导读:本文包含了突变人胰岛素原基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:诱变,定点,质粒,转染,内质网应激
突变人胰岛素原基因论文文献综述
张红艳,崔景秋,李宁,刘铭,冯凭[1]（2014）在《人胰岛素原基因突变导致糖尿病机制的实验研究》一文中研究指出目的构建几种与人类糖尿病相关的人突变型胰岛素原质粒,并在大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)中进行表达。方法以野生型人胰岛素原质粒基因PCMS-EGFP/HWT为模板,设计并合成引物,利用定点突变技术,PCR生成PCMS-EGFP/H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C、H-F(B25)L 4种单点突变质粒,对每个质粒进行序列测定验证定点突变成功,用脂质体2000将上述野生型、4种突变型质粒及空质粒分别转染INS-1细胞,放射免疫法检测各细胞培养液中人胰岛素水平。结果序列测定证实上述质粒定点突变成功,H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C 3组突变细胞培养液中胰岛素水平低于野生型和H-F(B25)L组(P<0.05),与空质粒组差异无统计学意义,且3组彼此间差异无统计学意义;H-F(B25)L组与野生型差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建并表达4种突变型人胰岛素原质粒,不同突变型胰岛素原可能通过不同机制导致糖尿病。(本文来源于《天津医药》期刊2014年04期）
石琳[2]（2008）在《腺病毒介导的突变型人胰岛素原基因转染人脐带间充质干细胞》一文中研究指出研究背景:目前糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第叁大死亡疾病,它是一种影响体内胰岛素和糖含量的疾病,共有两种主要类型,分别为Ⅰ型和Ⅱ型,其共同特征是胰岛β细胞损伤或不能产生足够的胰岛素或机体不能有效的利用胰岛素,所以胰岛素就被作为治疗糖尿病的特效药应用于临床。由于随时需要注射胰岛素,给患者带来了极大的不便,目前国际上对糖尿病患者进行胰岛移植和基因治疗研究成为了热点。但面临的主要问题是供体不足,免疫排斥,胰岛素基因的转染效率和表达调控等。人脐带来源的间充质干细胞可以较易获得和纯化,并且易于基因修饰,可以将外源性基因转染间充质干细胞,建立一种安全的基因治疗的“细胞载体”。研究表明间充质干细胞还有免疫抑制功能,它不但在体外可以抑制T淋巴细胞增殖反应,在体内实验中也表现出了类似免疫抑制剂的作用,所以利用它作为细胞载体可以避免免疫排斥问题。并且我们利用基因重组的方法将胰岛素原基因进行改造,使其可以在非β细胞(间充质干细胞)中高效表达。相信我们的研究可以为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一些有力的实验依据。目的:将人胰岛素原基因进行两个部位的突变,通过腺病毒介导将其转染到人脐带间充质干细胞中,研究其表达分泌人胰岛素的能力。方法:应用RT-PCR的方法从健康流产胎儿胰腺组织中扩增pINS的cDNA序列,利用重迭延伸PCR方法对pINS基因在A链-C肽和C肽-B链的连接处进行两个部位的突变,产生Furin蛋白酶酶切位点。采用AdEasy~(TM)系统构建重组腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP。分离培养人脐带间充质干细胞,并对其生长特性,免疫表型,分化能力及Furin蛋白酶的表达进行鉴定。pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP感染人脐带间充质干细胞后,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测它们的感染效率,并确定最佳的感染复数(multiplicities of infection,MOI)。