杨健美[1]2005年在《表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌的免疫效力及Stx 2e单克隆抗体的研究》文中研究表明由产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxigenic Escherichia coli,SLTEC)引起的断奶仔猪腹泻(Post-weaning diarrhoea,PWD)和仔猪水肿病(Edema disease,ED)是导致断奶仔猪死亡的重要传染病。该类大肠杆菌的致病性主要与粘附素和肠毒素/类志贺毒素两类毒力因子有关。细菌通过粘附素附着于猪肠道上皮细胞,细菌一旦定居于小肠粘膜上,即开始大量繁殖,并产生大量的毒素或侵入深部,损伤破坏组织引发疾病。引起PWD的大肠杆菌主要产生F4(K88)和F18两类粘附素,致ED的大肠杆菌可产生F18粘附素,致ED的大肠杆菌另一个显着特点是可产生志贺样毒素2变异体(Shiga toxin two variant,Stx 2e)。迄今为止,如何有效预防PWD和ED仍然是个有待解决的问题。本研究的目的是通过对本室构建的同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌在小鼠体内诱导体液免疫、对强毒株攻击的免疫保护力等方面进行了研究,为预防PWD和ED的基因工程疫苗的研制奠定了基础,对于推动断奶仔猪腹泻和猪水肿病基因工程苗的研制具有重要意义。 与F4粘附素生物合成有关的基因簇包括10个,其中faeG编码的蛋白FaeG是F4粘附素的主要亚单位蛋白,与菌毛的粘附特性有关;与Ⅰ型菌毛相似,F18也是由多个亚单位组成,现已鉴定的亚单位有A、E、F等,亚单位A(fedA)是F18粘附素的主要结构亚单位;Stx 2e由一分子的A亚单位和五分子的B亚单位的聚合体共同构成,其中B亚单位主要与细胞受体结合有关,具有免疫原性。施
施慧[2]2004年在《表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌的构建》文中提出由产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxigenic Escherichia coli，SLTEC)引起的断奶仔猪腹泻(Post-weaning diarrhoea，PWD)和仔猪水肿病(Edema disease，ED)是导致断奶仔猪死亡的重要传染病。该类大肠杆菌的致病性主要与粘附素和肠毒素／类志贺毒素两类毒力因子有关。细菌通过粘附素附着于猪肠道上皮细胞，细菌一旦定居于小肠粘膜上，即开始大量繁殖，并产生大量的毒素或侵入深部，损伤破坏组织引发疾病。引起PWD和ED的大肠杆菌主要产生F4(K88)和F18两类粘附素，同时可产生类志贺毒素2变异体(Stx 2e)。迄今为止，如何有效预防PWD和ED仍然是个有待解决的问题。本研究构建了能同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌，并对其免疫力进行初步评估。 与F4粘附素生物合成有关的基因簇包括10个，其中faeG编码的蛋白FaeG是F4粘附素的主要亚单位蛋白，与菌毛的粘附特性有关；与Ⅰ型菌毛相似，F18也是由多个亚单位组成，现已鉴定的亚单位有A、E、F等，亚单位A(fedA)是F18粘附素的主要结构亚单位；Stx 2e由一分子的A亚单位和五分子的B亚单位的聚合体共同构成，其中B亚单位主要与细胞受体结合有关，具有免疫原性。本研究的目的是克隆出保护性抗原基因fedA、faeG和stx2eB，并进行共表达，通过测定重组菌诱导机体产生粘膜免疫、体液免疫的水平，为PWD和ED基因工程活疫苗的研究奠定基础。 本研究利用PCR技术，分别从大肠杆菌TB1、107／86和C83907菌株中扩增出不含信号肽序列的Stx 2e B亚单位基因(stx2eB)、F18菌毛的A亚单位基因(fedA)和F4菌毛亚单位基因(faeG)，并克隆入pGEM-T easy载体中，根据蓝白斑筛选及限制酶酶切分析得到分别含有stx2eB、fedA和faeG基因的重组质粒pstx2eB，pfedA和pfaeG。