冀学宁[1]2003年在《宿主微环境影响原发性肝癌器官特异性转移机制初步探讨及其相关分子的纯化鉴定》文中提出我国原发性肝癌病死率占所有恶性肿瘤的第二位，占全部恶性肿瘤死亡人数的18.8％。乙型肝炎、肝炎后肝硬化则是我国肝癌发病率和死亡率居高不下的主要原因。虽然手术切除仍是可能获得治愈的主要方法，但根治性切除后转移复发率仍然相当高。这是肝癌病人临床治疗失败的主要原因，也是提高病人生存率和影响预后的重要障碍。因此从分子机制入手，理解调控转移的过程及转移细胞与器官微环境之间的复杂作用，已成为国内外研究的重点，并为有效的治疗设计提供了生物学基础和靶点。转移的形成是多因素、多阶段、非随机和高度选择的过程。肿瘤细胞异质性是其转移的生物学基础。要形成转移瘤，肿瘤细胞必须完成转移过程的所有步骤，并且依赖于转移细胞与宿主稳态机制多重复杂的相互作用。只有当合适的肿瘤细胞（种子）与特定的组织器官（土壤）提供的生长环境有特殊的亲和力时才会形成转移瘤。在原发性肝癌发生肝外器官的血道转移中，肺为常见的转移部位(约占血道转移的90%)。我所新近率先建成的具有高低转移潜能的人肝癌细胞株（MHCC97-H、MHCC97-L）主要发生肺转移和肝内播散，其转移能力具有显着的差异。本课题旨在从原发性肝癌器官特异性转移这一角度出发，通过比较小鼠不同组织粗提物诱导MHCC97-H、MHCC97-L移动侵袭能力，验证"种子"与"土壤"学说这一理论，并初步探讨其可能的机制。此外利用蛋白质纯化技术从中筛选纯化出能促进MHCC97-H移动和侵袭的相关分子，为建立干预宿主微环境与肿瘤细胞相互作用这一新的治疗肝癌模式提供靶点。 第一部分肺组织粗提物促进人原发性肝癌细胞移动侵袭的研究基于肺是肝癌肝外转移的最好发部位这一事实，本部分工作的主要目的是探讨宿主微环境与肝癌器官特异性转移的关系。首先制备C57BL/6小鼠的肺，肝，脾，肾组织粗提物，利用体外Boyden小室趋化侵袭实验，分别比较各种组织粗提物诱导高低转移潜能的人原发性肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L移动和侵袭能力。结果肺、肝、脾、肾组织粗提物及无血清培养液诱导高转移细胞株MHCC97-H细胞移动侵袭的细胞数分别是64±10、6±2 、3±1、22±4 和1±0。肺、肝、脾、肾组织粗提物及无血清DMEM诱导MHCC97-L穿过下室的细胞数分别是20±6、2±0、1±1、6±2和0±0。与肝、<WP=6>脾、肾组织粗提物相比，肺组织粗提物具有显着诱导MHCC97-H、MHCC97-L移动侵袭能力，差异有非常显着性(P<0.001)。与低转移潜能的细胞株MHCC97-L相比，肺组织粗提物具有显着诱导高转移潜能细胞株MHCC97-H移动侵袭能力，差异有非常显着性 (P<0.001)。 肺组织粗提物浓度在1g/L时表现为最强的诱导MHCC97-H细胞移动侵袭能力。上述结果验证了"种子"与"土壤"这一学说。并且证实了MHCC97细胞系在体内模型的转移特点。提示肺组织粗提物中存在某种可溶性因子促进人原发性肝癌细胞的移动侵袭能力，宿主微环境影响原发性肝癌器官特异性转移。第二部分肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨在体外趋化侵袭实验中，降解Matrigel和具有移动能力是肿瘤细胞穿过滤膜的前提。蛋白水解酶和细胞形成侵袭性伪足与肿瘤细胞的侵袭性行为密切相关。本部分工作主要目的在于从移动和侵袭两个方面探讨了肺组织粗提物影响人原发性肝癌器官特异性转移机制。将制备好的C57BL/6小鼠的肺、脾组织粗提物分别与MHCC97-H、MHCC97-L共培养24小时，收集培养的上清，用明胶酶谱法检测其基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）分泌水平。采用F型肌动蛋白聚合试验和流式细胞仪分析C57BL/6小鼠肺组织粗提物诱导人肝癌细胞的细胞骨架变化。利用双重荧光染色分析肺组织粗提物作用后的人肝癌细胞F型肌动蛋白和MMP-9分布关系。结果在无血清培养液培养条件下，MHCC97-H和MHCC97-L均分泌较少MMP-9(IOD值为2.1±0.2和 1.4±0.1)，不分泌MMP-2；但MHCC97-H分泌活性型MMP-9(IOD值17.4±2.2)显着高于MHCC97-L(6.7±0.2)，差异有显着性（P<0.001）。免疫荧光细胞化学法示MMP-9在MHCC97-H中的荧光表达强于在MHCC97-L表达。