以感染复数为100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人脐带间充质干细胞1、3、5、7、10天后,RT-PCR检测人胰岛素原基因在人脐带间充质干细胞中表达;Western blot检测成熟人胰岛素和人C-肽在人脐带间充质干细胞中的表达;免疫荧光实验检测感染后48小时人胰岛素在人脐带间充质干细胞中的表达:ELISA实验检测感染后1、3、5、7、10天人胰岛素和人C-肽的分泌。结果:自健康流产胎儿胰腺组织中扩增出364 bp的pINS cDNA,连接入穿梭质粒中,构建重组腺病毒。pAdINS-M2经扩增纯化后滴度达到2.57×10~(10) PFU/mL,pAdINS的滴度为1.25×10~(10)PFU/mL,对照病毒AdGFP为4.85×10~9 PFU/mL。成功的从脐带组织中分离培养出间充质干细胞,绘制生长曲线,约3天扩增一代。细胞周期检测,大部分细胞都处于G0-G1期(占94.39%),小部分处于G2-M期(4.15%)和S期(1.45%)。在合适的诱导培养条件下,分离培养的人脐带间充质干细胞能够分化为脂肪细胞和成骨细胞。应用RT-PCR方法在人脐带间充质干细胞中检测到了Furin蛋白酶的存在,表明我们构建的含Furin蛋白酶酶切位点的人胰岛素原基因在此细胞中可以被切割产生成熟的人胰岛素。通过重组腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP以不同感染复数感染人脐带间充质干细胞,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,确定MOI 100为最佳的感染复数。以MOI=100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人脐带间充质干细胞1、3、5、7、10天后,RT-PCR方法检测到在pAdINS和pAdINS-M2感染的UC-MSCs中人胰岛素原基因都有表达;Western blot的结果显示pAdINS感染的UC-MSCs表达人胰岛素原,而pAdINS-M2感染的UC-MSCs中检测到了人胰岛素和C.肽,pAdGFP感染的UC-MSCs中两者都没有检测到表达。免疫荧光也检测了pAdINS-M2感染后48小时人胰岛素和C-肽在人脐带间充质干细胞胞浆中表达:ELISA检测感染后1、3、5、7、10天培养上清中人胰岛素和C-肽的浓度。结果显示,自感染后24小时目的基因就开始表达,第3-5天表达量达高峰,一周后表达有所下降。与RT-PCR和Western blot结果一致。结论:成功构建含有Furin蛋白酶切位点的人胰岛素原基因腺病毒重组体(pAdINS-M2);分离培养了人脐带源间充质干细胞,并对其进行了鉴定;重组腺病毒pAdINS-M2感染人脐带间充质干细胞后,表达分泌成熟人胰岛素和C-肽。可以为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一些有力的实验依据。(本文来源于《中国协和医科大学》期刊2008-05-01）
袁凤山,王大会,王冰,张锦,王玉霞[3]（2005）在《人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究》一文中研究指出目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显着提高并受葡萄糖生理性调控。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2005年09期）
