胡永华[1]2004年在《HBsAg基因的克隆及香蕉果实表达载体的构建》文中进行了进一步梳理香蕉是多年生常绿大型草本植物，是重要的热带、亚热带经济作物之一。目前，全世界已有130个国家、地区生产香蕉。与其它植物相比，利用香蕉开发转基因植物反应器具有其独特的优势：1) 生长周期较短(一年左右)；2)香蕉营养价值高，是大多数人均喜爱的水果，市场消费量大；3) 价格便宜；4)香蕉可以生食，若表达口服疫苗，产品可以供人们直接口服，不需分离提取或加热处理，具有非常大的优势。由此可见，转基因香蕉生物反应器的研究和开发将具有广阔的应用前景。本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA，根据GenBank报道的ACS启动子序列设计引物，通过PCR的方法对ACS启动子2.5kb的序列进行缺失改造，克隆到了长1200bp的ACS启动子片段，与GenBank报道序列相比较同源性为93.2％。经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件，经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导。为验证其果实特异表达活性，通过插入到pB[101.2中间表达载体上的GUS基因5’端前，构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS。用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中，结果表明：用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后，都出现兰色斑点，对照没有出现兰色斑点。因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达。不同的靶距离条件下，基因枪转化效率不同，采用3cm、6cm、9cm叁个不同的靶距离，每个处理轰击两枪，发现当靶距离为9cm时转化率最高，为62.5％，并且当靶距离在3cm～9cm之间递增时，转化率呈上升趋势。因而，靶距离为9cm是基因枪转化香蕉果实外植体较合适的轰击。 乙型肝炎是由乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的全球性传染病，据估计，全世界目前大约有3.5亿个乙肝病毒感染者，且这一数字还在增加。HBV属嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生有密切的关系。乙型肝炎病毒慢性感染目前尚无有效的抗病毒治疗方法，但其血源疫苗和重组疫苗均能有效的预防乙型肝炎病毒的感染，故疫苗的研制与生产成为了防治这一病毒的重要武器。本研究通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA，然后根据报道的序列设计特异性引物，同时在华南热带农业大学硕士学位论文上游引物中引入了Kozak序列，经那R克隆到、Bs匆基因序列，长度为681bP·NcBIB认sT分析的结果表明，获得的HBsAg基因序列及推导的氮基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97 .2%和97 .4%。 实珍沙卜源基因在香蕉树果实中表达离不开一个合适的表达载体.为此，本研究将经过改造的HBsAg基因替代pBAcs中的Gus基因，成功构建了含有Acs启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体，为下一步转化香蕉，获得在果实中表达几HBsAg蛋白的转基因植株莫定了基础.
胡伟, 徐碧玉, 张建斌, 杨晓颖, 李美英[2]2008年在《香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建》文中研究说明研制经济方便的新型乙肝植物口服疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。研制乙肝植物口服疫苗遇到的一个主要的困难是HBsAg基因在受体植物中的表达量低。香蕉是植物口服疫苗理想的受体。因此,以香蕉为受体,进一步提高HBsAg基因表达量的研究非常必要。从pBIL2载体上克隆了香蕉果实特异表达的BanLec启动子,并引入了HindⅢ、BamHⅠ酶切位点;利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切YEPFLAG-HBS获得了HBsAg基因;通过BamHⅠ酶切位点,利用T4DNA连接酶连接了BanLec启动子和HBsAg基因,形成BanLec-HBsAg连接片段;再把该片段通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点插入pCAMBIA2300植物表达载体,成功构建香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因表达载体。