与无血清培养液培养条件下MMPs分泌相比，肺组织粗提物孵育后的MHCC97-H和MHCC97-L分泌MMP-9、活性型MMP-9和MMP-2均显着增高（P<0.001）；MHCC97-H分泌MMP-9（18.8±1.2）、活性型MMP-9（100.1±1.1）、MMP-2（22.4±1.3）均显着高于MHCC97-L（7.8±0.3、40.8±2.2和8.2±0.4）（P<0.001）。脾组织粗提物孵育后的MHCC97-H和MHCC97-L不分泌MMPs。MHCC97-H或MHCC97-L与肺组织粗提物孵育后，随时间的增加，细胞伪足增多。流式细胞仪结果示F型肌动蛋白在30秒内分别增加1.9倍和1.7倍。MHCC97-H或MHCC97-L与脾组织粗提物孵育后，无伪足生成。MHCC97-H<WP=7>或MHCC97-L与脾组织粗提物孵育后，流式细胞仪结果示F型肌动蛋白在30秒内分别增加2.3倍和1.1倍。激光扫描共聚焦显微镜观察MHCC97-H悬液示F型肌动蛋白从细胞外周浓染到重新分布于细胞的导引侧。无血清培养液孵育MHCC97-H后，MMP-9和F型肌动蛋白主要位于细胞的核周池。肺组织粗提物与MHCC97-H孵育后，MMP-9则表达于伪足的前端。上述结果表明不同转移潜能的人肝癌细胞分泌基质金属蛋白酶
赵璇[2]2010年在《抗人肝癌干细胞功能性抗体及靶抗原的研究》文中指出肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第叁位。由于缺少有效的治疗药物,肝癌目前5年生存率还很低。已有的研究报道,肿瘤干细胞在恶性肿瘤的复发、转移中发挥着关键性作用。因此,寻找在肝癌干细胞生长转移过程中发挥重要功能的特异基因和／或蛋白,为靶向治疗肝癌干细胞提供有价值的靶标,这将成为治疗肝癌的新希望。因此,本研究从原发性肝细胞肝癌患者新鲜肿瘤组织中分离、培养肿瘤干细胞。利用大容量功能性单抗库技术,筛选、鉴定能识别并且对肝癌干细胞样细胞有抑制作用的功能性单抗,以期为靶向肿瘤干细胞治疗肝癌的新策略提供有应用潜力的功能性单抗和分子靶标。采用酶消化法以原代结合短暂传代培养从人肝癌组织中分离含人肝癌干细胞样细胞hLCSLCs (human Liver cancer stem cell-like cells, hLCSLCs)的连续传代细胞。分别加入肝素、白蛋白、氢化可的松筛选适用于hLCSLCs的无血清悬浮成球培养的培养基。以流式细胞术检测hLCSLCs和由无血清悬浮成球培养所获得的成球细胞中旁群(SP)细胞CD133及CD90等相关标志物的表达。裸鼠成瘤实验检测SP细胞及无血清悬浮成球细胞的致瘤能力。以hLCSLCs免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用甲基纤维素选择培养液培养,制备大容量抗肝癌细胞的单克隆抗体库。采用细胞免疫荧光双染色法,筛选出识别肝癌干细胞标志物CD133阳性细胞的单克隆抗体。ELISA测定单克隆抗体的类和亚类。采用无血清悬浮培养法、增殖实验等筛选抑制肝癌干细胞无血清成球和抑制细胞增殖的功能性单克隆抗体。Western Blot鉴定单抗所识别的功能性抗原蛋白。纯化抗体,采用细胞免疫荧光检测其所识别的抗原蛋白,进行亚细胞定位；应用抗体15B7检测分析其所识别抗原基因体外对hLCSLCs增殖、侵袭迁移功能、细胞周期及凋亡的影响。应用纯化后的抗体进行体内抑瘤实验,评估抗体对hLCSLCs的影响。分离鉴定其功能性抗原蛋白,运用免疫亲和层析及MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定获得的肝癌干细胞相关的功能基因。成功地从人肝癌组织分离获得hLCSLCs,其SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为0.9%、0.8%和12.7%,裸鼠皮下接种2000个SP细胞,成瘤率为100%。含有肝素的无血清培养基更适于hLCSLCs的成球培养,所获成球细胞中SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为4.6%、9.7%和48%,接种10 000个成球细胞即可全部成瘤。以上结果表明hLCSLCs细胞中含有高比例的肝癌干细胞,且含有肝素的培养基可以富集肿瘤干细胞。细胞融合后获得2964株杂交瘤克隆,在能与hLCSLCs反应的237株克隆中有116株单抗能与hLCSLCs的细胞膜结合。免疫荧光双染色实验筛选分选后的SP细胞鉴定出33株能识别CD133阳性的肝癌干细胞单抗。ELISA检测发现,33株单抗有不同的重链类、亚类,包括IgM型、IgA型、IgG1型和IgG3型,表明我们所建立的抗肝癌单克隆抗体库具有类型上的多样性。