郑宏庭,邓华聪,蹇锐,兰丽珍,方芳[4]（2004）在《逆转录病毒载体介导胰岛素原基因突变体与葡萄糖激酶基因共转染的应用价值》一文中研究指出目的 研究逆转录病毒载体介导基因共转染的效率 ,探讨其在基因共转染领域的应用价值。方法 以携葡萄糖激酶 (glucokinase ,gk)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体 (mutantproinsulingene ,mpin)的逆转录病毒共同感染HepG2细胞 ,经G418筛选 ,放免法、SDS PAGE、Western blot挑选联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞 ,RT PCR鉴定。结果 G418筛选 3周获阳性细胞克隆 ,采用放射免疫法、SDS PAGE、Western blot从 2 0个细胞克隆中挑选出联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞 4株 ,选取 1株命名为细胞克隆“β” ;RT PCR证实细胞“β”中已有两个目的基因的转录。结论 在需要目的基因长期表达的基因共转染领域 ,逆转录病毒载体仍有一定的应用价值 ,但如何提高其介导的基因共转染效率有待进一步探究。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2004年22期）
兰丽珍,邓华聪,孙辽,郑丹,郑宏庭[5]（2004）在《人胰岛素原基因突变体的构建》一文中研究指出目的 完成人胰岛素原基因的定点突变 ,使之能在普通细胞中被Furin蛋白酶识别去除C肽分泌成熟胰岛素。方法 采用PCR体外定点突变技术 (PCRsite directedmutagenesis ,PCR SDM) ,设计 4对引物 ,引入 5个Furin识别的突变位点 ,通过重迭延伸法PCR扩增 ,使人胰岛素原编码基因B10密码子由CAC突变为GAC ;C3密码子由GAA突变为AAA ;C4密码子由GCT突变为CGT ;C3 2密码子由CTT突变为CGT ,将扩增片段克隆入T载体并测序。结果 DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求。结论 应用PCR诱导突变技术 ,在体外能准确、简便有效的诱导胰岛素原基因突变 ,使体外应用非内分泌细胞构建高效分泌成熟胰岛素的细胞克隆成为可能。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2004年19期）
袁凤山,杨立新,张坤,王大会[6]（2004）在《简捷的PCR点突变实现人胰岛素原基因非β细胞表达》一文中研究指出利用聚合酶链反应 (PCR)技术将人胰岛素原基因进行两处突变 ,引入Furin酶的裂解位点 ,再构建突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒 ,转染HepG2肝癌细胞 ,经检测可表达成熟胰岛素。所采用的PCR点突变法简单且无错误掺入产生(本文来源于《中华内分泌代谢杂志》期刊2004年03期）
尤春暖[7]（2003）在《含突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体在体外培养的HepG2细胞中的基因转移和表达》一文中研究指出前言 1型糖尿病是由于胰岛β细胞的自身免疫损伤而引起胰岛素分泌绝对不足所致。患者必须采取胰岛素替代疗法。现代的分子生物学和细胞生物学发展为治疗1型糖尿病灌注了新的思想。通过将可表达的胰岛素基因直接导入体内组织或将体外构建的胰岛素分泌细胞移植入患者体内，有望达到根治糖尿病的目的。 肝细胞是除胰岛细胞外唯一含有葡萄糖感应器(Glut2及GK)的体细胞，而且许多肝脏特异性基因都受生理性葡萄糖的调控，所以其作为1型糖尿病基因治疗的靶细胞越来越受到人们的关注。同样，肝癌细胞也是胰岛素表达载体转染的理想细胞。正常情况下，胰岛素在胰腺β细胞分泌颗粒中加工成成熟胰岛素时，需要前激素转化酶PC2和PC3的作用。肝癌细胞内不含有PC2和PC3，不能有效地加工胰岛素原，故不能分泌成熟的胰岛素。但肝癌细胞内富含成对碱基氨基酸蛋白酶furin，能识别鼠类胰岛素原的Arg-X-Lys-Arg序列，为此将此序列引入人胰岛素原cDNA的B-C、C-A结合点，再导入肝癌细胞就可以在furin的作用下分泌成熟的胰岛素。 本实验采用逆转录病毒作为携带胰岛素基因的载体，经脂质体包裹导入体外培养的肝癌细胞HepG2。G418筛选出阳性细胞克隆，提取克隆细胞的染色体DNA，行PCR扩增，用电泳检查转入基因情况。另外，用放射免疫分析方法监测培养液胰岛素水平，探讨胰岛素基因的表达情况。为下一步构建表达调控载体和动物实验奠定基础和提供实验数据。 