束刚[1]2003年在《绍兴鸭卵巢卵泡发育相关新基因的分离、克隆与鉴定》文中进行了进一步梳理本研究采用银染mRNA差异显示方法克隆绍兴鸭卵巢等级卵泡发育相关新基因。并用5′ RACE和相对定量RT-PCR方法进一步研究这些表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)的延长序列及其表达的时空特异性变化模式来探讨这些新基因的可能生物学功能。 一、绍兴鸭卵巢卵泡基因的差异表达 用银染mRNA差异显示方法比较产蛋高峰期绍兴鸭卵巢F1，F3，F5等级卵泡基因的差异表达共得到3个差异表达片段。经相对定量RT-PCR验证假阳性，发现3个差异表达片段中有一长271bp的表达序列标签(EST_SXDF0201)在F5卵泡最高(p＜0.01)，而在F1卵泡显着下调。BLAST检索结果表明该表达序列标签属于新EST，现已登录GenBank(GenBank Account：CB072629)。另一表达序列标签(EST_SXDF0202)在Fw卵泡的表达水平显着高于F1，F3，F5等级卵泡(p＜0.05)。 二、表达序列标签(EST)5′ RACE的延伸 用5′末端快速扩增法(RACE)延伸EST_SXDF0201，拼接后总长544bp。拼接后序列经BLAST检索，进一步证明EST_SXDF0201是在绍兴鸭卵巢卵泡首次发现的新表达序列标签。 叁、表达序列标签的时空特异性表达模式 1、表达序列标签(EST_SXDF0201，2)在不同卵泡细胞中的表达 本实验根据表达序列标签的测序结果设计引物用相对定量RT-PCR进一步研究在绍鸭卵巢不同等级卵泡颗粒层和膜层中的表达。结果表明，EST_SXDF0201在颗粒层中的表达整体高于膜层，但大小卵泡之间差异不显着；颗粒层中EST_SXDF0202的表达随卵泡等级的升高，表达水平也极显着升高(p＜0.01)，在排卵前卵泡降至最低(p＜0.01)，膜层中以Fw卵泡表达水平最高(p＜0.01)。 2、表达序列标签(EST_SXDF0201，2)在不同组织中的表达 本实验以beta-actin为内标，用RT-PCR定性地研究表达序列标签在产蛋高峰期绍兴鸭的下丘脑、垂体、肌肉、肝脏、脂肪等组织的特异性表达。结果发现两种表达序列标签在以上组织中都有不同程度的表达，表明这些EST并非卵巢组织特异性表达，束刚绍兴鸭卵巢卵泡发育相关新基因的分离、克隆与鉴定而是广泛存在于多种组织中;同时，SXDF0201在各种组织中存在明显的表达量的差异，以肌肉和脂肪组织较低，而在下丘脑和垂体表达相对较高。3、表达序列标签(EsT--SxDFO加1，，2)在卵巢不同发育阶段的表达 用相对定量Rl’- PCR检测两种表达序列标签在绍兴鸭30、60、90日龄卵巢中表达，结果显示:EsTeesxDF0201在30日龄的表达水平显着高于60(p<0 .05)和90(P=0.015)日龄;而EST--sxDF兜02在卵巢发育的不同阶段的表达水平没有变化.