采用无血清悬浮培养细胞球成球实验,从33株单克隆抗体中筛选获得了14株对hLCSLCs在无血清悬浮培养所形成的球大小和成球个数有抑制作用的单抗,抑制率约为2%-62%；其中抑制率达10%以上的有8株。另有6株对hLCSLCs-SP及hLCSLCs细胞球细胞有明显的抑制增殖作用,抑制率均大于10%。裸鼠皮下接种2×104个15D2、3G7单抗阳性的hLCSLCs,成瘤率为100%。活细胞免疫荧光结果显示15B7抗原定位在肝癌细胞膜上。肝癌干细胞相关单抗15B7在hLCSLCs、hLCSLCs-SP、hLCSLCs细胞球细胞体外培养生长增殖抑制率分别为13.8%、7.1%、9.3%；15B7抗体对侵袭的抑制率为30.9%(p<0.05)；对迁移的抑制率为15.7%(p>0.05)。细胞周期检测发现hLCSLCs发生G1期阻滞,致使细胞增殖减慢,并出现凋亡。15b7单抗能显着抑制hLCSLCs移植瘤生长,高、中、低剂量的抑制率分别为59.2%、60.5%和8.4%。绘制生存期曲线发现在体内15B7单抗治疗小鼠可明显延长其生存期。免疫组化检测发现,治疗组可诱导cyclinD1上调表达,影响细胞周期进程；caspase3表达明显升高,表明抗体可以诱导凋亡。通过这一系列的作用,从而抑制hLCSLCs在体内外的快速增殖和生长,进一步证明了肝癌干细胞相关抗体15B7为功能性单抗。经过MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定,15B7所识别的抗原蛋白为POTE-actin.成功建立了一种人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞分离培养方法,添加肝素的无血清悬浮成球培养或通过分选SP细胞可有效富集肝癌干细胞样细胞。建立了大容量抗人原发性肝癌干细胞细胞的单克隆抗体库,获得了2株可能特异性抑制肝癌干细胞生长的功能性单抗；至少得到2株所识别的阳性细胞可能为肝癌干细胞的单克隆抗体；初步筛选鉴定了一株显着抑制肝癌干细胞无血清成球、增殖的单抗15B7及其识别的抗原分子,并初步研究了其分子机理,为筛选肝癌靶向治疗剂及靶标提供了一种潜在的新方法。
田波[3]2004年在《人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及转移机制的探讨》文中研究表明肝癌在我国是位列第二位的癌症“杀手”,占我国全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%,占全世界肝癌死亡人数的 53%。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步,但总体而言,肝癌的预后并没有得到显着的改善,5 年生存率仍仅有 5%左右。术后复发转移是阻碍生存率进一步提高的最大的障碍。即使是根治性切除,术后 5 年内,仍有 60%~70%的患者出现转移复发,而淋巴道转移也是肝癌最常见的转移表型之一。针对肝癌术后转移复发的研究是21 世纪肝癌研究重点。 肝癌的动物模型和细胞模型是肿瘤转移研究的重要基础和平台,现已建成了许多稳定的应用广泛的肝癌动物模型和细胞系,但绝大多数动物模型不发生转移,其中有明确的淋巴道转移潜能的人肝癌动物或细胞模型尚未见报道。肿瘤的转移是一个高度有序的、非随机的、器官特异性的过程,宿主微环境积极地参与了肿瘤细胞转移的全过程。目前,器官特异性转移的研究是肿瘤研究的热点之一,但其具体机制仍然不清楚。近来研究表明,趋化因子及其受体在肿瘤细胞迁移、侵袭和转移过程中有着重要的作用,发现了一些与特定肿瘤的器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,为转移的防治提供了新的靶点和策略。但趋化因子及其受体在肝癌转移中的研究尚未见报道。 本课题应用连续体内筛选的方法,建立高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系HCCLYM,进而通过有限稀释法进行单克隆化,筛选高、低淋巴道转移潜能的单克隆细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L,并对其转移特性和基本生物学性状进行鉴定。具有人肝癌淋巴道转移模型体系的建立,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台,也进一步丰富和完善本所的肝癌转移模型系统。