳定性较差,难以满足在不同应用领域的需要。本研究克隆到解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A基因(baxA),并在Escherichia coli BL21(DE3)和Pichia pastoris GS115中获得分泌表达;采用定向进化技术(易错PCR和DNA改组)对该酶进行改造,以期获得具备较理想酶学性质的突变体;同时揭示与解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A催化活性、热稳定性相关的部分关键氨基酸位点或区域。主要结果如下:1.克隆得到baxA基因并成功构建获得分泌表达的大肠杆菌工程菌pCbaxA15。以实验室前期分离的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为出发菌,设计特异性引物克隆到baxA基因(GenBank登录号:KM 624029),该基因的开放阅读框(ORF)为642 bp,编码213个氨基酸残基,含6个潜在糖基化位点,理论分子量为23.3 kDa。baxA定向插入到新型表达载体pCold TF中,并转化E.coli BL21(DE3),在15°C下诱导表达,重组酶(reBax A)能够分泌到培养基中;采用高亲和Ni-树脂层析纯化reBax A,纯化后的reBax A比活为2.63 U/mg;纯化SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,该重组酶的分子量约为77.3 kDa。酶学性质研究结果表明,reBaxA的最适温度和最适pH分别为55°C,pH 6.0;Km、Vmax分别为16.05 mg/m L、45.66μmol/min/mL。reBax A分别水解燕麦、山毛榉、桦木木聚糖,水解产物为木二糖至木五糖(X2-X5),主要产物分别为木四糖(X4)、木叁糖(X3)、木五糖(X5)。baxA基因定向插入pET30a(+),转化E.coli BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western Blot和活性测定分析结果表明,baxA获得了重组表达,特异性条带明显,但表达产物无木聚糖酶活性,推测重组蛋白主要以包涵体形式存在。2.成功构建获得分泌表达的毕赤酵母工程菌PPbax A10。baxA基因定向插入穿梭载体pPICZαA,重组质粒pPICZαA-baxA线性化后电击转化P.pastoris GS115感受态细胞,经过Zeocin抗性、PCR鉴定和活性检测,获得酵母工程菌PPbax A10,其接种于50 m L YPD培养基中,从第24 h开始添加甲醇诱导,第120 h时,该工程菌发酵上清木聚糖酶比活为8.18 U/mg,Km,Vmax分别为5.41mg/m L,22.42μmol/min/mL。在50°C,pH 5.0时,rePPBax A10表现出最高的活性。3.采用易错PCR技术构建突变文库,筛选得到酶活提高的突变体pCbaxA50。在baxA基因PCR扩增体系中,提高Mg2+和dTTP,dCTP的浓度,并额外添加Mn2+,该引物中限制性内切酶识别位点外侧均引入3个保护性碱基,故PCR产物的胶回收产物直接用于双酶切,并定向插入表达载体pCold TF中,转化E.coli BL21(DE3),构建表达文库,共获得1463个单菌落,采用96孔板法快速筛选突变文库,其中pCbaxA50分泌的胞外重组酶活性较高,测序结果表明,存在一个氨基酸残基突变,S138T;重组酶reBaxA50的比活为9.38 U/mg,其最适温度和最适pH分别为50°C,pH 5.0。突变酶在60°C时的半衰期为9.74min,TGA-DSC分析结果表明突变酶和其亲本的Tm值分别为89.15°C和88.95°C。4.结合褐色高温单孢菌木聚糖酶基因,采用DNA改组技术对解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A进行改良。根据载体序列设计一对通用引物,克隆得到褐色高温单孢菌木聚糖酶基因的催化域序列(tfxCD)与baxA基因的成熟肽编码序列(mbaxA),二者混匀后经DNaseⅠ随机片段化,割胶回收分子量小于100 bp的DNA片段并进行无引物PCR,在此基础上进行有引物PCR,所得产物双酶切后定向插入表达载体pCold TF,转化E.coli BL21(DE3),构建突变文库,共得到2250个单菌落。采用96孔板高通量筛选得到酶活提高的突变体pCbaxA153,pCbaxA241,pCbaxA428,还选取了酶活下降的突变体pCbaxA199。4个突变酶,reBaxA153,reBaxA199,reBax A241,reBaxA428中分别产生了N29S,T33I,S31R,I51V的氨基酸突变,比活分别为11.95,2.17,11.45,10.26 U/mg。其中,reBaxA199在碱性条件最稳定,reBaxA241对热最稳定,reBaxA428对酸最稳定。突变酶reBax A153和reBaxA428对不同木聚糖水解模式相似,水解山毛榉木聚糖最彻底,而reBaxA241对叁种木聚糖都有良好的水解效果。突变酶在酶活,酶学性质及水解性能方面的差异可能主要是由氨基酸突变造成的。