林炳英[3]2007年在《乙肝表面抗原（HBsAg）基因转化番茄的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎(hepatitis B virus)是严重危害人类健康的常见病。预防和控制乙型肝炎感染最主要的措施是接种疫苗,目前广泛地采用注射疫苗,但存在成本高,贮运过程需要冷链,注射接种需要特定的卫生机构及专业医务人员等诸多问题,因此,研制经济方便的新型乙肝疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗,可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织,通过刺激机体粘膜的特异性免疫应答,使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便,因此,“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡,开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。根据目前国内外的转基因植物作为疫苗生产系统的研究中发现,抗原基因的表达量较低,导致转基因植物口服疫苗的免疫原性低,可能引起免疫耐受等诸多问题,抗原表达量不高已成为目前转基因植物口服疫苗不能产业化的瓶颈,因此需要进一步提高抗原表达量。有研究表明利用组织特异性启动子调控基因的表达,使重组蛋白在植物中的表达具有器官或组织特异性,可大大提高外源蛋白的表达量。本研究采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因(GenBank ID M87659,1993)序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建瞬时植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌EHA105或AGL-1。介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。本研究将乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1301中,由自行克隆鉴定的番茄果实特异性2A11启动子驱动,得到植物表达载体p2A111301-HBs;及由番茄果实特异性2A11启动子和花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子双驱动,得到植物表达载体pCAM2A11-HBs。其选择性标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因,Tnos为终止子,?为增强子,以GUS基因为报告基因。建立番茄高频再生体系需要从培养基的激素配方(T1, T2, T3, T4, T5)、番茄不同外植体(子叶、下胚轴)的选择等方面进行番茄再生体系的优化。通过比较微型番茄“MICRO-TOM”子叶、胚轴和叶片对农杆菌的敏感性以及组培中的发芽率,最终选择子叶作为受体材料,其分化率和分化的不定芽的质量均明显优于胚轴和叶片。以含质粒pCAM2A11-HBs、p2A111301-HBs、及本室已构建保存的由组成型启动子CaMV35S驱动HBsAg的植物载体p1301HBs(均含有GUS基因)的根癌农杆菌侵染番茄外植体,以GUS瞬时表达效率为指标,系统研究了预培养时间、共培养条件、筛选条件等对转化率的影响的基础上建立、优化了微型番茄“Micro-tom”品种的遗传转化体系。结果表明外植体子叶预培养2d;活化后农杆菌稀释后浓度为OD6000.1,侵染5min;农杆菌侵染后暗光下共培养2d;筛选剂潮霉素(Hyg)浓度为20mg/L;在共培养基中加入100umol/L的AS,可大大提高了GUS瞬时表达率;经过脱菌处理后的材料应先恢复培养1周再加压筛选,有利于提高转化效率。将带有HBsAg-s的微型Ti质粒通过农杆菌介导分别转入微型番茄中,通过潮霉素加压筛选试验,结果选择20mg/L的潮霉素浓度作为转基因植株芽分化选择压力,选择25mg/L的潮霉素浓度作为转基因植株生根选择压力。得到转pCAM2A11-HBs番茄株系,转p2A111301-HBs,p1301-HBs的抗性愈伤刚刚开始分化抗性芽。获得的转化植株经GUS报告基因检测及PCR、Southern杂交检测,证实目的基因已整合到微型番茄“Micro-tom”的基因组中。ELISA检测结果表明在转基因番茄叶片中表达的HBsAg具有免疫活性,测得其表达量为385～891ng/g鲜重,占总可溶性蛋白(TSP)的0.0032～0.007%。由于时间关系,还不能检测转基因番茄果实中表达的HBsAg的免疫活性及表达量。目前已种植的转HBsAg基因植株35株。小番茄(Cherrytomato)是近年来新兴的小型蔬果,其营养价值高,可食性好、被普遍作为生食水果,微型番茄“Micro-tom”体型小,生长周期短,一年可种四代,具有发展为口服疫苗的良好潜力。本研究采用自行克隆鉴定的番茄果实特异性2A11启动子,以及用2A11-CaMV35S双启动子,驱动乙型肝炎病毒表面抗原小蛋白(HBsAg-s),转化微型番茄“Micro-tom”,筛选鉴定获得转基因番茄植株,期望获得较高表达量的番茄转化株系,为研制乙型肝炎转基因番茄口服疫苗,提供了一些实验、理论指导。