对重组质粒中插入的片段进行序列测定，结果表明插入的序列与公开发表的序列完全一致。再将各目的基因，按预定阅读框架依次亚克隆入原核表达载体pGEX-6P-1的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游，对构建的重组质粒pFSFaeG扬州大学硕士学位论文进行酶切分析和核营酸序列分析，结果表明插入的片段与预期一致，且阅读框正确。重组质粒转化大肠杆菌BLZI后，在37Oe、IPTG诱导下进行表达。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS一队GE电泳分析及Westem一blot鉴定，表明重组菌能正确表达GST-FedA一StxZeB一FaeG融合蛋白，即S饮ZeB一FedA一FaeG蛋白与谷肤甘肤转移酶相连组成的融合蛋白。 用重组菌口服和肌注免疫3卜35日龄的仔猪，通过对实验猪免疫后3d、7d、IOd、14d粪检菌的抗氨节青霉素试验及对其进行质粒酶切分析，结果显示该重组菌能稳定地定居于仔猪肠道至少14d，用间接ELISA方法对免疫后7d、14d、3ld和40d仔猪粪样和血清中针对F4抗原的特异性IgA以及血清中针对F4抗原邝18抗原的特异性IgG进行检测。虽然粪样和血清中一直未能测得针对F4抗原的特异性IgA，但通过对血清中针对F4抗原的特异性IgG 0D49。值与非免疫对照组及空载体细菌免疫对照组测得的OD49。值进行比较分析，结果显示重组菌经口服和肌注免疫后能诱导机体产生针对F4抗原特异性抗体IgG。由此可见，重组菌经口服免疫或肌注免疫，在激发肠道粘膜免疫的能力方面尚待进一步研究。
杨健美, 张小荣, 高崧, 韦栋平, 刘秀梵[3]2005年在《无抗性表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌构建》文中认为利用平衡致死系统成功地将构建表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌BL21(pFSFaeG)中所含氨苄抗性基因敲除,并转化沙门氏菌宿主菌X4550。经过质粒酶切分析和表达产物的SDSPAGE证实,氨苄抗性基因已经成功敲除,并且目的蛋白仍与谷胱甘肽转移酶相融合,得到有效表达,重组融合蛋白的分子质量约为80ku。经体外连续传代试验,重组菌X4550(pFSFaeG)均能在无抗生素压力下大量扩增并稳定传代,质粒稳定性和蛋白表达稳定性良好。无抗性重组菌的成功构建解决了基因工程疫苗抗性基因潜在危险问题,并有望通过沙门氏菌载体的递送作用,为研制口服疫苗奠定了基础。
曹传闺[4]2006年在《表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌的中间试验、环境释放试验及我国部分养殖猪种F18受体基因型的检测》文中进行了进一步梳理由产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxigenic Escherichia coli, SLTEC)引起的断奶仔猪腹泻(Post-weaning diarrhoea, PWD)和仔猪水肿病(Edema disease, ED)是导致断奶仔猪死亡的重要传染病。该类大肠杆菌的致病性主要与粘附素和肠毒素/类志贺毒素两类毒力因子有关。细菌通过粘附素附着于猪肠道上皮细胞,细菌一旦定居于小肠粘膜上,即开始大量繁殖,并产生大量的毒素或侵入深部,损伤破坏组织引发疾病。引起PWD的大肠杆菌主要产生F4﹝K88﹞和F18两类粘附素,致ED的大肠杆菌可产生F18粘附素,致ED的大肠杆菌另一个显着特点是可产生志贺毒素2变异体(Shiga toxin two variant, Stx 2e)。迄今为止,如何有效预防PWD和ED仍然是有待解决的问题。本研究的目的是通过对本室构建并已完成初步免疫效力研究的表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌在江苏省的中间试验和环境释放试验的研究,评价重组菌对猪的免疫效果及其安全性,为PWD和ED的基因工程疫苗的研制奠定基础。