束刚, 陈杰, 倪迎冬, 周玉传, 赵茹茜[2]2004年在《绍鸭卵巢卵泡发育相关新EST的分离与表达》文中提出采用银染mRNA差异显示方法从绍鸭卵巢等级卵泡中分离并筛选到 3个差异表达序列标签 (ExpressedSequenceTags ,ESTs)SXDF0 2 0 1(2 71bp)、SXDF0 2 0 2 (2 0 0bp)和SXDF0 2 0 3(173bp) ,通过测序和BLAST检索 ,发现SXDF0 2 0 1与GenBank中登录的所有物种的所有序列均无同源性 ,是在绍鸭卵巢卵泡发现的新EST ,现已登录GenBank(GenBank登录号 :CB0 72 6 2 9) ,而SXDF0 2 0 2和SXDF0 2 0 3则分别与GenBank公布的鸡的EST和肌胃肌球蛋白重链高度同源。用 5′ RACE将SXDF0 2 0 1延伸至 5 4 4bp ,经过BLAST再次检索 ,仍然未发现中度同源序列采用相对定量RT PCR方法进一步研究SXDF0 2 0 1和SXDF0 2 0 2在绍鸭组织中的时空特异性表达 ,发现这两个EST在产蛋高峰期绍兴鸭的下丘脑、垂体、肌肉、肝脏、脂肪等组织都有表达 ;SXDF0 2 0 1在 30日龄卵巢的表达水平显着高于 6 0 (P <0 0 5 )和 90 (P =0 0 15 )日龄 ;而SXDF0 2 0 2在卵巢发育的不同阶段的表达水平没有变化 ;SXDF0 2 0 1在卵巢卵泡颗粒层中的表达总体高于膜层 ,SXDF0 2 0 2在颗粒层中的表达F3 >F5>Fw(P <0 0 1) ,而在F1卵泡降至最低 (P <0 0 1) ,膜层中以Fw 卵泡表达水平最高 (P <0 0 1)。
卢立志[3]2011年在《鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析》文中认为禽类的产蛋率,除了其他方面外,取决于等级前卵泡能被有效地募集进入等级卵泡,即通过卵泡的生长和闭锁建立卵泡等级。随着日龄的老化产蛋率的下降归因于卵泡闭锁的增加以及可供选择进入最后生长阶段(最大等级卵泡／排卵前卵泡)的小/生长卵泡数量减少。对人和哺乳动物巢卵泡发育研究表明,卵泡的生长和分化是多因素调控的复杂的生理生化过程,不仅受生殖轴内分泌激素的调控,而且卵巢中许多局部的生长、分化因子也以自分泌或旁分泌等形式发挥重要作用。目前,对于禽类卵泡发育的研究,虽然已经知道一些基因在不同发育阶段的卵泡中差异表达,但是对于复杂生命体而言,仅仅是其中很小部分,仍然没有合理假说来说明禽类卵泡等级的建立机制。通过筛选鸭卵泡差异表达的基因,比较不同发育阶段卵泡的差异表达基因,可以对这些差异基因在卵泡发育和分化过程中所发挥的作用有更深入的了解。揭示卵泡在不同生理状况下差异基因的表达情况,为进一步研究禽类性成熟、产蛋的启动、产蛋的维持和高产性能的分子生物学机制提供重要资料,并为最终揭示禽类卵泡发育和等级建立的分子机制,从而在基因水平上进行遗传操作,延长产蛋高峰期,提高鸭的产蛋率提供理论依据。本实验以产蛋高峰期绍兴鸭母鸭不同阶段的卵泡为实验材料,采用DSN酶介导的均一化消减杂交方法构建鸭卵泡差异表达基因的消减cDNA文库,以期找到与鸭卵泡发育相关的基因,探索卵泡等级建立与分化的基因表达调控的分子机制。本实验构建了两个鸭卵泡差异表达基因的双向消减文库：以最大等级卵泡和等级前卵泡这两个不同发育阶段的卵泡为实验材料进行消减杂交。其中,以最大等级卵泡为Tester,等级前卵泡为Driver,建立的为正向消减文库；以等级前卵泡为Tester最大等级卵泡为Driver建立的为反向消减文库。实验过程中,总RNA与反转录成的cDNA质量较好,消减产物得到很好的富集。正向消减文库中获得了88条独立的差异表达的基因,BLAST比对结果显示,其中60条具有同源基因,28条相似度极低或无同源性的基因。筛选出与卵泡发育相关基因LHR和EGFR,与细胞增殖和分化有关的基因SLC家族等,影响胚胎发育的NADH1α脱氢酶同源基因NADH1β几个编码激酶或其同源基因如PRKG2、 AKAP2、similar to protein kinase D1。