实验材料 一、主要试剂 脂质体（LIPOryCTAM…XG418（Genehcin入DMEM（Ddsecco’s modsed Eede’s n：leQllllll）培养基均购自美国 GIBCOBRL公司。PCR试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。 二、实挪备 24孔或6孔组织培养板上5nd和eend培养瓶JOCm和6——培养皿、冻存管和离心管问京华美公司＊o 培养箱；超净工作台；美国PERKIN－ELMER PE9700 DNA扩增仪；MINI－SUBTMCELL水平电泳仪（Bi。－Rad八小型台式离心机（SIGMAI－13h低温高速离心机（美国SORVALL ST－ZI人 实验方法 二．含有突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体一质粒PLXSN－MpINS的提取。 采用碱裂解法制备质粒4龙州一MpINS，紫外吸收检测 DNA浓度与纯度。 2．脂质体介导质粒 PLXSN－MP鹏转染肝癌细胞 HePGZ。 转染前24 ／J’时，将 HePG以 5 X 10’接种于6孔培养板（各孔直径为35nun人第2天，用脂质体转染法用u将对x派和4山倒一MPINS质粒转染到上述HePGZ细胞中，并分为未转染组，空载体转染组和胰岛素原基因转染组。37℃，5％的COZ培养至72 ，J’时。 3．G418筛选阳性细胞克隆 转染后72小时，除了第二孔外加G418（终浓度为300 dd ·2·dX每日观察细胞生长情况且每隔两天更换一次培养液和G418（终浓度为300pgilnl人转染后2周，各孔出现不同的阳性细胞克隆，分另将其转移至两个25ml培养瓶中继续培养来提取细胞染色体DNA。 4．细胞样品的收集和检测 转染前后收集细胞培养液，将样品送内分泌实验室检测胰岛素水平。 5．细胞染色体DNA的提取 用Trizol法分别从未转染的HepGZ细胞，转染空载体的pLX－SN和转染PLXSN－MPINS质粒的阳性细胞克隆中提取细胞染色体DNA。 6．PCR扩增及电泳鉴定 反应体系 50pl，循环条件：96℃变性 2分，94℃变性 30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃延伸5分。用1％琼脂糖凝胶检测 PCR产物。 实验结果 1．G418筛选阳性克隆 未转染质粒且未加 G418的细胞生长良好。未转染质粒但加G418的细胞转染后7天内均凋亡。转染质粒pLXSN－MpINS细胞在加G418筛选后细胞状态依旧良好。 2．人胰岛素原基因在肝癌HepGZ细胞染色体DNA整合水平的检测 PCR扩增及电泳鉴定显示人胰岛素原基因转染成功。 3．人胰岛素原基因在肝癌细胞中表达水平的检测 胰岛素基因转染组与未转染组、空载体转染组比较细胞外的胰岛素水平有明显差别师＜0．of人 ·3· 讨 论 二型糖尿病患者体内胰岛素绝对缺乏，若能在患者的胰腺外组织建立呈生理模式调控的胰岛素分泌，则是治疗二型糖尿病非常理想的方法。很多学者在此方面做了有益的探索，但是在基因转移载体、靶细胞的选择和表达调控等方面，还有很多问题需要解决。 胰岛素的合成是以前体形式存在，在运输途径中经翻译后加工成为成熟的胰岛素，而切除C肽所需的PCZ和PC3是胰岛素原转变和代谢的限制性内肽酶。人肝癌细胞内不含有PCZ和PC3，故不能有效地加工胰岛素原。但肝癌细胞内富含成对碱基氨基酸蛋白酶fuin，能识别鼠类胰岛素原的吃一X－Lys一吨序列，为此将此序列引人人胰岛素原CDNA的B－C人一A结合点，再导人肝癌细胞就可以在uin的作用下分泌成熟的胰岛素。 本实验采?(本文来源于《中国医科大学》期刊2003-04-01）