与F4粘附素生物合成有关的基因簇包括10个,其中faeG编码的蛋白FaeG是F4粘附素的主要亚单位蛋白,与菌毛的粘附特性有关;与Ⅰ型菌毛相似,F18也是由多个亚单位组成,现已鉴定的亚单位有A、E、F等,亚单位A(fedA)是F18粘附素的主要结构亚单位;Stx 2e由一分子的A亚单位和五分子的B亚单位的聚合体共同构成,其中B亚单位主要与细胞受体结合有关,具有免疫原性。施慧等人构建的重组菌BL21(pFSFaeG)有效表达了Stx 2e B亚单位基因(stx2e B)、F18菌毛的A亚单位基因(fedA)和F4菌毛亚单位基因(faeG),经SDS-PAGE和
杨健美, 施慧, 高崧, 陈祥, 刘秀梵[5]2005年在《表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌的构建与免疫保护试验》文中研究说明运用PCR技术,分别从大肠杆菌TB1、107/86和C83907菌株中扩增出不含信号肽序列的Stx 2e B亚单位基因(stx 2e B)、F18茵毛的A亚单位基因(fedA)和F4茵毛亚单位基因(faeG),将这3个基因的PCR扩增产物按预定阅读框架克隆入pGEX-6P-1载体的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游,对构建的重组质粒pFSFaeG进行酶切分析和核苷酸序列分析,结果表明,插入的片段与预期一致,且阅读框正确。重组质粒在宿主茵BL21中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,发现表达产物与谷胱甘肽转移酶相融合,重组融合蛋白的分子量约为80kD。用表达FedA-Stx 2e B-FaeG的重组茵BL21(pFSFaeG)灭活苗对5周龄的ICR小鼠进行腹腔免疫,结果显示经重组菌免疫后的小鼠血清中,产生了分别针对F4、F18、Stx2e抗原特异性的IgG,相应的抗体水平从免疫后7d开始逐步升高,在第二次免疫后21d左右达到了较高的水平,并且在攻毒后对小鼠提供了较好的保护,免疫保护率均达80%以上。
杨健美, 高崧, 刘秀梵[6]2005年在《表达PWD和ED保护性抗原的两种重组菌的免疫原性初步研究》文中研究说明已构建的能表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原FedA-Stx2eB-FaeG融合蛋白的重组菌BL21(pFSFaeG)和重组菌X4550(pFSFaeG),经IPTG诱导的重组菌制成抗原,经口服、及灭活后制成油乳剂苗免疫小鼠后,抗体检测结果表明,重组菌经灭活后免疫能够诱导小鼠产生针对上述叁种保护性抗原的特异性抗体IgG。免疫效力试验结果显示,两种重组菌的最佳免疫途径均为灭活后经腹腔免疫。
杨健美, 陈祥, 高崧, 刘秀梵[7]2005年在《表达PWD和ED保护性抗原的两种重组菌的免疫原性研究》文中提出采用已构建的能表达致断奶仔猪腹泻(PW D)和仔猪水肿病(ED)大肠杆菌保护性抗原F edA-S tx 2e B-F aeG融合蛋白的重组菌BL 21(pFSF aeG)和重组菌X 4550(pFSF aeG),经IPTG诱导后制成抗原,经口服及灭活后制成油乳剂苗免疫小鼠后,检测IgG抗体水平的变化。结果表明:重组菌经灭活后免疫小鼠能够诱导产生针对上述3种保护性抗原的特异性抗体IgG。免疫效力试验结果显示,两种重组菌的最佳免疫途径均为灭活后经腹腔免疫。
杨健美, 高崧, 刘秀梵[8]2007年在《表达致PWD和ED保护性抗原重组菌的免疫效力》文中研究表明重组菌BL21(pFSFaeG)是能够同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原(F4、F18、Stx2e)基因的基因工程重组菌。由IPTG诱导的重组菌制成抗原,经甲醛灭活后腹腔免疫小鼠,用间接ELISA法定期检测小鼠血清中的抗体产生情况,结果显示重组菌能够诱导小鼠产生针对上述3种保护性抗原的特异性抗体IgG。免疫攻毒保护试验表明,用大肠杆菌标准强毒株C83907(F4)、108/86(F18)和Stx2e毒素攻毒后,重组菌诱导产生的抗体能够对小鼠提供80%以上的保护。