应用分类基因芯片研究趋化因子及其受体在肝癌器官特异性淋巴道转移中的作用,寻找与肝癌的淋巴道器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,并对其作用机制作初步的探讨。 第 一 部 分 人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及鉴定 本部分的研究目的是建立具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系,克隆分离 1<WP=5>博士论文 中文摘要具有不同淋巴道转移潜能的肝癌细胞株,并对其转移特性和基本生物学性状进行鉴定,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台。 应用本所建立的具有多向高转移潜能的人肝癌细胞系 HCCLM6 为细胞母系,接种于裸鼠的爪垫部位,原代培养扩增转移淋巴结中的肝癌细胞,重新接种于裸鼠爪垫,连续 8 轮上述筛选,逐步扩增和纯化细胞母系中具有较高的特异性的淋巴道转移潜能的肿瘤细胞,建成具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系HCCLYM。 HCCLYM 细胞系肝脏原位移植淋巴结转移率为 83%,肺脏转移率为 40%;体外培养时为典型的多边形上皮样细胞,贴壁生长,接触性生长抑制丧失,细胞平均直径 38±2 微米,群体倍增时间 31.6 小时,克隆形成率 54±4%,亚叁倍体核型,染色体数目范围 45~68 条,主流染色体数目为 56~60,占 78%,比较常见的标志性染色体有 i(X)(q10),der(4)t(4;?)(q31;?),Y 染色体缺如,并可见有同源染色区的标志性染色体;流式细胞检测细胞周期各时相的百分率分别为G0-G1 期 54.25%,S 期 25.56%,G2-M 期 10.45%,G2/G1 为 2.04;明胶酶谱法检测表明 HCCLYM 细胞可分泌大量 MMPs,其中以 MMP-2、MMP-9 及其活性型为主;PCR 法检测细胞基因组中有 HBV DNA 整合。 HCCLYM 细胞系采用有限稀释法单克隆化,得到 32 个单克隆细胞株,经过2 轮裸鼠体内筛选,挑选淋巴道转移潜能差别最大的两个单克隆,建株,命名为高、低淋巴道转移潜能人肝癌细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L。 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 单克隆细胞株肝脏原位移植淋巴结转移率分别为 100%和 30%,而肺转移率均为 30%。HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞平均直径分别为 37±4 微米和 38±5 微米;群体倍增时间分别为 30.3 小时和 32.3 小时;克隆形成率分别为 37±6%和 27±7%。流式细胞分析 HCCLYM-H 细胞株细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 56.95%,S 期 29.93%,G2-M 期13.12%,G2/G1 为 2.04。而 HCCLYM-L 细胞株细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 60.48%,S 期 27.03%,G2-M 期 12.49%,G2/G1 为 2.04。核型分析结果显示 HCCLYM-H 细胞株染色体数目范围 53~60 条,主流染色体数目为55~57,占 87%;而 HCCLYM-L 细胞株染色体数目范围 50~58 条,主流染色体数目为 53~56,占 83%;HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株均可见标志性染色体 i(X)(q10),der(4)t(4;?)(q31;?),Y 染色体均缺如,但仅 HCCLYM-H 细胞株中可见同源染色区。图 1.10 为 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株的代表核型。。两株细胞在体外培养时均可分泌基质金属蛋白酶,以MMP-2 、MMP-9及MMP-9的活性型为主,其中 HCCLYM-H 分泌 MMPs 的能力明显强于 HCCLYM-L。两克隆细胞株均可同基底膜组分 IV 型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白发生粘附, 2<WP=6>博士论文 中文摘要其中同 FN 的粘附能力最强,而 HCC
