Rbm14在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究

论文摘要

选择性剪接在真核生物mRNA前体成熟过程中普遍存在。据估计,在人体中,超过95%的基因会发生选择性剪接。通过选择性剪接,一个基因可以编码多种蛋白,这极大地提高了由基因组编码蛋白质的多样性。先前的报道证明,在发育异常时,可能会出现不正常的选择性剪接。选择性剪接是由反式作用RNA结合蛋白结合到mRNA前体转录本的顺式作用元件上调控的。剪接小体作为介导mRNA前体剪接的核心反式作用元件,由5个小核RNAs和多种RNA结合蛋白因子组成的。除了剪接小体,其他辅助性RNA结合蛋白,尤其是RNA识别基序(RNA Recognition Motif,RRM),也参与了时空特异性选择性剪接事件的调控。RBM14是一种RNA结合蛋白,参与多种细胞功能和生物过程,比如转录共激活、纺锤体组装、病毒感染和干细胞分化等。最近,我们实验室的研究也报道了 RBM14 在小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)的多能性维持和中胚层分化中发挥重要作用。然而,RBM14在哺乳动物胚胎发育中的体内功能还不清楚。在成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9)和胚胎显微注射技术的介导下,我们得到了Rbm14单等位基因敲除小鼠,并将其雌雄小鼠进行交配。结果发现,Rbm14双等位基因敲除会导致小鼠胚胎致死。进一步的组织学分析表明,Rbm14敲除会导致上胚层细胞凋亡和mESCs细胞凋亡,以致小鼠胚胎发育阻滞在原肠胚阶段。机制研究发现,RBM14参与DNA损伤应答相关基因的选择性剪接,敲除RBM14会导致这些基因发生异常的选择性剪接,并造成mESCs中DNA损伤的积累。因此,我们研究发现,在小鼠早期胚胎发育过程中,RBM14通过调控与DDR相关基因的选择性剪接,在维持基因组DNA完整性中发挥了关键性作用。我们研究中的关键新发现包括:(1)Rbm14双等位基因敲除,造成小鼠早期胚胎致死。(2)Rbm14双等位基因敲除后,引起着床后胚胎上胚层细胞周期阻滞和细胞凋亡,导致早期胚胎发育中原肠运动紊乱。(3)Rbm14敲除,导致在mESCs中DNA损伤的积累。(4)RBM14与可变剪接因子相互作用,通过选择性剪接调控DDR相关基因。总之,本研究证明了 RBM14介导的DDR相关基因的选择性剪接对于小鼠早期胚胎发育中基因组完整性的维持是至关重要的。

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ABSTRACT

第一章引言

1.1 早期胚胎发育

1.1.1 第一次细胞命运决定: 内细胞团和滋养层的形成

1.1.2 第二次细胞命运决定: 上胚层与原始内胚层的分化

1.1.3 原肠运动与原肠胚的形成

1.2 选择性剪接

1.2.1 选择性剪接的机制

1.2.2 选择性剪接调控的生物学意义

1.2.3 选择性剪接的调控

1.3 RNA结合蛋白

1.3.1 RNA结合蛋白的RNA结合结构域

1.3.2 RNA结合蛋白的功能

1.4 Rbm14基因

1.5 基因组稳定性维持

1.5.1 DSB修复通路

1.5.2 选择性剪接对基因组稳定性的维持

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验耗材

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.1.4 溶液配制

2.1.5 工具酶

2.1.6 试剂盒

2.1.7 抗体

2.1.8 实验动物

2.1.9 实验细胞系

2.2 实验方法

2.2.1 打靶Rbm14基因的sgRNA的筛选

2.2.2 Rbm14单等位基因敲除小鼠的获得

2.2.3 组织形态学观察

2.2.4 组织包埋

2.2.5 切片及捞片

2.2.6 苏木素和伊红染色

2.2.7 BrdU标记

2.2.8 免疫荧光染色

2.2.9 饲养层细胞的制备

2.2.10 小鼠ESCs细胞系的建立及基因型鉴定

2.2.11 细胞免疫荧光染色

2.2.12 CCK8细胞活度检测

2.2.13 免疫印迹

2.2.14 凋亡检测

2.2.15 细胞周期检测

2.2.16 单细胞凝胶电泳分析

2.2.17 免疫共沉淀

2.2.18 RNA抽提

2.2.19 RNA反转和半定量PCR

2.2.20 RNA高通量测序和生物信息学分析

第三章结果

3.1 Rbm14基因特异敲除小鼠的表征

3.1.1 Rbm14单等位基因敲除小鼠的获得

3.1.2 Rbm14敲除导致小鼠胚胎期死亡

3.2 Rbm14敲除小鼠的胚胎发育

3.2.1 Rbm14敲除不影响胚胎从受精卵到着床前囊胚的发育

3.2.2 Rbm14敲除导致原肠胚发育阻滞

3.2.3 Rbm14抑制原条形成

3.2.4 Rbm14敲除导致着床后胚胎上胚层细胞周期阻滞和细胞凋亡

3.3 Rbm14敲除对小鼠胚胎干细胞的影响

3.3.1 Rbm14敲除抑制小鼠胚胎干细胞生长

3.3.2 Rbm14敲除导致小鼠胚胎干细胞细胞周期阻滞和细胞凋亡

3.4 Rbm14参与基因组DNA稳定性的维持

3.5 Rbm14调控DDR相关基因的选择性剪切

第四章讨论与总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李静

导师: 李伟

关键词: 胚胎发生,结合蛋白,识别基序,损伤应答,选择性剪接

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q132.4

DOI: 10.27517/d.cnki.gzkju.2019.000435

总页数: 103

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Rbm14在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究

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