豌豆根瘤菌硫氧还蛋白基因trxs的功能研究

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硫氧还蛋白Thioredoxin（Trx）是一种小的热稳定酸性蛋白,通过其活性部位二硫醇的可逆氧化改变靶蛋白的氧化状态。Trx是细胞中重要的氧化还原蛋白,具有调节细胞抗氧化、抗胁迫、细胞凋亡、DNA结合转录因子活性等功能。根瘤菌是一种好氧革兰氏阴性细菌,与豆科植物能形成共生固氮根瘤。根瘤中的固氮酶对氧极为敏感,因此,根瘤菌需通过防氧屏障来保护固氮酶的活性。通过生物信息分析,在豌豆根瘤菌RL3841（Rhizobium leguminosarum bv.Viciae 3841）基因组中发现3个硫氧还蛋白编码基因:trxA（RL0025）,trxB（RL4571）,trxC（RL4663）。本研究通过基因同源重组和转导技术,构建硫氧还蛋白单、双和三（全）基因突变株,系统研究豌豆根瘤菌硫氧还蛋白在抗氧化和共生固氮中的作用。将trxA、trxB和trxC克隆到根瘤菌自杀载体pK19mob和pJQ200SK上,构建出重组载体pKtrxA、pJQtrxB?Tc和pJQtrxC?Spe。再经三亲本接合实验,将重组质粒整合到豌豆根瘤菌RL3841基因组中。然后利用抗性或蔗糖致死筛选出三个trx单基因突变株RLtrxA、RLtrxB、RLtrxC和双基因缺失突变株RLtrxAtrxB。最后利用噬菌体转导技术构建双基因缺失突变株RLtrxAtrxC和RLtrxBtrxC,以及三基因缺失突变株RLtrxAtrxBtrxC。利用PCR方法扩增出3个硫氧还蛋白结构基因片段,然后将目的片段克隆到pET-28a原核表达载体,转化BL21（DE3）表达菌。SDS-PAGE电泳得到目的条带,TrxA、TrxB、TrxC分别为12 kDa、35.1 kDa、25.7 kDa。以2-硝基苯甲酸（DTNB）为底物测定目的蛋白酶活,通过Michaelis-Menten方程与Lineweaver-Burk曲线得到相应的Km分别为1.86 mmol·L-1、2.0mmol·L-1和1.79 mmol·L-1。在以葡萄糖为唯一碳源的AMS基本培养基中,trxs单基因和双基因突变对根瘤菌生长都没有影响。氧化物胁迫实验结果表明,trxs单基因和双基因突变对不同浓度的无机氧化物H2O2和有机氧化物过氧化氢异丙苯（CuOOH）均不敏感。但是与野生株RL3841相比,trx三基因突变株RLtrxAtrxBtrxC生长显著减慢,并且抗氧化能力显著降低。通过根瘤菌与甜豌豆的盆栽实验,研究了trxs基因在根瘤菌共生固氮中的功能。所有硫氧还蛋白基因突变株形成异常结构的根瘤,其固氮酶活都显著低于野生型RL3841。将4周的突变体根瘤用于石蜡切片及电镜超薄切片,观察根瘤及类菌体形态,发现根瘤形态发生变形,trxs基因突变株根瘤中含类菌体细胞数明显减少,并出现部分类菌体自溶,表明trxs基因在根瘤类菌体分化和防止根瘤过早衰亡中发挥重要作用。利用实时荧光定量RT-PCR检测trx相关基因的mRNA表达水平,结果显示,在1 mM H2O2胁迫条件下,所有三个trxs单基因突变株和三基因突变株中的应激反应基因orhB,katE,katG都上调,这些结果表明,trxs基因突变会改变细胞内的氧化还原状态,并增加相关抗氧化酶的表达。相反,RLtrxA,RLtrxB,RLtrxC和RLtrxAtrxBtrxC等突变株接种4周根瘤类菌体共生基因nifD、hmuS和rirA表达量下调,这是trxs基因突变影响根瘤菌共生固氮功能的原因。

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第一章绪论

1.1 根瘤菌

1.1.1 根瘤菌与植物共生过程

1.1.2 类黄酮、结瘤因子

1.1.3 结瘤基因及其调控

1.1.4 根瘤菌中活性氧的作用

1.2 活性氧（ROS）

1.3 细胞机体内活性氧的清除机制

1.3.1 常见的非酶促抗氧化

1.3.2 常见的酶促抗氧化

1.3.3 硫氧还蛋白

1.4 研究目的及意义

第二章豌豆根瘤菌trxs基因突变体构建

2.1 材料

2.1.1 实验中所用菌株以及质粒

2.1.2 实验试剂和仪器

2.2 方法

2.2.1 根瘤菌总DNA的提取

2.2.2 大肠杆菌质粒的提取（bioteke高产质粒小量制备试剂盒）

2.2.3 转化

2.2.4 制备豌豆根瘤菌的噬菌体裂解液

2.2.5 噬菌体介导的双突变

2.2.6 三亲本接合

2.2.7 突变体RLtrxA、RLtrxB、RLtrxC的构建

2.3 结果与讨论

2.3.1 RL3841 trxs生物信息学分析

2.3.2 trxs单基因突变体的构建

2.3.3 trxs双突变体及三突变体的构建

2.4 小结

第三章豌豆根瘤菌Trxs抗氧化功能

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 试剂与仪器

3.2 方法

3.2.1 根瘤菌生长曲线的测定

3.2.2 根瘤菌抗氧化活性的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 菌株生长曲线的测定

3.3.2 敏感性应答实验

3.4 小结

第四章豌豆根瘤菌trxs在共生固氮中的功能

4.1 材料

4.1.1 菌株

4.1.2 试剂与仪器

4.2 方法

4.2.1 植物盆栽实验

4.2.2 根瘤固氮酶的测定

4.2.3 根瘤形态学观察石蜡包埋及透射电镜切片

4.3 结果与讨论

4.3.1 植物盆栽实验固氮酶活的测定

4.3.2 根瘤形态学观察

4.4 小结

第五章豌豆根瘤菌中trx相关基因的表达分析

5.1 材料

5.1.1 菌株

5.1.2 试剂和仪器

5.2 方法

5.2.1 根瘤菌样品RNA提取

5.2.2 RT-PCR

5.3 结果与讨论

5.4 小结

第六章 Trx蛋白表达及酶活测定

6.1 材料

6.1.1 菌株

6.1.2 材料与仪器

6.2 方法

6.2.1 Trxs蛋白的生物信息学分析

6.2.2 表达载体BLTrxA、BLTrxB、BLTrxC的构建

6.2.3 重组蛋白的诱导表达

6.2.4 SDS-PAGE电泳分析

6.2.5 重组蛋白的活性测定和酶动力学分析

6.3 结果与讨论

6.3.1 Trxs蛋白的生物信息学分析

6.3.2 表达菌株BLTrxA、BLTrxB、BLTrxC的构建

6.3.3 SDS-PAGE电泳分析

6.3.4 重组蛋白的活性测定和酶动力学分析

6.4 小结

第七章总结与展望

7.1 总结

7.2 展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢婧

导师: 程国军

关键词: 豌豆根瘤菌,硫氧还蛋白基因,抗氧化功能,共生固氮,实时荧光定量

来源: 中南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中南民族大学

分类号: Q933

总页数: 86

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