佚名[4]2010年在《基础免疫》文中提出脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
任勇刚[5]2016年在《转录因子Nrf1α管控肝癌细胞恶性行为及其分子机制研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)作为全球高发恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,而我国更是肝细胞癌高发国家。跨膜转录因子Nrf1 (nuclear factor-erythroid 2 related factor 1)属于碱性亮氨酸拉链CNC-bZIP (cap'n'collar basic-region leucine zipper)亚家族成员,通过调控抗氧化基因、蛋白酶体基因的转录,保护细胞免受氧化应激影响,维持机体内平衡。而Nrfl肝脏特异敲除的小鼠诱发原发性肝细胞癌,为了更深入揭示Nrfl与肝细胞癌的发病机制,我们选择人肝癌细胞HepG2作为研究对象,观察Nrfl a (Nrfl全长亚型)对肝癌细胞HepG2恶性行为的影响。而且Nrf1a是否发挥肿瘤抑制因子的作用也未见报道。因此我们将研究聚焦于此,探讨Nrf1α在肝细胞癌发生发展中的生物学功能及其机制,为Nrfl缺失诱发肝细胞癌的发病机理、临床病理及预后判断提供新的思路。研究方法与结果：① TALEN (transcription activator-like effector nuclease)介导同源双敲除Nrfl a肝癌细胞株的建立通过TaqMan探针和DNA测序技术分别检测Nrf1的两种全长亚型Nrf1α和TCF11,发现TCF11亚型在不同肝癌细胞中明显低表达,而正常肝细胞Nrf1α和TCF11表达丰度接近一致。因此,我们选择低表达TCF11的HepG2细胞作为研究对象。接下来构建TALEN介导敲除Nrf1α的HepG2细胞株,根据TALEN敲基因原理,我们分别设计TALEN左臂不PTALEN右臂,经过质粒共转染细胞,细胞测序验证,单克隆筛选,成功获得同源双敲除Nrf1α-/-的HepG2细胞株,命名为HEA157(Nrf1α-/-)。为了对照验证,我们设计了沉默Nrf1的慢病毒载体,筛选出沉默Nrf1最有效的shRNA靶序列,建立稳定敲减Nrfl细胞株,命名为HepG2-shNrf1。最后,我们设计了Nrf1 a超表达慢病毒载体,转染HEA157(Nrf1α-/-)细胞,获得稳定异源恢复表达Nrf1α的细胞株,命名为HEA157Nrf1α。② TALEN介导敲除Nrf1α对肝癌细胞生物学行为的影响MTS、细胞克隆形成实验检测细胞增殖,结果均提示在Hep(G2细胞中敲除Nrf1α可促进细胞增殖。流式细胞仪测定细胞凋亡,结果显示,HEA157(Nrf1α-/-)细胞晚期凋亡率明显降低,但早期凋亡并没有明显变化。细胞划痕及Transwell侵袭迁移实验观察细胞运动能力,实验结果显示,敲除Nrf1α后肝癌细胞迁移及侵袭能力均显著增强(p<0.05)。综合实验结果分析,Nrf1α能够对肝癌细胞生物学行为进行调节,通过调控肝癌细胞增殖和EMT发生增强肝癌细胞迁移侵袭能力。促进肝癌细胞体外恶性转化。③敲除Nrf1α调控肝癌细胞迁移侵袭的机制探究检测4HEA157(Nrfla-/-)细胞中与肿瘤转移相关基因的表达,发现MMP-9、 MMP-17表达显着升高,上皮细胞标志物CDH1表达显着下调(p<0.01)。间质细胞标志物CDH2表达显着上调(p<0.01)。Western Blot分析CDH1、CDH2、SNAI1、 SNAI2、Vimentin的表达也证实敲除Nrf1α促进肝癌细胞发生上皮间质转化。通过建立裸鼠皮下移植瘤模型,发现HEA157(Nrf1α-/-)细胞形成的移植瘤生长速度更快,在注射细胞后的20-35天,移植瘤呈现指数生长。且最终形成的移植瘤体积更大,并伴随溃烂出血。同时发现HEA157(Nrf1α-/-)组小鼠肝脏出现大量转移癌结节。免疫组化检测模型鼠移植瘤Nrf1、CDH1、CDH2的表达,发现HEA157(Nrf1α-/-)实验组Nrf1表达减少,CDH1表达下调,CDH2表达上调。Real-time PCR检测结果与免疫组织化学结果一致。实时定量PCR实验,Western Blot及免疫组织化学方法检测发现Nrfl在HCC组织中的表达与病理严重程度呈现相关性,高分化HCC组织Nrfl高表达,低分化HCC组织Nrf1低表达,且癌旁组织表达丰度高于癌组织。