闫振[9]2012年在《致断奶仔猪腹泻和猪水肿病大肠杆菌O141株及O8株基因突变株LpxLLpxMLpxP的构建及其免疫效力研究》文中指出断奶仔猪腹泻和猪水肿病是由产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)引起的一种常见且重要的细菌性传染病,易与其它病原菌、病毒并发或继发感染,给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。引起断奶仔猪腹泻和猪水肿病的大肠杆菌国外报道的血清型主要有0139、O138、0141、08、0157、045等。STEC是革兰氏阴性菌,其细胞壁中含有脂质双分子层。细胞壁的内膜主要由磷脂构成而外壁层主要由磷脂和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构成。LPS由类脂A、核心多糖和O-特异性多糖叁部分组成。类脂A中长脂肪链的紧密迭加以及LPS的疏水部共同形成了细菌的通透性屏障。类脂A在革兰氏阴性菌的致病性方面起重要作用。它可以激活体内的内在免疫系统,使阳离子抗菌肽、细胞因子、凝固因子以及其他免疫刺激因子的合成增多。类脂A包含四条(R)-3-hydroxyacy主链,其中某些(R)-3-hydroxyacy链可以进一步乙酰化修饰。LpxL和LpxM在大肠杆菌类脂A分子生物合成的最后一步中起重要作用,这一步发生于细菌细胞壁的内壁层。在正常温度下,细菌在酰基合成转移酶的作用下将月桂酰和肉豆蔻酰连续不断地添加到四酰化产物中间体上。但是,在12℃低温环境时,酰基合成转移酶LpxP代替LpxL发挥作用,从而使链结合软脂酮。LpxL和LpxM基因的突变使细菌的致病力及对吞噬细胞的抵抗力均降低。本研究运用等位基因交换的方法构建LpxL的单基因突变株和LpxLLpxM双基因缺失突变株以及LpxLLpxMLpxP叁重突变株。PCR扩增带有酶切位点的LpxL、LpxM和LpxP基因片段并将其插入到pMD18-T simple载体中相应酶切位点处,再运用分子克隆的方法将Cam抗性基因分别插入到目的基因LpxL、LpxM和LpxP中,构建出带Cam抗性基因标志的载体pT-LpxL-Cam、pT-LpxM-Cam和pT-LpxP-Cam。PCR扩增片段LpxL-Cam、LpxM-Cam和LpxP-Cam,并电转化入带有质粒pKD46的猪病原性大肠杆菌分离株0141和08中,在Red重组系统中质粒pKD46表达的重组酶的帮助下,筛选出0141及08株的基因突变株O141ΔLpxLΔLpxMΔLpxP、O8ΔLpxLΔLpxMΔLpxP,并在pCP20的作用下去除Cam抗性。Southern blot结果显示FRT位点基因在STEC O141及08株的基因组中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明突变株的LpxL、LpxM和LpxP基因不能转录,而其上下游基因的转录未受到影响。体外生长曲线的测定结果表明O14ΔLpxLΔLpxMΔLpxP O8△LpxLΔLpxMΔLpxP突变株的生长速率与野生株相比明显减慢。本研究制备了基因缺失株的灭活菌,并对其在小鼠体内诱导体液免疫及其对强毒株攻击后的免疫保护力等方面进行了研究,为PWD和ED基因工程疫苗的研制奠定了基础。将己构建的基因缺失株的菌株制成抗原,经灭活后制成油乳剂疫苗免疫小鼠,用间接ELSIA法定期检测小鼠血清和粪便中的抗体产生情况。抗体检测结果表明,突变株经灭活后免疫能够诱导小鼠产生针对上述叁种保护性抗原的特异性抗体IgG。用大肠杆菌野生株0141和08攻毒后,对2种病原体的免疫保护力均达80%以上。