刘兆喆[8]（2003）在《含突变人胰岛素原基因质粒的包装及病毒滴度测定》一文中研究指出前言 1型糖尿病是由胰岛β细胞自身免疫损伤导致胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，目前临床上主要采用胰岛素替代疗法。随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们开始把研究重点放在1型糖尿病的基因治疗上。通过基因转移技术将突变人胰岛素原基因直接导入糖尿病病人体内，使其能在病人肝细胞染色体中稳定整合并且能按生理模式分泌出成熟胰岛素，最终可达到永久治疗1型糖尿病的目的。 本实验用包装细胞对突变人胰岛素原基因与逆转录病毒重组后产生的质粒进行包装并测定病毒滴度。由于逆转录病毒载体(PLXSN)本身是由Moloney小鼠白血病病毒改建而成，在改建中其gsg、env、pol叁部分编码野生型病毒颗粒所必需的基因被去除，无法编码病毒结构蛋白，而包装细胞则是已经人为导入了表达病毒结构蛋白基因的细胞系，故载体需要经过包装细胞的反式补偿才能装配成病毒颗粒。本实验所用包装细胞PA317是第二代包装细胞，其产生的逆转录病毒可感染多种动物，具有广谱的宿主范围，而且还具有高病毒滴度，不产生辅助病毒的特点，适用于人类基因治疗的实验研究。 本实验的目的是： 1．掌握细胞培养及冻存技术。 2．掌握基因转染技术及鉴定方法。 3．筛选出高滴度的产病毒细胞克隆，为糖尿病基因治疗的进一步实验奠定基础。 材料与方法 H材料 PLXSN质粒购自美国CLONTECH公司。PLXSN－MpINS质粒是由前一步实验人员将MpINS质粒与PIHSN重组构建而成。PA317包装细胞购自中国科学院上海细胞库。NIH3Th细胞系由本室提供。脂质体（LIPOFECTAMINEm）购自美国 M TeCImolo－gies公司。cafs（Geneticin）、DMEM（D讪既co’s mo沥ea E呼e’smedium）培养基均购自北京华美公司。PCR试剂购自中日合资宝生物工程（大连）有限公司。25Inl培养瓶和6孔培养板购自北京华美公司。 一方法 1．用碱裂解法提取含突变人胰岛素原基因的质粒。 2．应用脂质体载体介导方法将PLXSN－MpINS质粒转染至PA317包装细胞。 门转染前24小时，将对数生长期的PA317细胞按4rllir孔加人6孔培养板，并用单无 DMEM培养液将细胞配成 10’细Mud浓度。 2）转染当天，按脂质体试剂操作说明书的优化组合条件进行实验，将PLXSN－MPffiS质粒转染至PA3 17细胞，并将未转染的PA317细胞设为对照组。 3．用G418筛选出阳性产病毒细胞克隆并测定病毒滴度。 4．用1’mrOL法提取末转染和转染后PA3 17细胞的基因组DNA。 ·2· 5．采用PCR检测突变人胰岛素原基因的整合情况以证明所产生的病毒DNA没有发生重排或丢失。 实验结果 1．PA317抗性克隆的形成。 经脂质体介导将PLXSN－MpINS导人PA317细胞并用G418筛选可得到大小不等的细胞克隆（图门，而对照组无细胞克隆形成且绝大部颁亡（图2人说明基因转导已经成功。 此后逐渐将长大的抗性克隆局部消化并转移到6孔板，再传至 25 Inl培养瓶内。 收集PLXSN－MpINS－PA317的培养上清用以转导NIH3Th细胞。 2．病毒滴度的测定 挑选出7个克隆按病毒滴度计算公式计算得到下表： 表 IPA3 17的病毒滴度＊fu／Inl） 克隆 病毒滴度＊） l 二．80 X 104 ZI．23X104 31．15 X 104 4 二．44X10’ 5 9．72 X 103 61．93 X 104 7 2．10 X 104 ·3· 3．目的基因整合的鉴定 用PCR扩增及电泳鉴定突变人胰岛素原基因的整合情况：发现阳性克隆细胞基因组都扩增出418hp的目的基因片段电泳条带，而未转基因的PA317细胞DNA则无此条带（图3入证明突变人胰岛素原基因已在 PA3 17细胞基因组上稳定整合。 讨 论 脂质体转染法的原理是：脂质体通过和样品中DNA相互作用，形成脂质体－DNA复合物。这种脂质体一DNA复合物可以吸附于靶细胞表面，通过脂质体膜与细胞膜融合而将外源DNA导人纲胞内。脂质体转染法操作方便、毒性低、转染效率可靠、既适用于瞬时转染也适用于稳定转染。但脂质体转染法存在一个主要缺点即转人的基因不能稳定长期表达。为了克服这一不足，我们使用逆转录病毒载体来介导，将构建于逆转录病毒载体上的突变人胰岛素原基因通过脂质体转染到靶细胞。逆转录病毒载体除了具有可转染的靶细胞种类多，转染效率高等优点外，还可整合至靶细胞染色体中，进行复制转录，从而得到稳定表达。 将目的基因导人靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败。而逆转录病毒载体介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转?(本文来源于《中国医科大学》期刊2003-03-01）