此外,筛选到我们还分离了一些未知功能的基因。反向消减文库中获得了72条独立的差异表达的基因,BLAST比对结果显示,其中51条具有同源基因,21条无相似或者同源性极低的基因。筛选出的基因有RBMII,拼接因子SF2亚单位p32和U2AF35kDa subunit-like, tensin基因,真核生物翻译起始基因EIF3I,微管组分基因α-tubu1in,肠平滑肌肌动蛋白gamma2,含靶蛋白同源基因similar to palladin,免疫反应相关基因CD58,编码微小染色体维持蛋白的基因MCM5, RCC2,参与细胞侵袭和转移的基因Flotillin-2,酶类(包括激酶)及其同源基因AFG3ATPase f ami ly gene3-like2、AK3L2、TAOK3等基因。另外,我们还分离了一些未知功能的新基因。以最大等级卵泡和最小等级卵泡这两个不同发育阶段的卵泡为实验材料进行消减杂交。其中,以最大等级卵泡为Tester,最小等级卵泡为Driver,建立的为正向消减文库；以最小等级卵泡为Tester,最大等级卵泡为Driver建立的为反向消减文库。实验过程中,总RNA与反转录成的cDNA质量较好,消减产物得到很好的富集,正向消减文库中获得了79条独立的差异表达基因,BLAST比对结果显示,其中67条具有同源基因,12条无相似基因或者同源性极低的基因；筛选出与卵泡发育相关基因EGFR,与排卵有关的基因ADAMTS-1影响脑神经系统和胚胎发育的编码钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶基因、免疫相关基因lymphocyte antigen86-like和IL17RA,参与细胞调亡的基因death domain-containing tumor necrosis factor receptor superfamily member23,骨成形蛋白2基因。分离了一些编码通道或转运有关蛋白的基因及其同源基因sodium/myo-inositol cotransporter-like、calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase、 SLC9A8、potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member2、 SLC2A1、PCTP等。除上述基因外,还筛选到RNF14、TTC17、PHF21A、PLEKHB2、 ADD3、RGS12、SVEP1、HDAC4、STOM、SMARCE1、SETD4、CEBPG、STRADA、ZC3H14、 RHOBTB1、ALDH1A2、EXOC2和GAPVD等基因。反向消减文库中获得了37条独立的差异表达的基因,比对结果显示,其中29条具有同源基因,8条无相似或相似度极低的基因。反向文库中筛选出的基因主要包括RBMII、微管组分基因α-tubulin lc、 CD58、真核生物翻译起始基因EIF3I以及编码微小染色体维持蛋白的MCM5基因。
陈杰[4]2011年在《鸭部分繁殖性状杂种优势及其与相关基因表达关系的研究》文中研究表明为探讨鸭基因差异表达与繁殖性状杂种优势率的关系,本试验选用高邮鸭(GG)和金定鸭(JJ)为实验素材,按照2×2双列杂交设计,组建高邮鸭、金定鸭亲本及其正反交共4个试验鸭群,统计4个鸭群的繁殖性状和蛋品质指标,进行比较分析,并计算杂种优势率。参照GenBank中已有的绿头鸭、番鸭、鸡等禽类相关基因cDNA保守序列,设计引物,克隆获得了家鸭FSHR、ERβ和GHR3个繁殖功能基因。运用实时荧光定量PCR技术,分析了3个繁殖功能基因分别在杂种和亲本群体产蛋早期、产蛋高峰期和产蛋末期性腺轴组织中mRNA表达量的差异,并分析了其与繁殖性状杂种优势率的关系。主要试验结果如下：试验一不同组合繁殖性状和蛋品质的比较本试验比较GG,JJ,GJ和JG繁殖性状和蛋品质。