一、腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达（论文文献综述）
史珣贝[1]（2017）在《腺相关病毒鼓阶转染小型猪耳蜗研究》文中研究表明目的1.研究AAV1在以大型哺乳动物猪中的转染情况,通过与AAV1转染豚鼠耳蜗对比发现AAV1在小型猪中的转染与啮齿类动物的区别;2.构建过表达mitf腺相关病毒载体,为未来以小型猪作为动物模型的Waardenburg综合征基因治疗及在mitf基因突变疾病的基因治疗中奠定基础。方法1.通过AAV1型病毒载体CAG启动子携带GFP报告基因,利用圆窗膜穿刺方式将病毒从鼓阶导入小型猪耳蜗细胞,观察1w,2w,3w,4w这四个不同时间点上绿色荧光蛋白的表达情况,发现GFP在耳蜗中的表达的效率具有时间相关性。同时,我们观察在四个不同的时间点上,绿色荧光蛋白表达的细胞类型。同时,选取300-350g健康豚鼠,利用相同方法,观察腺相关病毒在豚鼠中的转染情况,通过与AAV1转染豚鼠耳蜗对比发现AAV1在小型猪中的转染与啮齿类动物的区别;2.通过PCR方法获取目的基因mitf,采用细胞内质粒DNA同源重组法进行重组腺相关病毒载体构建,利用柱纯化法纯化病毒载体,q PCR法测定重组腺相关病毒载体滴度,病毒载体感染HEK293细胞进行病毒有效性及安全性鉴定,real-time PCR与western blot法进行mitf表达的鉴定。结果1.小型猪与豚鼠耳蜗转染的主要区域均为内毛细胞,外毛细胞区域几乎未发现表达GFP。除内毛细胞外,主要表达的支持细胞有Hensen’s细胞、内柱细胞、外柱细胞,同时表达在螺旋缘及螺旋韧带中。小型猪与豚鼠表达GFP阳性细胞主要以底回为主,从底回到顶回表达逐渐减少,在顶回几乎没有出现成功转染。小型猪与豚鼠从2w开始底回内毛细胞表达,1w未出现耳蜗任何细胞表达GFP蛋白。小型猪表达高峰为3w,豚鼠表达高峰为2w。2.PCR获取目的基因mitf,DNA测序结果显示克隆mitf基因与正常mitf基因序列一致,DNA病毒滴度为1.0*10^12vg/ml。重组腺相关病毒载体转染HEK293细胞,提示病毒载体具有安全性及有效性。Real-time PCR及western blot检测重组腺相关病毒载体可以转录出mitf m RNA及MITF蛋白。结论1.本次实验首次利用小型猪作为耳聋基因治疗模型,将腺相关病毒载体鼓阶转染在小型猪耳蜗中有效表达,证实了AAV1携带基因在小型猪耳蜗中表达的细胞类型及随时间改变的情况,并且发现了基因表达在耳蜗细胞中随时间变化中小型猪与豚鼠的不同之处。2.本次研究首次成功构建过表达mitf重组腺相关病毒载体,同时可以有效转录出正常mitf基因的m RNA并且可以表达出正常的MITF蛋白,这一载体的构建不仅为白化荣昌猪遗传性耳聋的基因治疗提供基础,也为未来进行MITF突变导致的其他遗传性疾病的基因治疗提供新思路。
蔡文君,谭长强[2]（2015）在《腺病毒介导的白细胞介素-10治疗自身免疫性内耳病的实验研究》文中研究说明目的研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的白细胞介素-10（IL-10）对豚鼠自身免疫性内耳病的治疗作用。方法采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠,制作自身免疫性内耳病动物模型20只,随机分为3组,采用圆窗膜微量注射的方式,A组（10只）注入携带IL-10因子的重组腺病毒（Ad-IL-10）,B组（5只）注入等量的携带黄色荧光蛋白标记的腺病毒（Ad-EYFP）,C组（5只）注入等量人工外淋巴液（对照组）,7天后行ABR测试,然后取豚鼠耳蜗制做石蜡切片,行HE染色和光镜观察,并行免疫荧光和酶免疫组织化学试验,检测豚鼠内耳基因产物IL-10表达。结果免疫组化显示携带IL-10的腺病毒可以转染耳蜗血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞,并产生相应的蛋白产物（IL-10）。造模后各组豚鼠ABR反应阈较造模前升高,差异有统计学意义（P<0.05）,内耳注射后A组ABR反应阈明显低于B组和C组。光镜检查示A组内耳组织的免疫炎性反应亦明显较B组和C组轻。结论腺病毒可以携带IL-10因子转导入豚鼠内耳,并在内耳表达基因产物,可在一定程度上减轻内耳组织免疫炎性损伤和听损伤。
吴学文,孙虹[3]（2013）在《内耳基因治疗的研究进展》文中研究说明由于先天性异常、后天性损伤如病毒性疾病和耳毒性药物以及老年退行性变等原因,内耳疾病患者不断增多。内耳疾病主要表现为听力下降和眩晕,重者导致语言交流障碍和行动困难,是一类严重影响人类正常生活的常见难治性、致残性疾病。内耳疾病的病理以耳蜗和/或前庭感觉上皮的细胞（如毛细胞和支持细胞）及神经元不同程度受损为主,在临床上表现为各种感音神经性聋（如遗传性聋、突发性聋、噪声性聋、药物性聋、老年性聋和自身免疫性聋等）及各类前庭周围性眩晕（如梅尼埃病）等。