吴芹[8]2017年在《木聚糖酶温度特性的改善及其在总皂苷提取中的应用》文中进行了进一步梳理木聚糖酶(xylanases,EC 3.2.1.8)是内切β-1,4-D-木聚糖酶的简称,能够水解木聚糖分子主链内部的β-1,4-D-木糖苷键,广泛应用于纺织、食品、造纸、饲料工业以及功能性低聚木糖和燃料乙醇的生产等领域。由于木聚糖酶在应用过程中经常遇到高温环境,具有高热稳定性的木聚糖酶具有更大的应用潜力和发展前景。作者所在实验室前期从米曲霉(Aspergillus oryzae)基因组中克隆了一种糖苷水解酶(GH)11家族木聚糖酶基因Aoxyn11A,并成功将其在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行了表达。除温度特性较差外,木聚糖酶Ao Xyn11A具有较高的催化活性和优良的酶学特性。本论文以Ao Xyn11A为研究对象,通过迭代突变技术对编码该酶的基因Aoxyn11A进行改造,以期获得温度特性改善的突变酶;然后将具有较高热稳定性的突变酶应用到合欢皮总皂苷的提取工艺中,建立最优工艺条件,提高总皂苷收率。基于Ao Xyn11A叁维结构的同源建模、分子动力学模拟及其与7种同一家族耐热木聚糖酶的多序列比对,对具有较高B-factor值且序列上不保守的两个氨基酸Gly~(21)和Ile~(127)实施迭代饱和突变。以重组表达质粒p ET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒PCR技术对Aoxyn11A中编码Gly~(21)的密码子实施饱和突变,将连有突变酶基因的质粒p ET-28a-Aoxyn11A~(G21X)转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建了突变文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11A~(G21I))。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11A~(G21I)表达一种由Ile替换了Gly~(21)的突变酶Ao Xyn11A~(G21I)。然后对Ao Xyn11A~(G21I)中编码Ile~(127)的密码子实施饱和突变,构建突变文库并筛选,结果显示,获得的所有突变酶Ao Xyn11A~(G21I-I127X)的温度特性较Ao Xyn11A和Ao Xyn11A~(G21I)均有所降低,说明Ile~(127)突变对Ao Xyn11A的热稳定性起到了负效果。基于Ao Xyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其叁维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了突变酶Ao Xyn11A~(Y13F)和Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)。采用全质粒PCR技术分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A~(G21I)中编码Tyr~(13)的密码子TAC突变为Phe的TTC,获得了突变酶基因Aoxyn11A~(Y13F)和Aoxyn11A~(G21I-Y13F)。分别将基因Aoxyn11A~(G21I)、Aoxyn11A~(Y13F)和Aoxyn11A~(G21I-Y13F)在P.pastoris GS115中实施了表达,并对重组表达产物Ao Xyn11A~(G21I)、Ao Xyn11A~(Y13F)和Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)的酶学性质进行了分析。Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)的最适温度(T_(opt))为60℃,较Ao Xyn11A~(G21I)和Ao Xyn11A~(Y13F)均提高了5℃,较Ao Xyn11A提高了10℃;另外,Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)在50℃下的半衰期(t~(50)_(1/2))约为240 min,分别是Ao Xyn11A、Ao Xyn11A~(G21I)和Ao Xyn11A~(Y13F)的40、3.4和2.5倍;Ao Xyn11A、Ao Xyn11A~(G21I)、Ao Xyn11A~(Y13F)和Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)的熔解温度(T_m值)分别为52.3、56.5、58.6和61.3℃。