沈坤堂,秦新裕,肖华胜,张新,许相儒[9]（2002）在《定点突变的人胰岛素原基因在体细胞中的表达》一文中研究指出目的 研究在非β细胞中表达成熟胰岛素 ,探讨替代胰岛素注射或胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的方法。方法 采用重迭区扩增基因拼接法 (geneSOEing)自胰岛素原基因组基因中扩增胰岛素原的cDNA ,并于C肽的两端引入蛋白酶furin的识别和切割位点Arg Xaa Lys/Arg Arg ,将获得的突变体重组表达载体 pcDNA3 .1 /C .mINS通过脂质体法转染体外培养的Hela、2 93和L0 2细胞 ,转染后 48、72h取细胞培养液 ;并将L0 2细胞经G41 8(450mg/L)筛选 2个月后 ,得到稳定表达胰岛素的细胞株 ,同时用放射免疫和免疫组织化学的方法监测细胞内外胰岛素的表达水平。结果 成功地对胰岛素原cDNA的 3个位点进行了突变 ,空载体转染的细胞无胰岛素表达 ,而在转染突变后胰岛素原基因cDNA的细胞培养液中胰岛素的表达量各不相同 :每天 8.45～ 1 88.0 0 μIU/2 .0× 1 0 6 Hela细胞、每天 1 59.88～ 2 4 2 .1 4 μIU/ 2 .0× 1 0 6 2 93细胞、每天 2 .56～ 61 .95μIU/ 2 .0× 1 0 6L0 2细胞 ;免疫组织化学显示细胞浆内有囊泡状分泌颗粒。结论 突变的胰岛素原cDNA能成功转染非胰岛β细胞并表达胰岛素(本文来源于《中华实验外科杂志》期刊2002年03期）
张坤[10]（2002）在《突变的人胰岛素原基因逆转录病毒重组质粒的构建及鉴定》一文中研究指出前言 1 型糖尿病是由于胰岛β细胞自身免疫损伤导致的胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素，从而可达到永久治疗的目的。因此基因转移载体的选择对糖尿病的基因治疗至关重要。 逆转录病毒载体pLXSN来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，与携有人突变的胰岛素原基因质粒的PMD18-T载体具有共同的酶切位点，从而可作为载体运用分子生物学实验技术与人突变的胰岛速原基因重组构成新质粒。 本实验的目的是 1：掌握基因重组技术及鉴定方法。 2：构建重组的逆转录病毒载体，为糖尿病基因治疗的进一步试验奠定基础。 材料与方法 1．测序鉴定突变的人胰岛素原cDNA。 2．逆转录病毒表达载体的构建： (1)Hpa Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切pLXSN。 (2)Sal Ⅰ酶切携有人突变的胰岛素原基因(MpINS)的PMD18-T载体，3末端平滑并将其5末端磷酸化(BKL)后，用BamH Ⅰ酶切。 (3)琼脂糖凝胶电泳，回收(1)和(2)中5kb和400bp的目的基因片段。 （3）用 TaKaRa DNA ligation kit将回收的（1）（2）片段连接成pLXSN＊MpINS o K）连接物转化感受态细胞HB 101。 K）筛选阳性克隆，提取质粒。 3·PLXSN－MPINS重组体的鉴定： 门严CR鉴定重组体。 （2）EcoR和 BamH酶切鉴定。 实验结果 1．突变的人胰岛素原CDNA测序结果见后。 2．突变的人胰岛素原质粒逆转录病毒载体重组质粒的构建： （1）Hpa＼BamH分别对应在p以SN（5．gkb）的 1477hp ＃149fop的位点，双酶切pLXSN后，电泳回收得到5860hp的片段，结果见图5。 （2）Sal、BamH分别对应在PMD18－T（2．7kb）的33hP 和452hP的位点，S＊ 酶切携有 MPINS的PMD18－T载体，BKL后再用BamH酶切，电泳回收得到418hp的片段，与标准分子量对照后证实含有MPINS，见图6。 