毛小波[4]（2013）在《Nob1在耳蜗毛细胞损伤中的作用研究》文中认为背景感音神经性耳聋是导致言语交流障碍的一种常见疾病，严重影响患者的生活质量。尽管目前临床上治疗感音神经性耳聋的策略有很多，但治疗效果不佳。明确耳蜗细胞损伤的分子调控网络，寻找有效防治耳聋的目的基因，阻止诱导毛细胞凋亡的信号分子，成为未来耳聋基因治疗新的方向。本研究团队首次发现Nob1在哺乳动物受损耳蜗细胞中高表达，但这一表达变化的具体规律、机制及在感音神经聋中所起的作用还不清楚。目的本研究主要探寻Nob1在出生后大鼠耳蜗内的表达规律，拟利用基因转染技术改变Nob1在耳蜗毛细胞中的表达，借助体内外实验研究Nob1对耳蜗毛细胞生物学行为的影响及与耳蜗毛细胞损伤之间的关系，以期证明Nob1基因是一个新的候选耳聋基因，为深入理解耳蜗毛细胞损伤的分子事件，探讨新的治疗方法奠定基础。方法通过免疫组织荧光技术、Weatern-blot及实时定量PCR技术，观察Nob1在出生后大鼠耳蜗内的表达规律。构建含Nob1基因的慢病毒干扰载体（Nob1-RNAi-GFP-LV）以及腺病毒过表达载体（Ad5-Nob1-mCMV-EGFP），将病毒载体转染至体外培养的HK-2细胞系，上调以及下调Nob1基因表达，探寻Nob1与凋亡之间的关系。在体外行离体耳蜗器官培养，利用顺铂诱导离体耳蜗毛细胞损伤后，观察Nob1在毛细胞中的表达情况，并转染慢病毒干扰载体（Nob1-RNAi-GFP-LV），用RT-PCR和Westernblot鉴定病毒的转染及Nob1表达情况。最后在大鼠体内进一步验证Nob1在耳蜗毛细胞损伤中的作用，从耳蜗中阶入路分别将Nob1-RNAi-GFP-LV干扰载体、慢病毒空载体和人工内淋巴液注射入三组大鼠耳蜗，待RNAi发挥作用后，利用顺铂诱导大鼠耳蜗损伤，分别用ABR评估各组病毒载体注射前后大鼠听力变化；通过基底膜铺片观察毛细胞的形态变化，并采用全耳蜗毛细胞定量分析系统行耳蜗毛细胞计数，Western-blot及实时定量PCR方法进一步明确相关分子的表达变化。结果Nob1在大鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经元中有表达，在细胞发育增殖分化高峰期比较弱，出生后随着时间的增加而逐渐增强。当毛细胞分化，内外毛细胞形成，大、小上皮嵴开始分化形成各种支持细胞时，Nob1表达较新生时期明显增强。我们成功构建含Nob1基因的慢病毒干扰载体（Nob1-RNAi-GFP-LV）以及腺病毒过表达载体（Ad5-Nob1-mCMV-EGFP），在体外培养HK-2细胞系中成功上调及下调Nob1基因，通过流式细胞仪检测到上调Nob1表达后的凋亡细胞数明显高于下调Nob1基因表达组。在体外培养的耳蜗器官组织中，通过低浓度顺铂成功诱导耳蜗毛细胞凋亡，发现Nob1在部分细胞核固缩的凋亡毛细胞细胞核中表达，出现核转位现象。随着顺铂作用时间的增加，毛细胞的损伤逐渐加重，Nob1表达也逐渐增高，Western-blot结果与免疫组织荧光结果一致。在体外培养的耳蜗器官组织中，慢病毒干扰载体无法转染至耳蜗毛细胞，只能转染至螺旋神经元。通过耳蜗中阶注射，将慢病毒干扰载体成功转染至耳蜗外毛细胞、血管纹边缘细胞及螺旋韧带处。外淋巴内可见少量慢病毒颗粒分布，而内毛细胞处及螺旋神经元处未见病毒分布。最后，在体内慢病毒干扰可下调Nob1基因表达，再给予顺铂诱导耳蜗毛细胞损伤后，与对照组相比，下调Nob1基因组的大鼠耳蜗听力阈值降低，耳蜗毛细胞损伤程度也降低。结论Nob1可能通过凋亡信号分子通路参与了耳蜗器官的形成，在顺铂诱导的耳蜗毛细胞损伤中，Nob1可能参与了耳蜗毛细胞的凋亡过程。抑制Nob1基因后可以通过凋亡信号通路，降低顺铂所诱导的大鼠听力损伤，从而减少耳蜗毛细胞的破坏。
韩宇[5]（2010）在《c-Myc在噪声条件下对耳蜗毛细胞的作用及分子机制》文中指出【背景】随着工业化进程的加快,感音神经性耳聋已逐渐成为影响公众健康的重要社会问题之一。过度的噪音暴露可导致内耳机械性和代谢性损伤,严重影响了人类的生活质量,并且最终可导致噪声诱导的听力降低甚至缺失。然而,哺乳动物耳蜗毛细胞为特化终末细胞,损失后其再生能力十分有限,这也是导致永久性听力损失的原因。因此,发现新的哺乳动物内耳调控基因,阻止诱导毛细胞凋亡的信号分子很可能为感音神经性耳聋的治疗带来曙光。原癌基因c-myc是快速早期反应基因,其编码的细胞核蛋白调控细胞周期由G1期进入S期。通常认为c-myc基因在许多生物过程中发挥了重要作用,包括胚胎发育、细胞增殖、分化及凋亡等。此外,据报道静止细胞重返细胞周期过程中,c-myc基因起到募集转录因子的重要功能。该基因虽然如此重要,但在哺乳动物耳蜗中的研究却未见报道。因此,阐明c-myc基因在耳蜗中的作用为哺乳动物耳蜗毛细胞再生提供新的思路。