以上结果表明突变点Gly~(21)Ile和Tyr~(13)Phe对Ao Xyn11A温度特性的提高具有协同作用。另外,Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)的催化效率(k_(cat)/K_m)为473.1 m L·mg~(-1)·s~(-1),较Ao Xyn11A的提高了1.65倍。将突变酶Ao Xyn11A~(G21I-Y13F)应用到合欢皮总皂苷的提取工艺,以总皂苷收率为考核指标,确定了最佳工艺条件:酶解温度45℃、酶用量150 U·g~(-1)、酶解时间8 h、固液比1:25(g:m L)。在此工艺条件下,木聚糖酶解辅助乙醇回流法提取获得的总皂苷收率较木聚糖酶解法和乙醇回流法所获得的分别提高了17.55%和14.66%。
李同彪[9]2016年在《黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶XynZF-2热稳定性分子改造》文中认为背景木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一种可以降解木聚糖的多功能水解酶,广泛应用于食品加工、纸浆漂白、饲料加工等多个领域。在工业应用中,一般木聚糖酶需要在高温下使用,而大多数属于嗜温性木聚糖酶,高温易失活,热稳定性差,使木聚糖酶工业应用受到限制。因此,木聚糖酶的热稳定性分子改造已经十分的必要。目的定向改造黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶基因,期望提高木聚糖酶的热稳定性。方法1木聚糖酶基因生物信息学分析利用DNAMAN 6.0、Blast对木聚糖酶基因xynZF-2同源序列比对分析,并利用The Prot Param、The Phyre2、DS Viewer Pro6.0、Di ANNA 1.1 Web Server、Prosite、Prot Scale等软件对木聚糖酶的理化性质、叁维结构及各个氨基酸的作用进行分析,从而确定影响木聚糖酶耐热性的突变位点。2突变基因克隆及突变载体构建采用重迭延伸PCR法克隆突变基因。双酶切突变基因及pET-28a,构建突变酶表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),Kan抗性筛选,获得突变酶工程菌。3突变木聚糖酶诱导表达及纯化突变工程菌经IPTG诱导表达得到粗酶液,采用镍金属螯合亲和层析柱对突变酶进行分离纯化。4突变酶酶学性质分析测定突变木聚糖酶的最适温度、热稳定性、最适pH及pH稳定性,探究以上因素对木聚糖酶酶活力的影响。结果1成功预测出木聚糖酶XynZF-2的活性中心位点,进行E103D和E194D突变,得到突变基因xynED;进行V1C、E27C突变,在XynZF-2 N-端引入C1-C27二硫键,得到突变基因xynDC;在α-螺旋及Cord区域引入疏水性氨基酸(V125A、K178M和G180A),得到突变基因xynMA;将木聚糖酶XynZF-2的N-端被替换成耐热性木聚糖酶Ev Xyn11 N-端的相应序列,并在其中引入芳香族氨基(P9Y、H14F),构建杂合酶突变基因xynEV-34;分别构建突变酶表达载体。2构建突变木聚糖酶工程菌,BL21/pET-28a-xynED、BL21/pET-28a-xynDC、BL21/pET-28a-xynMA和BL21/pET-28a-xynEV-34,经IPTG诱导、蛋白电泳分析,证实突变木聚糖酶基因成功在大肠杆菌中表达。3活性中心突变酶XynED酶活力为原酶XynZF-2的0.17%。4利用镍柱亲和层析法纯化突变酶,获得电泳纯级突变木聚糖酶。5最适温度及pH:二硫键突变酶XynDC最适温度和pH分别为45℃和5.0;疏水性氨基酸突变酶XynMA最适温度和pH分别为48℃和5.0;杂合突变酶XynEV-34最适温度和pH分别为48℃和4.8。6热稳定性及pH稳定性:在40℃条件下保温1 h,原酶XynZF-2、突变酶XynDC、突变酶XynMA和突变酶XynEV-34残余相对酶活力分别为44.36%、66.77%、74.71%和77.96%;相比原酶XynZF-2,突变酶XynDC、突变酶XynMA、突变酶XynEV-34的半衰期t1/245℃分别提高了7 min、12 min和16 min。各突变酶pH稳定性与原酶XynZF-2基本一致。结论1成功预测并证实了木聚糖酶XynZF-2的催化活性中心位点为Glu103和Glu194。2突变酶基因xynED、xynDC、xynMA和xynEV-34均能在E.coli BL21(DE3)中异源表达。3二硫键、疏水性氨基酸及芳香族氨基酸的引入、N-端替换等均能够明显改善木聚糖酶XynZF-2的耐热性。