通过高通量表达谱测序及信号通路聚类分析,发现敲除Nrfα激活HepG2细胞PTEN-PI3K/AK T信号通路。进一步实验验证敲除Nrf1α, PTEN表达下调,PIK3CA、 PIK3CB表达上调,AKT2总蛋白表达并未发生明显变化,但p-AKT2T308和p-AKT2S473磷酸化水平加强。启动子分析和双荧光素酶检测结果提示Nrf1α与PTEN、 CDH1存在直接作用关系。因此,我们认为下调Nrfα表达激活PTEN-PI3K/AK T信号通路,促进AKT的活化并促进PI3K/AKT下游靶基因表达。结论：①利用TALEN基因定点编辑技术,成功构建敲除Nrf1α亚型的HepG2肝癌细胞株HEA157(Nrf1α-/-)。②Nrf1α缺失促进肝癌细胞EMT发生,并导致裸鼠皮下移植瘤肝脏转移,促进肝癌细胞恶性迁移侵袭能力显着增强。③Nrf1在HCC组织中的表达与病理严重程度呈现相关性,高分化HCC组织Nrfl高表达,低分化HCC组织Nrf1低表达,且癌旁组织表达丰度高于癌组织。④下调Nrfα表达激活PTEN-PI3K/AKT信号通路,促进AKT的活化并促进PI3K/AKT下游靶基因表达。
陈泓[6]2008年在《乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究》文中研究指明卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第叁位,死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处,在发病早期缺乏特异性症状和体征,很难在早期发现和诊断,约60%-70%的卵巢癌患者确诊时己属于晚期。近30年来,虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,不断改进手术方式,发现更新更好的化疗药物,增加新的化疗方案,但是5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。所以,寻找新的诊断方法和新的治疗手段是目前卵巢癌研究的重点。作为一种与粘附和渗出等肿瘤浸润转移必须过程密切相关的物质,乙酰肝素酶(HPSE)在卵巢癌的浸润转移中起着举足轻重的作用。本课题通过一系列体外实验,对HPSE在卵巢癌浸润转移过程中的作用及其机制做了深入的研究,并且构建了HPSE基因慢病毒表达和RNAi载体,为今后的基因靶向治疗奠定了基础。乙酰肝素酶基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究目的:了解乙酰肝素酶对卵巢癌细胞功能的影响,分析HPSE在卵巢癌浸润转移过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建HPSE基因真核表达载体后,将其转染无HPSE基因表达的卵巢癌细胞株A2780,G418筛选后经RT-PCR及western-blot鉴定确认获得稳定转染的HPSE/A2780细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、黏附能力、细胞侵袭转移能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达HPSE蛋白的卵巢癌细胞株。流式细胞仪对细胞检测结果显示A2780-HPSE组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为46.5%,G1期为53.5%,对照组则相应为54.5%和45.6%,其处于增殖周期的细胞有减少的趋势。HPSE组和对照组的生长曲线几近重合。两组的克隆形成率差异无统计学意义。A2780细胞在转染前后粘附率分别为0.5183±0.0796和0.7283±0.08931,比较有统计学意义(p=0.002)。Transwell小室实验发现转染HPSE基因后的A2780细胞的侵袭能力明显提高,与对照组比较有统计学意义(p=0.003)。而其迁移能力未受影响(p=0.618)。结论:细胞功能实验结果表明,HPSE能够增强卵巢癌A2780细胞的侵袭能力,降低其黏附能力;对增殖能力和迁移能力均无影响。RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外体实验研究目的:通过构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞,检测其对HPSE基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,反面验证HPSE基因的功能。