【目的】探讨c-myc基因在噪声条件下对豚鼠听功能及耳蜗毛细胞形态的作用及其可能的分子机制。【方法】构建含c-myc基因的腺病毒表达载体（Ad.c-myc-EGFP）,并通过耳蜗冰冻切片观察报告基因表达和Western blot方法鉴定转染后c-Myc表达量的变化。于噪声暴露前4天通过耳蜗显微注射术将Ad.c-myc-EGFP注射入豚鼠耳蜗鼓阶内,并以空白腺病毒载体（Ad. EGFP）做对照。将各组豚鼠暴露于110 dB SPL的白噪声,频谱分析能量集中在0.25-6.4kHz,主要集中在4 kHz左右,8 h/day,连续7天。分别在噪声暴露前及噪声暴露后的第7天通过听性脑干反应（ABR）检测豚鼠听功能的情况,并利用基底膜铺片和扫描电镜等方法观察耳蜗毛细胞形态及超微结构的变化。通过基因芯片和生物信息学分析进一步探讨噪声对哺乳动物内耳基因表达谱的影响,并利用实时定量PCR验证基因芯片的结果;通过Tunel染色评估凋亡在噪声性损伤中的作用;利用免疫组化方法观察筛选到的目标基因在耳蜗中的表达与定位,从而推测c-myc基因在噪声条件下可能发挥作用的分子机制。【结果】成功构建了Ad.c-myc-EGFP腺病毒载体,并证明它可以有效干预耳蜗内c-Myc蛋白的表达水平。通过体内实验观察了c-myc基因对耳蜗的作用,主要表现为:相同噪声暴露后,Ad.c-myc-EGFP注射组听阈提高显着低于Ad.EGFP组;Ad.c-myc-EGFP注射组外毛细胞形态改变及纤毛缺失率明显低于Ad.EGFP注射组;扫描电镜观察亦表明Ad.c-myc-EGFP注射组外毛细胞超微结构损伤程度明显小于Ad.EGFP对照组。本实验进一步利用基因芯片探讨噪声所致内耳分子的变化:噪声可以导致539个基因发生变化,其中279个基因上调,260个基因下调。通过生物信息学分析:这些差异基因主要涉及免疫系统、应激、生物代谢、节律调节及凋亡等相关基因。实时定量PCR鉴定了差异基因倍数大于5倍以上以及与免疫调节相关的基因,结果表明9种基因与基因芯片的趋势相一致,上调的有Reg3b,Lcn2,Nob1,Serpina3n,Hamp,Lbp,C3;下调的为Myh4,F2。Tunel染色观察表明:噪声可以诱导耳蜗内、外毛细胞及螺旋神经节细胞发生凋亡。因此,我们推测c-myc基因在噪声条件下对豚鼠听力及耳蜗毛细胞损伤的推迟作用很可能是由于c-myc基因上调了保护性基因而下调了诱导耳蜗细胞凋亡基因的表达而发挥作用,但c-myc基因与这9种分子在耳蜗细胞内的具体调节方式及作用关系还有待进一步阐明。此外,我们进一步利用免疫组化观察到Nob1基因编码蛋白在噪声暴露后大鼠耳蜗内呈阳性表达,阳性细胞主要集中在螺旋神经节和内、外毛细胞;血管纹细胞也有少量表达;而噪声暴露前耳蜗内未见Nob1蛋白的明显表达。因此,推测Nob1基因作为转录因子可能参与耳蜗内基因的调控,是一个新的内耳调控基因,其作用及功能有待深入研究。【结论】c-myc基因减弱了噪声诱导的豚鼠听功能损伤及毛细胞形态的改变,并可能通过调节Reg3b,Lcn2,Nob1,Serpina3n,Hamp,Lbp,C3,Myh4,F2基因及凋亡相关分子发挥作用。
杨仕明[6]（2009）在《听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略》文中提出听觉损伤可引起耳蜗毛细胞和听觉神经元的不可逆性损伤,从而导致永久性的感音神经性耳聋。虽然内耳所独具的结构是基因治疗非常独特和重要的靶器官,但能否实现损伤后毛细胞的再生是其前提条件。国内外研究者们做了大量的探索并取得重要突破,从非哺乳动物到哺乳动物毛细胞再生,从前庭毛细胞到耳蜗毛细胞再生,从未成熟期到成年期毛细胞再生,从离体培养毛细胞再生到在体毛细胞再生,整整经历了近半个世纪。但是毛细胞的再生并不等同于听力完全恢复。针对内耳基因治疗时间窗问题,我们根据听觉损伤后不同的病理状态,提出听觉损伤后毛细胞再生和基因治疗的基本策略:（1）毛细胞纤毛损伤阶段,是基因治疗的最好时机,通过完全修复或纤毛再生达到功能的完全或部分恢复;（2）内耳毛细胞虽有损伤但没有坏死,支持细胞和神经纤维基本正常,所以有恢复形态和功能的机会,这个阶段导入Math1基因应该有效,是基因治疗的最关键时机;（3）毛细胞严重损伤但支持细胞尚存,是毛细胞再生的抢救阶段,而且还可以争取在Corti器细胞构架没有塌陷之前进行干细胞导入,所以这个阶段内细胞移植可能有效地实现听力恢复;（4）Corti器完全失去构架,仅仅残留上皮层或瘢痕化,基因导入完全无效,即使干细胞导入也会面临困难,如何重塑Corti器构架是巨大挑战。为了实现耳聋基因治疗临床应用的可能性,我们还探索了最有效简便的外源基因内耳导入方式以及高效安全可靠的基因载体比如纳米载体的研发。毛细胞再生研究已经取得突破性进展,但还面临诸多挑战。通过不懈的努力,聋病基因治疗的最终临床应用一定会实现。