刘付敏[10]2009年在《应用体内诱导抗原技术筛选仔猪大肠杆菌0139体内表达基因的初步研究》文中提出猪致病性大肠杆菌病是对规模化养猪生产危害较严重的传染性疾病之一,给养猪业带来巨大经济损失。一方面,大肠杆菌的血清型复杂,致病性大肠杆菌血清型不断发生变化,导致免疫失败,给猪大肠杆菌病的控制增加了困难。另一方面,由于近年来抗生素的广泛持续和不当使用,导致大肠杆菌耐药株的不断增多,耐药机制的不断变迁,使人们对大肠杆菌病的治疗变得十分困难。闪此,本研究拟和用体内诱导抗原技术,希望找到一些大肠杆菌的体内诱导基因,并分析它们的功能,从而能进一步了解大肠杆菌病的具体致病机制,为将来发现新的药物靶标,研发新的疫苗和诊断试剂提供一些新的线索。体内诱导抗原技术(in vivo-induced antigen technology,IVIAT)是快速鉴定体内特异性表达抗原基因的高通量筛检技术。其原理是利用体外培养的病原微生物去除感染动物血清中针对体外表达抗原的抗体,再用此吸附血清作为探针来筛选病原微生物基因组表达文库中体内特异性表达抗原的基因,旨在为新药、新疫苗和新型诊断方法研发提供新靶标,为进一步阐明病原体致病与免疫机理提供理论依据。病原菌感染机体后休内诱导表达的抗原通常与病原菌的致病性机制密切相关。为了研究致病性大肠杆菌感染机体过程中存在的致病因子,本研究采用了体内诱导抗原技术,以致病性大肠杆菌0139为研究对象,对其在休内的表达基因进行了筛选.首先构建了猪源大肠杆菌0139的基因组表达文库:提取了猪源大肠杆菌O139的基因组,用限制性内切酶Sau3AI不完全酶切并回收1～4Kb的基因组DNA片段。限制性内切酶BamHI酶切原核表达载体pET-32u(+),回收线性载休,用CIAP去磷酸化。将上述两种酶切回收DNA片段进行连接反应,转化大肠杆菌DH5a,碱裂解法提取重组质粒,用XhoI和Ncol双酶切的方法对提取的重组质粒进行鉴定,鉴定结果达到符合要求。把大量提取的重组质粒直接转入新鲜制备的感受态细胞BL21中,计算表达文库的库容量,经过计算文阵容量为1.2×10~4。满足了我们研究工作的需要,之后随机挑取10个克隆用上述双酶切方法鉴定文库,结果显示随机挑选的10个克隆都为阳性克隆,酶切后载体片段约为5.9Kb,插入片段基本位于2～4Kb之间。说明大肠杆菌基因组O139的表达文库构建的比较成功,为进一步筛选大肠杆菌体内诱导基因奠定了良好的基础。然后对大肠杆菌基因组表达文库进行了筛选:收集感染致病性大肠杆菌仔猪的血清,用玻板凝集法检测仔猪血清抗体,比较符合率,符合率为30%(3/10),与菌株血清型鉴定一致。用经体外培养的大肠杆菌菌株O139和BL21(含pET-32a(+)空载体)的超声产物吸附仔猪血清,ELISA方法确定血清的最佳稀释倍数及测定吸附后血清抗体滴度变化,根据最佳抗体浓度采用菌落原位免疫的方法对表达文库进行免疫筛选,寻找阳性克隆。但是,筛选结果没有得到阳性克隆,其原因有待进一步研究。
参考文献：
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[4]. 表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌的中间试验、环境释放试验及我国部分养殖猪种F18受体基因型的检测[D]. 曹传闺. 扬州大学. 2006
[5]. 表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌的构建与免疫保护试验[C]. 杨健美, 施慧, 高崧, 陈祥, 刘秀梵. 第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集. 2005
[6]. 表达PWD和ED保护性抗原的两种重组菌的免疫原性初步研究[C]. 杨健美, 高崧, 刘秀梵. 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集. 2005
[7]. 表达PWD和ED保护性抗原的两种重组菌的免疫原性研究[J]. 杨健美, 陈祥, 高崧, 刘秀梵. 扬州大学学报. 2005
[8]. 表达致PWD和ED保护性抗原重组菌的免疫效力[J]. 杨健美, 高崧, 刘秀梵. 中国兽医学报. 2007
[9]. 致断奶仔猪腹泻和猪水肿病大肠杆菌O141株及O8株基因突变株LpxLLpxMLpxP的构建及其免疫效力研究[D]. 闫振. 扬州大学. 2012
[10]. 应用体内诱导抗原技术筛选仔猪大肠杆菌0139体内表达基因的初步研究[D]. 刘付敏. 西南大学. 2009