方法:针对HPSE mRNA的不同区域构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳转细胞株,western-blot检验HPSE蛋白受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同shRNA干扰载体的干扰效果进行检测结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达株western-blot检验其HPSE蛋白表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,p=0.059,比较无统计学意义。侵袭能力实验中,干扰组吸光值为0.5697±0.106,对照组为0.8097±0.333,干扰组与对照组相比无统计学意义(p=0.233)。细胞粘附能力检测,干扰组0.7533±0.07685,对照组0.5833±0.11994,两者相比有统计学意义(p=0.015)。侵袭能力实验干扰组为0.69±0.085,对照组为1.091±0.277,两者相比有统计学意义(p=0.015)。结论:采用构建shRNA干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,使卵巢癌细胞侵袭和黏附能力降低。HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建目的:采用第二代和第叁代慢病毒载体,分别构建HPSE基因的慢病毒表达载体和shRNA慢病毒干扰载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法:首先扩增HPSE全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序BLAST检索,并将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48小时后提取mRNA,RT-PCR检验HPSE基因表达情况。其次,选取干扰效果最佳的siRNA,设计shRNA结构,退火反应形成双链后与慢病毒载体pSico连接并送测序。结果:重组慢病毒质粒HPSE-pWPI测序结果经BLAST,与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。重组慢病毒干扰载体pSico/HPSE测序结果与设计的shRNA序列完全一致。结论:成功的构建了HPSE基因的重组慢病毒系统和慢病毒干扰系统。为今后的HPSE靶向治疗奠定了基础。
孙跃明[7]2004年在《IL-2基因修饰的树突状细胞免疫治疗肝癌的实验研究》文中研究说明目的：1、研究肝癌病人外周血树突状细胞表面分子的表达情况。2、对比肝癌病人和健康人DC表型的差异及免疫功能状态。3、人IL-2基因腺病毒载体的构建和包装。4、研究树突状细胞经IL-2基因转染后表型和功能状态的变化。5、转基因DC经抗原负载后诱导的特异性杀伤作用的探讨。 方法： 1、健康人和肝癌病人外周血DC的分离、培养和鉴定 采集健康人和肝癌病人外周血，经淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，贴壁培养2小时后，弃上清，取贴壁单核细胞，以含GM-CSF 500μ／ml、IL-4500μ／ml RPMI-1640培养基诱导培养，每隔1天半量换液，至第6天添加TNFα200μ／ml促进成熟。以共聚焦显微镜和电子显微镜拍摄细胞照片，流式细胞术鉴定DC，~3H-TdR掺入法测定DC对淋巴细胞的激活功能，并对照肝癌病人和健康人DC间的差异，推测两组DC免疫状态的不同。 2、人IL-2基因腺病毒载体的构建和包装 将含目的基因的质粒pcDNA_3用PCR扩增IL-2基因片段，并引入xbaI、kpnI限制性酶切位点，将该基因片段与同样经xbaI、kpnI酶切的线性化 南京医科大学博士学位论文pshuttle质粒重组，构建pshuttl叭L一2真核表达载体，转化大肠杆菌JM 109，再以pl一seel八一eeul双酶切pshuttle质粒，切出含IL一2基因的eDNA片段，加入同样经PI一Seel八一eeul双酶切的线性化Adeno一x病毒DNA，重组Ad一ILZ腺病毒载体。酶切鉴定阳性克隆，Westem blot印迹测定IL一2基因的表达。 