陈伟,郭维维,胡吟燕,孙建和,于宁,李兴启,翟所强,韩东一,杨伟炎,杨仕明[7]（2009）在《Math1基因内耳导入径路的探索研究》文中研究表明目的研究腺病毒携带Math1-EGFP基因经完整圆窗膜途径及鼓阶打孔途径导入耳蜗后对听功能和转导效率的影响,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法健康成年白色红目豚鼠40只,雌雄不限,体重250～300g。随机分成四组,完整圆窗膜组12只,鼓阶打孔组12只,各组分别设对照8只。实验组（24只）导入重组腺病毒携带的Math1基因及增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）,对照组（16只）导入人工外淋巴液,所有动物均以左耳作为导入耳。术前及术后分别行听性脑干反应（ABR）检查。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片观察基因表达情况。结果完整圆窗膜组导入耳ABR阈值,术后5天各频率与术前比较无显着性差异（P>0.05）;鼓阶打孔组导入耳ABR阈值,术后5天在2kHz、4kHz与术前比较无差异（P>0.05）,8kHz较术前增高（P<0.05）,16kHz、20kHz较术前明显增高（P<0.01）,术后14天在16kHz、20kHz较术后5天时明显好转（P<0.01）,但较术前仍有增高（P<0.05）。转导成功率鼓阶打孔组为91.6%,优于完整圆窗膜组的50%。两种转导途径对目的基因在耳蜗内的表达部位和表达时间没有显着影响。结论完整圆窗膜途径及鼓阶打孔途径在转导成功率及听功能保护方面各有优劣。完整圆窗膜途径因其对耳蜗的损伤极小,在临床应用方面具有更好的发展前景。
蔡文君[8]（2009）在《免疫调节基因内耳局部应用治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究》文中研究指明目的:以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体（Fas-Ligand,即FasL）基因和白介素10（IL-10）基因内耳局部应用,探索和研究治疗自身免疫性感音神经性聋的作用和效果。方法:采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠,造成自身免疫性感音神经性聋（autoimmune sensorineural hearing loss, ASNHL）的动物模型28只,按配对设计将其分为四组。通过鼓阶微量注射的方式,A组注入携带FasL基因的腺病毒（Ad-FasL）,B组注入携带IL-10基因的腺病毒（Ad-IL-10）,C组单纯注入腺病毒。腺病毒均携带报告基因黄色荧光蛋白,即Ad5-EYFP。D组（实验对照组）注入等量的磷酸盐缓冲液。基因导入七天后行听性脑干诱发电位（ABR）测试,后取颞骨制做石蜡切片,并行HE染色和光镜观察,每组各取1只（两耳）行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察。每组各取3只（6耳）行内耳光镜观察和免疫组织化学试验,以检测腺病毒转染和导入基因产物表达情况。结果:免疫组织化学结果显示,携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞,并在这些部位产生相应的蛋白产物（IL-10和FasL）。ABRⅢ波阈值的均值对比结果显示:A组和B组明显低于C组和D组,内耳光镜观察发现组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻。结论:重组复制缺陷型腺病毒可以携带免疫调节的目的基因转导入内耳,并在内耳表达基因产物（IL-10和FasL）。免疫调节基因的产物可发挥其抑制炎症反应的作用,从而有效地减轻ASNHL的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍,有望成为治疗自身免疫性内耳疾病新的方法和途径。
韩朝,迟放鲁,黄一波,李雯,沈云珍,高文元[9]（2009）在《两种内淋巴给药方式对豚鼠耳蜗功能和形态的影响》文中进行了进一步梳理目的观察经耳蜗侧壁打孔（侧壁径路）和经圆窗膜、基底膜穿刺（双膜径路）两种内淋巴系统给药方式对豚鼠耳蜗整体形态结构和功能的影响并比较两种方式的优劣。方法 40只正常健康杂色豚鼠分为A、B两组（每组20只）,所有动物左侧为给药耳,右侧为非给药耳。A组采用侧壁径路进入中阶灌注携带增强型绿色荧光蛋白基因的5型重组腺病毒（adenovirus5-enhanced greenfluorescence protein,Ad5-EGFP）5μl;B组采用双膜径路进入中阶灌注AdS-EGFP 5μl。给药前后行听性脑干反应（ABR）测试,观察听功能改变。耳蜗冰冻切片直接荧光观察腺病毒分布,HE染色观察手术径路的愈合情况。