与亲本相比,两个正反交群体在开产日龄、42周龄产蛋数、72周龄产蛋数、蛋壳强度和蛋白高度性状上表现出明显的杂种优势,这为开展本研究提供了基础。试验二目的基因的克隆与序列分析成功克隆获得了家鸭FSHR、ERβ和GHR基因的部分cDNA序列。试验叁目的基因组织差异表达与繁殖性状杂种优势关系分析1. Real-time PCR分析结果,产蛋高峰期垂体组织中FSHR在亲本与杂种之间的mRNA表达量差异极显着(P<0.01)。同时,垂体组织中FSHR基因在GJ、JG杂交组合的mRNA表达量与开产日龄的杂种优势率呈显着的正相关(P<0.05),与42周龄产蛋数的杂种优势率呈显着的负相关(P<0.05)。研究结果表明,产蛋高峰期垂体组织FSHR基因的差异表达与开产日龄、42周龄产蛋数的杂种优势有关。2. Real-time PCR分析结果,产蛋高峰期垂体(P<0.01)、卵巢组织中(P<0.05)ERβ在亲本与杂种之间的mRNA表达量存在差异。同时,产蛋高峰期垂体组织中ERβ在两个杂交组合的mRNA差异表达量与开产日龄的杂种优势率呈显着的正相关(P<0.05),与42周龄产蛋数的杂种优势率呈显着的负相关(P<0.05)。产蛋高峰期卵巢组织中,ERβ在两个杂交组合的mRNA差异表达量与开产日龄的杂种优势率呈极显着的正相关(P<0.01),与42周龄产蛋数的杂种优势率呈显着的负相关(P<0.05)。研究结果表明,产蛋高峰期垂体和卵巢组织ERβ基因的差异表达与开产日龄、42周龄产蛋数的杂种优势有关。3. Real-time PCR分析结果,产蛋周期组织中GHR在亲本与杂种之间的mRNA表达量差异显着。但是,产蛋高峰期垂体组织中GHR基因表达量与72周龄产蛋数杂种优势率具有较高的相关性外,产蛋周期不同组织鸭GHR基因mRNA表达量与繁殖性状杂种优势率相关性均较低。研究结果表明,产蛋周期GHR基因的差异表达与繁殖性状的杂种优势不存在显着相关。
王家庆[5]2007年在《大菱鲆白化病相关基因（DEN-1、DEN-2）的分离鉴定及特征分析》文中研究指明大菱鲆是我国在上世纪90年代引进的名贵海水养殖鱼类,养殖规模较大。在苗种生产过程中常出现大规模的白化现象,白化大菱鲆商品价值大大降低。鲆鲽鱼类白化的分子机制一直是国内外未能解决的热点问题,因此,克隆鱼类白化相关基因具有重要意义。本研究应用mRNA差异显示技术,对正常与白化大菱鲆有眼侧皮肤组织进行了对比研究,克隆差异表达基因,共分离到22条大菱鲆白化相关基因片段,片段长度100～1200 bp左右。经测序、RT-PCR验证,差异表达基因片段DEN-1(GenBank登录号:DQ886390)与DEN-2(GenBank登录号:DQ886391)均在白化大菱鲆有眼侧皮肤组织中下调表达;通过BLAST检索发现,DEN-1与GenBank中的斑马鱼和牛的类似尿苷二磷酸-葡萄糖:糖蛋白葡萄糖基转移酶(UGGT)基因、与挪威鼠类似尿苷二磷酸-葡萄糖:神经酰氨葡萄糖基转移酶1(Ugcgl1)基因有较高同源性;DEN-2与原鸡、斑马鱼、人、挪威鼠、家鼠和狗的眼缺乏同源框4(eya4)基因的同源性均较高。这些结果也同样得到了BLASTX结果的证实。同源性较低的片段可能为未知新基因,对这些序列信息进行进一步研究将有助于获得完整基因和了解大菱鲆白化的分子机制。采用相对定量RT-PCR对正常鱼有眼侧皮肤(N1)、白化鱼有眼侧皮肤(A1)、正常鱼无眼侧皮肤(N2)、白化鱼无眼侧皮肤(A2)进行表达谱分析,以内参β-actin基因分别对DEN-1和DEN-2表达量进行标准化的光密度扫描显示:DEN-1和DEN-2在4种皮肤组织中有相似的表达模式,其表达量为:N1>N2≈A2>A1。电子延伸将DEN-2延伸为497 bp的片段,该延伸片段与多种动物的eya4基因在核酸和蛋白水平均有很高同源性。本研究对DEN-1和DEN-2的不同组织器官和不同发育阶段的电子表达谱分析,将对其进一步研究提供有价值参考。
