猪场废水中四环素类抗生素对斑马鱼抗氧化效应毒理研究

论文摘要

四环素类抗生素（TCs）作为一种广谱抗菌药,被广泛应用于兽药和饲料添加剂中。随着畜禽养殖业的规模化和集约化发展,兽用抗生素滥用现象越来越严重。进入动物体内的抗生素约8090%以原药或其代谢产物的形式排出体外,然而,我国尚无较完善的针对抗生素的处理技术体系及相关排放要求,残留在各种养殖废水中的抗生素最终进入水环境中?目前,关于TCs对水生生物氧化损伤的研究已有很多,但对其影响水生生物抗氧化能力的潜在分子机制知之甚少。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用仪（UPLC-MS/MS）对赣江流域周边3个规模化生猪养殖场废水处理工艺中部分构筑物出水及排放口下游水体中代表性TCs（包括金霉素、土霉素和四环素）的残留特征进行分析。进一步地,以斑马鱼为水生模式生物,研究它们在斑马鱼幼鱼体内的富集与代谢特征。最后,考察这三种抗生素对斑马鱼幼鱼抗氧化系统的影响并采用分子计算毒理学技术研究TCs和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）间的相互作用,以初步探索TCs造成鱼体氧化损伤的作用机理。主要研究成果如下:（1）在3个规模化养猪场的水样中均检出了金霉素、土霉素和四环素。各猪场所配备的常规厌氧-好氧组合工艺对畜禽养殖废水中TCs的处理效率均高于89%,但工艺出水中TCs的残留浓度仍处于μg/L水平,且在排放口附近水体中的浓度较为稳定。证实畜禽养殖场附近存在较大抗生素污染负荷。（2）经2 mg/L金霉素、5 mg/L土霉素和2 mg/L四环素暴露48 h后,斑马鱼幼鱼体内的抗生素含量分别为0.53 mg/kg、0.29 mg/kg和0.19 mg/kg（湿重）,相应的BCF48h值分别为0.3206、0.0621和0.1152,说明这三种抗生素生物富集能力很弱。在清水暴露阶段,它们的消除速率常数分别为0.022 h-1、0.012 h-1、0.014 h-1,相应的半衰期分别为31.51 h、57.76 h、49.51 h,说明金霉素、土霉素和四环素在生物体内的代谢较快。（3）金霉素、土霉素和四环素均能导致斑马鱼幼鱼产生氧化应激,且大小关系表现为:金霉素>四环素>土霉素。在金霉素暴露条件下,SOD、CuZn-SOD、CAT、GPX活性均降低,GSH和MDA含量升高,SOD、CAT、Nrf2基因表达量下降,SOD、CAT、Nrf2蛋白质表达水平下调;在土霉素暴露条件下,CAT、GST活性均被抑制,GPX活性升高,MDA含量显著降低,SOD、CAT、Nrf2基因表达量整体下降,SOD、CAT、Nrf2蛋白质表达水平呈浓度依赖性下调;在四环素暴露条件下,SOD、CuZn-SOD、CAT、GPX、GST活性均被诱导,GSH含量升高,SOD、CAT、Nrf2基因表达量提高。随着暴露浓度的升高,SOD、CAT蛋白表达由诱导状态转为被抑制状态,Nrf2蛋白质表达水平则呈浓度依赖性下调。分子对接与动力学模拟结果显示三种抗生素均能通过氢键与zfPI3K紧密结合,并且zfPI3K蛋白激酶中的GLN636是对结合自由能起着最主要贡献的氨基酸残基。由此推测金霉素、土霉素和四环素可能是潜在的PI3K抑制剂,能够抑制Nrf2介导的抗氧化应激调控,从而降低斑马鱼幼鱼的抗氧化能力。

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摘要

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主要缩略语

第1章绪论

1.1 研究背景

1.1.1 畜禽养殖业抗生素的使用情况

1.1.2 水环境中抗生素的残留现状

1.1.3 抗生素对水生生物的毒理效应研究进展

1.2 TCs及其环境污染现状

1.2.1 TCs的理化性质及应用

1.2.2 TCs的水环境分布

1.2.3 TCs在生物体内的残留现状

1.2.4 TCs的毒理效应研究进展

1.3 斑马鱼简介

1.4 抗氧化系统

1.5 PI3K/Nrf2-ARE信号通路

1.6 本文的研究目的、内容及路线

1.6.1 研究目的和意义

1.6.2 研究内容及路线

1.6.3 创新点

第2章实验材料与方法

2.1 药品、试剂与仪器

2.2 样品的收集

2.2.1 猪场废水的采集

2.2.2 斑马鱼幼鱼的获取

2.2.3斑马鱼暴露实验

2.3 UPLC-MS/MS检测分析TCs浓度

2.3.1 样品的预处理

2.3.2 UPLC-MS/MS分析条件

2.4 氧化应激指标的测定

2.4.1 总蛋白提取与定量

2.4.2 抗氧化酶活性和GSH?MDA含量测定

2.4.3 RNA提纯和qRT-PCR分析

2.4.4 Western blot实验

2.5 分子计算毒理学技术

2.5.1 同源建模和分子对接

2.5.2 分子动力学（MD）模拟

2.5.3 结合自由能计算和能量分解

2.6 数据统计分析

第3章规模化猪场废水中TCs的残留特征

3.1 猪场概况

3.2 标准曲线与检出限

3.3 精密度与回收率

3.4 猪场废水中TCs的残留特征

3.5 小结

第4章 TCs在斑马鱼幼鱼体内的富集与代谢作用

4.1 质量控制

4.1.1 标准曲线

4.1.2 精密度与回收率

4.2 暴露溶液中TCs的浓度

4.3 斑马鱼幼鱼体内TCs的含量

4.4 TCs在斑马鱼幼鱼体内的富集与代谢

4.5 小结

第5章 TCs对斑马鱼幼鱼抗氧化系统的影响

5.1 对抗氧化酶活性与GSH?MDA含量的影响

5.1.1 实验结果

5.1.2 分析与讨论

X和Nrf2 基因表达的影响'> 5.2 对CAT、SOD、GP_X和Nrf2 基因表达的影响

5.2.1 实验结果

5.2.2 分析与讨论

5.3 对SOD、CAT、Nrf2 蛋白表达的影响

5.4 结合模式分析

5.5 结合自由能及自由能分解分析

5.6 小结

第6章结论与展望

6.1 结论

6.2 不足与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 余晓玲

导师: 万金保

关键词: 猪场废水,四环素类抗生素,斑马鱼,生物富集与代谢,氧化应激

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用,农业基础科学

单位: 南昌大学

基金: 国家自然科学基金(31860154),(21647005)和(41867064)

分类号: X171.5;X713

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000517

总页数: 75

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