基底膜铺片鬼笔环肽染色观察毛细胞受损情况,扫描电镜观察局部损害情况。结果所有动物术后均存活。穿刺部位修复良好,耳蜗的完整性得以保持。EGFP在Corti器和血管纹内壁细胞内标记明显,表明两种给药径路都可以将药物成功注入内淋巴系统。A组证实成功14只（70%）,手术前后ABR反应阈（声压级）变化[（33.1±10.3）dB]与对侧非给药耳[（9.4±3.9）dB]比较差异具有统计学意义（F=46.34,P=0.0005）;B组证实成功8只（40%）手术前后阈值改变[（2.5±3.8）dB]与对侧耳[（2.5±3.8）dB]比较差异无统计学意义（F=0.00,P=1.000）。两种方法在部分动物中都有药物渗漏入外淋巴的现象,给药局部产生炎性反应,侧壁径路对毛细胞的损害范围大于双膜径路。结论两种手术径路都可将药物成功注入豚鼠耳蜗的内淋巴系统中,局部有炎性反应,术后耳蜗的完整性可以获得完全恢复。侧壁径路对豚鼠耳蜗毛细胞缺失和ABR反应阈的影响大于双膜径路,但是经侧壁径路进入中阶的手术成功率高于双膜径路,选择何种灌注径路需根据实验求来定。
陈观贵[10]（2009）在《BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用》文中研究指明第一章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达目的骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）易于分离扩增,具备多方向分化潜能,免疫源性低,可自体移植,并且有良好迁移性,暗示其在基因治疗中可能成为有价值的运载细胞。本章利用非病毒载体介导脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）转染MSCs,观察细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞,为进一步体内研究提供基因工程细胞来源。方法取豚鼠的骨髓进行MSCs的分离、培养和流式细胞仪鉴定。通过比较两种非病毒载体转染方法（脂质体法和电穿孔法）,选择较好的方法介导pcDNA3.1（-）-BDNF转染MSCs并经优化浓度的G418筛选建立基因工程细胞,转染后48小时（瞬时表达）和筛选后（稳定表达）用免疫组化检测BDNF基因表达情况,RT-PCR进一步验证目的基因表达情况。结果成功培养MSCs,流式细胞鉴定显示各细胞表面标志表达率分别为CD44:94.65%、CD34:4.37%、CD45:7.81%。免疫组化显示脂质体介导转染的BDNF瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法瞬时表达阳性率约为24.29%。脂质体法转染筛选14天后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染成功扩大培养并建立工程细胞（BDNF-MSCs）,免疫组化显示BDNF阳性表达率达90%,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。结论用电穿孔法成功建立BDNF基因修饰MSCs的工程细胞,并用免疫组化和RT-PCR方法证实了工程细胞具备体外表达目的基因功能。第二章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞正常豚鼠内耳移植的实验研究目的BDNF基因修饰MSCs（BDNF-MSCs）是治疗神经退变性疾病包括感音神经性聋的潜在有效方法,但首先要明确以下三个问题:一是手术及细胞移植对耳蜗功能及结构是否造成不良影响;二是基因修饰的MSCs在耳蜗内存活和分布情况如何;最后是移植细胞在耳蜗内是否能较长时间维持表达目的基因的能力。目前还没有转基因MSCs内耳移植的报道,在此部分我们将在正常豚鼠耳蜗中对这些问题进行初步的探讨。方法正常豚鼠分3组,组Ⅰ:为空白对照组,组Ⅱ:经鼓阶开窗注射MSCs,组Ⅲ:经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs。移植细胞均经DAPI荧光标记。3个组的动物均在术前1d、术后7d及术后28d分别行ABR检测,比较各组术前、术后的ABR阈值变化;分别取术后7d及28d各组动物的耳蜗石蜡切片HE染色观察耳蜗结构;荧光显微镜观察移植细胞存活及分布;免疫组化方法检测BDNF在耳蜗内的表达情况。结果经鼓阶开窗移植细胞导致术后7d时ABR阈值的暂时性提高,术后28d后恢复至正常水平。耳蜗石蜡切片HE染色显示实验动物耳蜗内结构无明显异常改变。组Ⅱ和组Ⅲ术后7d耳蜗切片可见荧光信号多分布于耳蜗底周的外淋巴腔（鼓阶和前庭阶）,极少量细胞能迁移到中阶及蜗轴,术后28d移植细胞存活数量有所下降,但两组动物的移植细胞存活时间均超过28d,并且BDNF基因修饰MSCs能提高移植细胞术后28d时的存活率。