宋东蓥[10]2010年在《木聚糖酶基因工程菌G81的构建及酶学性质研究》文中研究说明木聚糖是半纤维素的主要组份,其主链由β-D-木糖单元通过β-1,4糖苷键连接而成。木聚糖带有不同类型的取代基,例如,阿拉伯糖、葡聚糖等,完全降解木聚糖需要多种水解酶共同参与。木聚糖酶是可降解木聚糖的酶系,其中,β-D-1,4内切木聚糖酶及β-D-木糖苷酶是最为重要的酶系成员。近十年来,木聚糖酶在饲料、食品、造纸等工业领域中显示了广阔的应用前景,现已成为国内外酶工程研究的热点。目前,研究者从不同微生物中克隆出多种木聚糖酶基因,并选择合适的宿主进行了表达。本研究以黑曲霉C71(A.niger C71)为出发菌株,克隆了β-D-1,4内切木聚糖酶,即xynB,并在大肠杆菌中得到表达,构建了木聚糖酶基因工程菌G81,通过旋转正交实验,探讨了发酵条件对G81产酶的影响,并对重组酶酶学性质进行了研究。主要研究成果如下:参考GenBank报道的黑曲霉xynB基因序列,设计了两条特异性引物,从A.niger C71中克隆了xynB基因。DNA序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为678 bp,可编码225个氨基酸,理论分子量为24.127 kDa,等电点为5.23。同源性分析显示,编码的225个氨基酸序列与来源于宁佐美曲霉(A.usamii)xyn的氨基酸序列同源性高达97%,与来源于玉米圆斑病菌(C.carbonum)xyn的氨基酸序列同源性为60%。利用SWISS-MODEL和ESyPred3D Web Server 1.0对xynB氨基酸序列进行了序列分析及同源建模,目的蛋白与模板的叁维结构模型比较发现,两个模型具有数目相同的二级结构:15个β折叠股和1个α螺旋,且空间结构相互对应。其中,前者的β折叠(由Thr168-Arg176组成)比后者的β折叠(由Phe133-Ser138组成)多3个氨基酸。选用pET32a(+)作为表达载体,设计限制性酶切位点Kpn I和EcoR I;将xynB基因克隆至pET32a(+)上,经筛选获得阳性重组子pET-XYNB;将阳性重组子转化至E.coli BL 21中,即基因工程菌G81。摇瓶发酵液具有较高的木聚糖酶活力,经SDS-PAGE电泳分析,蛋白图谱显示1条大约为30 kDa的特异性条带。选用发酵温度、发酵时间和诱导物浓度叁个因素设计了正交旋转组合试验,构建发酵条件对G81产木聚糖酶影响的数学模型:Y=234.38+113.70X_1+24.76X_2+0.01X_3 +30.55X_1X_2-2.52X_1X_3-2.99X_2X_3+49.34X_1~2-42.02X_2~2-42.85X_3~2。结果显示,G81摇瓶发酵的最佳条件组合为:发酵温度28.6℃,诱导物浓度0.8 mmol/L,培养时间15 h,其中发酵温度对G81产酶影响最为显着,为主效因子。10 L发酵罐中进行G81扩大培养,结果表明,G81在10 L发酵罐中最佳发酵时间为8 h:添加诱导物IPTG后6 h内,木聚糖酶活力上升缓慢,从6 h开始,酶活力上升迅速,到8 h达到86100.21 U,之后酶活力下降,12 h后酶活力降到最低。酶学性质研究表明,G81木聚糖酶于40℃条件下较稳定,40℃保温1 h后,酶活为原活力的98.62 %;50℃保温1 h后,酶活力急剧下降,为原活力的21.28 %。G81木聚糖酶对pH不敏感,最适pH为6.0,酸稳定性较强。Mg~(2+)和Fe~(2+)对G81木聚糖酶具有激活作用,Cu~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)和Zn~(2+)对其具有抑制作用。
参考文献：
[1]. 耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究[D]. 孙建义. 浙江大学. 2003
[2]. 提高木聚糖酶热稳定性、催化活性和结合水解纤维素能力的研究[D]. 刘明启. 浙江大学. 2007
[3]. 计算机辅助设计提高宇佐美曲霉GHF11木聚糖酶热稳定性的研究[D]. 张慧敏. 江南大学. 2013
[4]. 高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶酶学性质与功效研究[D]. 何军. 四川农业大学. 2009
[5]. 通过N-端置换及定点突变提高木聚糖酶AoXyn11A耐热性的研究[D]. 何瑶. 江南大学. 2016
[6]. 宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表达及耐热性的改造研究[D]. 汪俊卿. 江南大学. 2014
[7]. 解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A基因在毕赤酵母中的分泌表达及其定向进化研究[D]. 徐馨. 中国计量大学. 2016
[8]. 木聚糖酶温度特性的改善及其在总皂苷提取中的应用[D]. 吴芹. 江南大学. 2017
[9]. 黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶XynZF-2热稳定性分子改造[D]. 李同彪. 新乡医学院. 2016
[10]. 木聚糖酶基因工程菌G81的构建及酶学性质研究[D]. 宋东蓥. 河南师范大学. 2010