3·PLXSN－MPINS重组体的鉴定： ＊）PCR鉴定重组体：连接物经扩增，电泳后出现清晰条带，见图7。 p）酶切鉴定插人方向：BamH上coR等限制性内切酶酶切得到5860hP和418hP两个片段的为单正向重组体，见图8。 讨 论 逆转录病毒载体（RV）介导的基因转移技术是一种高效的转 ·2·染技术，通过该载体的协助，目的基因进人靶细胞。RV不仅能高效转染，而且能将目的基因整合进宿主菌的染色体中，随着宿主菌的分裂将目的基因传递给下一代，这种技术在基因治疗中很常见。 pLXSN是一种源于MoMLV的新型载体，经重新构建而成，按照结构分是属于带有内部启动子的w。载体。它的结构基因gag，env0 等被删出，而且gag的翻译基因的起始密码子ATG被终止密码子TAG所取代。将5端MOMLV序列用相应的小鼠肉瘤病毒（MOMSV）的序列片段代替，这样就进一步降低了同源重组的概率，使逆转录病毒载体介导的基因转移隐患大大降低，具有较高的安全性。有些学者利用PLXSN载体已成功地报道了对ADA下DNF。凝血因子Vlll等进行了基因转移及表达的研究。 前胰岛素原是在胰岛的p细胞内合成的，前胰岛素原在内质网由于共同转录信号序列被去除而形成胰岛素原，以后进人高尔基器，在前激素转化酶（PC。和PC＊的作用下，裂解出C肽，合成成熟的胰岛素川链和A链的复合体厂体内非p细胞不含PC。和PC。酶，因而不能合成成熟的胰岛素而分泌到细胞外。我们通过分子生物学的基因点突变技术，使人胰岛素原基因的B－C链与C－A链连接处的H元碱变成四元碱，从而可被非p细胞内普遍存在的i n酶所识别和剪切，合成成熟的胰岛素分泌到细胞外，参与糖尿病患者体内糖代谢的调节。而以往糖尿病的基因治疗模型中，虽可测到靶细胞内的胰岛素水平，但因不能分泌到靶细胞外或靶细胞外仅有少量成熟的胰岛素表达，而主要表达为胰岛素原，从而限制了其应用。 本实验利用逆转录病毒pChSN作为载体，与携有人突变的胰岛素原基因的载体PMD18－T具有共同的酶切位点BamHI，用限制性内切酶将两者分别切开，再运用分子生物学重组技术构成新质粒，该质粒既可使逆转录病毒的RNA基因的DNA拷贝稳定整合进被感染细胞的染色体中，使突变的胰岛素原基因稳定羡达胰 ·3·岛素并可将成熟胰岛素分泌到细胞外。从两方面为进一步实验奠定基础。 结 论 1．可运用基因重组技术构建突变的胰岛素原基因逆转录病毒重组体。 2．酶切电泳及PCR鉴定重组体中突变的胰岛素原基因克隆及插人方向正确，构建的新质粒可为进一步试验奠定基础。(本文来源于《中国医科大学》期刊2002-04-01）
突变人胰岛素原基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景:目前糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第叁大死亡疾病,它是一种影响体内胰岛素和糖含量的疾病,共有两种主要类型,分别为Ⅰ型和Ⅱ型,其共同特征是胰岛β细胞损伤或不能产生足够的胰岛素或机体不能有效的利用胰岛素,所以胰岛素就被作为治疗糖尿病的特效药应用于临床。由于随时需要注射胰岛素,给患者带来了极大的不便,目前国际上对糖尿病患者进行胰岛移植和基因治疗研究成为了热点。但面临的主要问题是供体不足,免疫排斥,胰岛素基因的转染效率和表达调控等。人脐带来源的间充质干细胞可以较易获得和纯化,并且易于基因修饰,可以将外源性基因转染间充质干细胞,建立一种安全的基因治疗的“细胞载体”。研究表明间充质干细胞还有免疫抑制功能,它不但在体外可以抑制T淋巴细胞增殖反应,在体内实验中也表现出了类似免疫抑制剂的作用,所以利用它作为细胞载体可以避免免疫排斥问题。并且我们利用基因重组的方法将胰岛素原基因进行改造,使其可以在非β细胞(间充质干细胞)中高效表达。相信我们的研究可以为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一些有力的实验依据。目的:将人胰岛素原基因进行两个部位的突变,通过腺病毒介导将其转染到人脐带间充质干细胞中,研究其表达分泌人胰岛素的能力。