免疫组化显示组Ⅲ部分移植细胞表达BDNF,术后28d的阳性表达率比术后7d有显着性下降,而其余两组无阳性染色。结论经鼓阶开窗移植MSCs对听力的损害是轻微（<10dB SPL）和暂时的（<28d）。移植后光镜下耳蜗形态结构没有明显变化。移植细胞能存活并分布于耳蜗内各周,主要在耳蜗底周的外淋巴腔,BDNF基因转染MSCs后可以提高移植细胞的存活率。基因修饰的MSCs能在正常耳蜗内维持表达BDNF至少28d,暗示了MSCs可用作细胞载体向内耳输送BDNF治疗感音神经性聋。第三章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞在致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经元的保护作用目的多种因素包括神经营养因子减少、噪音、缺血、耳毒性药物等均会导致内耳毛细胞和螺旋神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）的直接或间接的死亡,细胞死亡主要以凋亡的形式。在前面已证明BDNF基因修饰MSCs具备体外及正常耳蜗内表达BDNF的能力,并可以在内耳中存活至少28d,本章中将进一步分析工程细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达水平（荧光定量RT-PCR）及对SGNs的保护作用。方法阿米卡星致聋的豚鼠随机分两组。实验组经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs,对照组注射外淋巴液。每组均在7d及28d处死动物。荧光定量RT-PCR检测两组动物不同时间点的耳蜗组织BDNF的表达差异,并取耳蜗组织切片行TUNEL检测SGNs凋亡。结果实验组在术后7d和28d的BDNF表达量均显着性高于对照组,实验组术后7d的BDNF表达量是对照组的107倍,术后28d下降为33倍。实验组术后7d及28d的耳蜗SGNs凋亡指数均比对照组有显着性下降。结论药物致聋豚鼠内耳移植的BDNF基因工程细胞能维持表达长达28d,并能显着减少SGNs的凋亡。
二、腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达（论文提纲范文）
（1）腺相关病毒鼓阶转染小型猪耳蜗研究（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗 |
| 1.2 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗 |
| 1.3 重组腺相关病毒的构建与鉴定 |
| 2. 方法 |
| 2.1 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗 |
| 2.2 AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗 |
| 2.3 重组腺相关病毒的构建与鉴定 |
| 结果 |
| 1. AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染小型猪耳蜗 |
| 1.1 不同时间点GFP在小型猪耳蜗内毛细胞上的表达情况 |
| 2. AAV1-GFP通过圆窗膜穿刺鼓阶转染豚鼠耳蜗 |
| 2.1 不同时间点GFP在豚鼠耳蜗内毛细胞上的表达情况 |
| 2.2 AAV1-GFP对豚鼠耳蜗细胞毒性 |
| 2.3 AAV1-GFP在小型猪鼓阶中转染特点及豚鼠研究对比 |
| 3. 重组腺相关病毒的构建与鉴定 |
| 3.1 重组腺相关病毒AAV-MITF的构建及鉴定 |
| 3.2 重组腺相关病毒AAV-MITF的滴度测定 |
| 3.3 重组腺相关病毒AAV-MITF感染HEK293细胞 |
| 3.4 MITF基因Real-time PCR鉴定及Western blot鉴定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）腺病毒介导的白细胞介素-10治疗自身免疫性内耳病的实验研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（3）内耳基因治疗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 致残性内耳疾病及其流行病学资料 |
| 2 内耳基因治疗的发展历史 |
| 3 内耳基因治疗的研究现状 |
| 3.1 内耳基因治疗因子 |
| 3.2 内耳基因治疗载体 |
| 3.2.1 病毒型载体 |
| 3.2.2 非病毒型载体 |
| 3.3 内耳基因治疗给药途径的研究现状 |
| 4 展望 |