3、树突状细胞经IL一2基因转染后的表型改变 健康组和肝癌组Dc培养至第6天，以ro0P何细胞的比例加入重组Ad一IL一2腺病毒载体，转染6小时，添加TNF a 200林加l，并负载肿瘤抗原促进DC成熟，培养至第9天，以流式细胞术测定其表面分子的表达并与未转基因DC作对照;M竹法检测转基因DC表达的IL一2活性。推测经IL一2基因转染后DC免疫功能状态的变化。 4、转IL一2基因DC所诱导的特异性免疫杀伤测定 (l)DC经IL一2基因转染后，培养至第9天，按DC:T为1:4、1:20、1:100与淋巴细胞混合，以3H一TdR掺入法测定T淋巴细胞的增殖情况，算出DC的刺激指数。同时收集DC:T为1:20条件下CTL上清，以ELisA法检测IFN，的量，了解IL一2基因修饰DC对其所激活的CTL活性的影响。 (2)健康组DC在不同状态下诱导的CTL，分组按E:T为ro:1、30:1、100:1的比例与靶细胞混合培养，以5’c:释放法测定cTL的细胞毒性。 实验组cPm一自然释放组cPm 细胞毒性%二—xloo% 最大释放组cPm一自然释放组cPm 南京医科大学博士学位论文 对比IL一2基因修饰对结果的影响。 (3)不同状态下的健康组和肝癌组DC所诱导激活的CTL，分组分别在荷瘤裸鼠成瘤后第1、3周瘤旁皮下接种治疗，观察肿瘤的生长情况。 结果: l、健康人和肝癌病人的成熟DC是悬浮不贴壁的，表面有大量毛刺，胞浆内富含线粒体，溶酶体较少。肝癌病人DC表面表达的cDla与健康人无差异(P>O.05)，而其他分子表达的阳性率分别为Cns。58.85%、eD8646.18%、CD40 30.85%、HLA一DR 45.86%，较正常健康人低P<0.01。且肝癌病人对自体和同种异体的淋巴细胞的激活作用较弱。 2、经PCR扩增的IL一2 enNA片段引入xbal、kpnl酶切位点，经xbal/kpnl双酶切pshuttle质粒后成功构建pshuttl叭L一2真核表达载体，转化大肠杆菌后，阳性克隆经酶切鉴定和序列分析鉴定。以PI一sce班一eeul双酶切pshuttl“质粒，切出的含IL一2的cDNA成功插入同样经PI一see班一eeul双酶切的腺病毒载体，经酶切鉴定，感染293细胞，Westem blot出现特异性蛋白条带，表明重组腺病毒载体能稳定表达IL一2。病毒滴度losp似ml。 3、DC经IL一2基因转染后其表面分子表达的阳性率分别为:健康组CD一。88.75%、CDso 87.19%、CD86 84.92%、CD4o 78.80%、HLA一DR 8 1 .54%;肝癌组 CDI。82.97%、CDso 78.47%、CDs6 79.12%、CD4。69.80%、HLA一DR76.17%，其共刺激分子CDso、CDs6、CD4。和HLA一DR皆较未转基因的为高。尤其是肝癌组经转基因后其活性分子表达的阳性率增高更为明显。而且转基因后共刺激分子和HLA一DR分子的平均荧光强度明显增强。Mrl，1， 南京医科大学博士学位论文检测结果发现转IL一2基因DC有较大量的IL一2的表达。 4、健康组和肝癌组转IL一2基因DC对淋巴细胞的刺激指数分别为未转基因的2.5倍和7倍。两组中转基因DC激活的CTL所表达的IFN一，较未转基因DC激活的CTL所表达的明显增加，因而转基因DC能更好地激发体内的细胞免疫。 5、经DC激活的CTL治疗后，荷瘤裸鼠肿瘤的生长受到明显的抑制。实验组中尤以转基因DC组的生长抑制作用最强。 结论: l、在本实验的细胞因子组合下:GM一CSF 500林加l、IL一4 500林/ml、TNF a 200林/ml，能
参考文献：
[1]. 宿主微环境影响原发性肝癌器官特异性转移机制初步探讨及其相关分子的纯化鉴定[D]. 冀学宁. 复旦大学. 2003
[2]. 抗人肝癌干细胞功能性抗体及靶抗原的研究[D]. 赵璇. 中国协和医科大学. 2010
[3]. 人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及转移机制的探讨[D]. 田波. 复旦大学. 2004
[4]. 基础免疫[C]. 佚名. 第七届全国免疫学学术大会论文集. 2010
[5]. 转录因子Nrf1α管控肝癌细胞恶性行为及其分子机制研究[D]. 任勇刚. 重庆大学. 2016
[6]. 乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究[D]. 陈泓. 广西医科大学. 2008
[7]. IL-2基因修饰的树突状细胞免疫治疗肝癌的实验研究[D]. 孙跃明. 南京医科大学. 2004
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