丁兆忠[6]2006年在《抗禽流感病毒免疫相关基因的筛选及分析》文中研究说明为了研究禽流感灭活疫苗免疫的分子机制,发现新的抵抗禽流感病毒基因,为抗禽流感病毒转基因鸡的制作提供候选基因,同时也为抗禽流感病毒药物的研制奠定基础,本研究应用mRNA差异显示技术,以40只30日龄AA白羽肉鸡(ARBOR ACRES)为材料,其中20只鸡注射H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,对照组(A组)和注射组(B组)在注射9天时宰杀,取脾脏放液氮中保存。采用TRIZOL法提取脾脏总RNA,经DNA酶Ⅰ消化除去基因组DNA,用分光光度计将每个个体总RNA稀释到一定浓度,将每个组的20个RNA样品取等量组建RNA池,然后分别用3条锚定引物反转录为cDNA。采用3条锚定引物和18条随机引物组成的54对引物对以cDNA为模板分别扩增两组样品。两组扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,银染后,切割两组样品的差异表达条带。以回收的差异条带为模板,进行二次扩增,并回收纯化。回收产物采用以地高辛标记的反Northern点杂交鉴定,阳性条带连接T载体,转化大肠杆菌,挑白色单克隆摇菌,提取质粒,经酶切鉴定后测序。差异不明显片段用半定量RT-PCR鉴定。筛选出13条抗禽流感病毒免疫相关基因的ESTs,分别编号为DD1-DD13,其中DD1、DD2仅在A组中表达,DD3、DD4在A组中表达量高于B组;DD5、DD6、DD7、DD8、DD9仅在B组中表达,DD10、DD11、DD12、DD13在B组中表达量高于A组。应用BLASTn工具将13条ESTs对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD10、DD13为同一条序列,都与鸡核糖体蛋白L7a基因有高度的相似性,为这个基因的EST。人核糖体蛋白L7a在肿瘤和疾病过程中发挥重要作用,推测鸡核糖体蛋白L7a可能参与禽流感疫苗免疫过程,可能具有抵抗禽流感病毒的作用。DD7与预测的鸡类T细胞受体α亚基基因有一定的同源性,T细胞具有抵抗和清除禽流感病毒的作用。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高相似性,为已知的ESTs,但功能未知。DD1、DD2、DD5、DD8没有发现同源序列,为新的ESTs。将这4条新ESTs提交GenBank,分别获得登陆号为EB714185、EB714186、EB714187、EB714188。应用数据库资源将DD3延伸至1483bp,DD11延伸至1076bp,DD12延伸至826bp。对DD3、DD11、DD12进行电子表达谱分析,发现DD3在脑、雌性生殖器、心脏、软组织中表达,DD11在脑、腔上囊、软骨、胃肠道、心脏、肝脏、肌肉、胰腺、软组织、脾脏中表达,DD12在脑、雌性生殖器中表达。通过与鸡基因组数据库进行同源性检索,除了DD4、DD5外都找到了对应的基因组序列,进行了定位。对DD1、DD2、DD5、DD8用BLASTx工具对非冗余蛋白质数据库nr进行了相似性搜索。本研究筛选出的鸡核糖体蛋白L7a基因、鸡类T细胞受体α亚基基因和其它ESTs
参考文献：
[1]. 绍兴鸭卵巢卵泡发育相关新基因的分离、克隆与鉴定[D]. 束刚. 南京农业大学. 2003
[2]. 绍鸭卵巢卵泡发育相关新EST的分离与表达[J]. 束刚, 陈杰, 倪迎冬, 周玉传, 赵茹茜. 遗传学报. 2004
[3]. 鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析[D]. 卢立志. 浙江大学. 2011
[4]. 鸭部分繁殖性状杂种优势及其与相关基因表达关系的研究[D]. 陈杰. 扬州大学. 2011
[5]. 大菱鲆白化病相关基因（DEN-1、DEN-2）的分离鉴定及特征分析[D]. 王家庆. 辽宁师范大学. 2007
[6]. 抗禽流感病毒免疫相关基因的筛选及分析[D]. 丁兆忠. 西北农林科技大学. 2006