（4）Nob1在耳蜗毛细胞损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 Nob1 在出生后大鼠耳蜗发育中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 标本取材 |
| 2.2 免疫荧光染色 |
| 2.3 Real-time PCR 方法 |
| 2.4 Western-Blot 方法 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠出生后耳蜗的形态发育 |
| 3.2 Nob1 在出生后大鼠耳蜗发育中的表达 |
| 4 讨论 |
| 实验二 Nob1 shRNA 慢病毒干扰载体及重组 5 型腺病毒过表达载体构建与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒构建、宿主菌、实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 Nob1 shRNA 慢病毒干扰载体构建及鉴定 |
| 2.2 Nob1 重组 5 型腺病毒过表达载体构建与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nob1 shRNA 慢病毒表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2 Nob1 重组 5 型腺病毒过表达载体构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 实验三 HK-2 细胞系中观察 Nob1 与细胞凋亡的关系 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株与病毒载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验器材及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫细胞荧光染色检测 HK-2 细胞中 Nob1 蛋白表达 |
| 2.3 慢病毒感染 HK-2 细胞并确定转染效率 |
| 2.4 重组 5 型腺病毒转染 HK-2 细胞并确定转染效率 |
| 2.5 细胞实验及分组 |
| 2.6 Western-Blot 检测过表达及干扰后 Nob1 蛋白表达情况 |
| 2.7 流式细胞仪进行细胞凋亡检测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HK-2 细胞培养情况 |
| 3.2 HK-2 细胞中 Nob1 蛋白表达情况 |
| 3.3 慢病毒转染 HK-2 细胞 |
| 3.4 重组腺病毒转染 HK-2 细胞 |
| 3.5 Western-Blot 检测过表达及干扰后 Nob1 蛋白表达情况 |
| 3.6 流式细胞仪进行细胞凋亡检测结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 离体耳蜗器官培养模型的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验器材及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 离体耳蜗器官组织分离培养 |
| 2.2 耳蜗毛细胞染色观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 耳蜗器官组织体外培养情况 |
| 3.2 不同时间点耳蜗 corti 器体外培养情况观测 |
| 4 讨论 |
| 实验五 Nob1 在体外培养耳蜗毛细胞顺铂损伤模型中的表达及转基因实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验器材及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 耳蜗 Corti 器分离培养 |
| 2.2 顺铂对体外培养 Corti 器的损伤模型中 Nob1 的表达 |
| 2.3 慢病毒干扰载体转染体外培养 Corti 器 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 顺铂导致体外培养 Corti 器中毛细胞损伤 |
| 3.2 顺铂对体外培养 Corti 器的损伤模型中 Nob1 的表达 |
| 3.3 慢病毒载体转染体外培养 Corti 器 |
| 4 讨论 |
| 实验六 应用 RNA 干扰下调 Nob1 基因后对顺铂所致大鼠听力及耳蜗毛细胞的损伤的拮抗作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 慢病毒空载体耳蜗内显微注射观察病毒颗粒分布及评估手术创伤 |