方法:应用RT-PCR的方法从健康流产胎儿胰腺组织中扩增pINS的cDNA序列,利用重迭延伸PCR方法对pINS基因在A链-C肽和C肽-B链的连接处进行两个部位的突变,产生Furin蛋白酶酶切位点。采用AdEasy~(TM)系统构建重组腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP。分离培养人脐带间充质干细胞,并对其生长特性,免疫表型,分化能力及Furin蛋白酶的表达进行鉴定。pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP感染人脐带间充质干细胞后,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测它们的感染效率,并确定最佳的感染复数(multiplicities of infection,MOI)。以感染复数为100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人脐带间充质干细胞1、3、5、7、10天后,RT-PCR检测人胰岛素原基因在人脐带间充质干细胞中表达;Western blot检测成熟人胰岛素和人C-肽在人脐带间充质干细胞中的表达;免疫荧光实验检测感染后48小时人胰岛素在人脐带间充质干细胞中的表达:ELISA实验检测感染后1、3、5、7、10天人胰岛素和人C-肽的分泌。结果:自健康流产胎儿胰腺组织中扩增出364 bp的pINS cDNA,连接入穿梭质粒中,构建重组腺病毒。pAdINS-M2经扩增纯化后滴度达到2.57×10~(10) PFU/mL,pAdINS的滴度为1.25×10~(10)PFU/mL,对照病毒AdGFP为4.85×10~9 PFU/mL。成功的从脐带组织中分离培养出间充质干细胞,绘制生长曲线,约3天扩增一代。细胞周期检测,大部分细胞都处于G0-G1期(占94.39%),小部分处于G2-M期(4.15%)和S期(1.45%)。在合适的诱导培养条件下,分离培养的人脐带间充质干细胞能够分化为脂肪细胞和成骨细胞。应用RT-PCR方法在人脐带间充质干细胞中检测到了Furin蛋白酶的存在,表明我们构建的含Furin蛋白酶酶切位点的人胰岛素原基因在此细胞中可以被切割产生成熟的人胰岛素。通过重组腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP以不同感染复数感染人脐带间充质干细胞,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,确定MOI 100为最佳的感染复数。以MOI=100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人脐带间充质干细胞1、3、5、7、10天后,RT-PCR方法检测到在pAdINS和pAdINS-M2感染的UC-MSCs中人胰岛素原基因都有表达;Western blot的结果显示pAdINS感染的UC-MSCs表达人胰岛素原,而pAdINS-M2感染的UC-MSCs中检测到了人胰岛素和C.肽,pAdGFP感染的UC-MSCs中两者都没有检测到表达。免疫荧光也检测了pAdINS-M2感染后48小时人胰岛素和C-肽在人脐带间充质干细胞胞浆中表达:ELISA检测感染后1、3、5、7、10天培养上清中人胰岛素和C-肽的浓度。结果显示,自感染后24小时目的基因就开始表达,第3-5天表达量达高峰,一周后表达有所下降。与RT-PCR和Western blot结果一致。结论:成功构建含有Furin蛋白酶切位点的人胰岛素原基因腺病毒重组体(pAdINS-M2);分离培养了人脐带源间充质干细胞,并对其进行了鉴定;重组腺病毒pAdINS-M2感染人脐带间充质干细胞后,表达分泌成熟人胰岛素和C-肽。可以为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一些有力的实验依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
突变人胰岛素原基因论文参考文献
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