| 2.2 观察应用 RNA 干扰下调 Nob1 基因后对顺铂所致大鼠听力及耳蜗毛细胞的损伤的作用 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 显微注射后实验动物一般情况 |
| 3.2 慢病毒分布及转染情况 |
| 3.3 手术损伤比较 |
| 3.4 大鼠耳蜗中 Nob1 慢病毒干扰效果验证 |
| 3.5 Nob1 shRNA 慢病毒显微注射后对顺铂所致大鼠听力及耳蜗毛细胞的损伤的拮抗作用 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）c-Myc在噪声条件下对耳蜗毛细胞的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 c-Myc 腺病毒载体的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二 c-Myc 在噪声条件下对豚鼠听力及耳蜗毛细胞的作用 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 c-Myc 在噪声条件下对耳蜗作用 的可能分子机制 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）Math1基因内耳导入径路的探索研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 动物分组 |
| 1.3 听性脑干反应 (ABR) 阈值测试 |
| 1.4 手术操作 |
| 1.5 耳蜗铺片标本的制作与观察 |
| 1.6 免疫组化方法 |
| 1.7 统计学方法x±s |
| 2 结果 |
| 2.1 术前及术后ABR阈值测试结果 |
| 2.2 术后耳蜗大体改变 |
| 2.3 耳蜗内Math1-EGFP的表达 |
| 3 讨论 |
（8）免疫调节基因内耳局部应用治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述及参考文献 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞正常豚鼠内耳移植的实验研究 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 BENF基因修饰骨髓间充质干细胞在致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经元的保护作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 骨髓间充质干细胞耳蜗内移植的应用进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 耳聋基因治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
四、腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达（论文参考文献）
- [1]腺相关病毒鼓阶转染小型猪耳蜗研究[D]. 史珣贝. 福建医科大学, 2017(07)
- [2]腺病毒介导的白细胞介素-10治疗自身免疫性内耳病的实验研究[J]. 蔡文君,谭长强. 听力学及言语疾病杂志, 2015(06)
- [3]内耳基因治疗的研究进展[J]. 吴学文,孙虹. 听力学及言语疾病杂志, 2013(03)
- [4]Nob1在耳蜗毛细胞损伤中的作用研究[D]. 毛小波. 第四军医大学, 2013(02)
- [5]c-Myc在噪声条件下对耳蜗毛细胞的作用及分子机制[D]. 韩宇. 第四军医大学, 2010(06)
- [6]听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略[J]. 杨仕明. 中华耳科学杂志, 2009(04)
- [7]Math1基因内耳导入径路的探索研究[J]. 陈伟,郭维维,胡吟燕,孙建和,于宁,李兴启,翟所强,韩东一,杨伟炎,杨仕明. 中华耳科学杂志, 2009(04)
- [8]免疫调节基因内耳局部应用治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究[D]. 蔡文君. 南京医科大学, 2009(03)
- [9]两种内淋巴给药方式对豚鼠耳蜗功能和形态的影响[J]. 韩朝,迟放鲁,黄一波,李雯,沈云珍,高文元. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009(04)
- [10]BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用[D]. 陈观贵. 中南大学, 2009(02)