朱军, 胡永华, 黄惠琴, 鲍时翔[4]2005年在《ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析》文中研究说明本研究通过SDS 法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR 的方法对ACS 启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1 185bp 的ACS 启动子片段,与GenBank 报道序列相比较同源性为93.2%。经PlantCARE 软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS 启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导。为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI 101.2中间表达载体上的GUS 基因5′端前,构建了含GUS 基因的瞬时表达载体pBACS。用基因枪法将pBACS 转化到香蕉果实中,结果表明:用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS 组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点。因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达。同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak 序列,经PCR 克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp。NCBI BLAST 分析的结果表明,获得的HBsAg 基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank 中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%。将经过改造的HBsAg 基因替代pBACS 中的GUS 基因,成功构建了含有ACS 启动子和HBsAg 基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg 蛋白的转基因植株奠定了基础。
关正君[5]2011年在《樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究》文中指出乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染会导致全世界每年有上百万的人死于肝癌或肝硬化。当前预防乙肝有效的措施是采用乙肝疫苗。目前乙肝病毒基因工程疫苗主要以酵母为载体进行生产。随着转基因植物口服疫苗的发展,编码乙肝病毒抗原的目的基因被整合到植物基因组中。樱桃番茄(Lycopersicon esculentum var. cerasiforme)是普通番茄的一个亚变种,是茄科番茄属的一年生或多年生的草本植物。其营养丰富,可以生食。本研究构建了一个携带有乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导转化樱桃番茄。在转化过程中,意外获得一株转基因叁倍体突变体。由于转基因植物的大田种植和推广应用可能存在一定的风险,因而在进行基因转化的基础研究过程中,后续研究进而转为对该叁倍体突变体的生长特性(包括生理生化、抗性以及形态发生特性等方面)进行研究。1植物表达载体的构建与樱桃番茄的转化成功构建了含有adr亚型HBsAg S基因的植物表达载体pCAMBIA1301/HB,并获得了表达HBsAg S基因的转基因樱桃番茄植株。PCR鉴定和Southern杂交检测结果表明,HBsAg S基因已经整合到转化的樱桃番茄基因组中。HBsAg蛋白在转基因樱桃番茄植株中的表达量分别为100.36ng/g叶片鲜重和127.54ng/g果实鲜重。该部分内容已在vaccine2010 vol.28 No.46发表。2温室栽培转基因樱桃番茄突变体的生理生化特性分析通过Hyg(潮霉素)筛选、PCR鉴定、Southern blotting检测和流式细胞分析,获得了一株HBsAg转基因樱桃番茄突变体,该转基因樱桃番茄突变体为叁倍体,长势良好,但种子败育。本试验对温室栽培的转基因樱桃番茄突变体生理生化特性进行了详细的评价。结果表明,经PCR鉴定, HBsAg基因仍然稳定表达在温室栽培的转基因樱桃番茄突变体基因组中。流式细胞仪分析结果表明,该突变体是叁倍体。与非转化樱桃番茄相比,温室栽培转基因突变体表现出较高的叶绿素含量和蛋白质含量、较好的保水能力和膜渗透性、以及较强的抗氧化酶活性。该研究结果已被Russian journal of genetics接收,将于2011 vo1.47 No.8发表。3转基因樱桃番茄突变体愈伤组织对盐胁迫的生理响应盐度是影响植株生长的重要因素。研究转基因植物在盐胁迫逆境条件下的生理响应,可以明确转基因植物在生长和发育过程中的抗盐性和抗逆性。鉴于转基因樱桃番茄突变体在温室栽培过程中有较强的抗性,本试验以HBsAg转基因樱桃番茄突变体愈伤组织为试验材料,研究了其在不同盐浓度下的生理生化变化。结果表明：1) NaCl处理转基因樱桃番茄突变体愈伤组织时,盐的半致死浓度为80mmol/L。转基因樱桃番茄突变体愈伤组织耐盐的阈值大约在60mmol/L-100mmol/L。2)盐胁迫下,随着NaCl浓度梯度的增加,突变体愈伤组织的SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)和APX(抗坏血酸过氧化物酶)活性呈先升高后降低的趋势。在盐浓度大于40mmol/L时,各酶活性开始受到盐胁迫的影响,但CAT活性变化较小。相同盐浓度胁迫下,突变体愈伤组织各酶活性均明显高于非转基因樱桃番茄,表明突变体愈伤组织耐盐性较强。3)NaCl胁迫下,突变体愈伤组织的H202(过氧化氢)含量、MDA(丙二醛)含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和电导率均随NaCl处理浓度的增加而持续升高。但在相同NaCl浓度胁迫下,与非转基因樱桃番茄愈伤组织相比,突变体愈伤组织的H202含量、MDA含量和电导率较低,可溶性糖含量和脯氨酸含量较高,表明突变体的抗逆性较强。4)随着盐胁迫的加重,突变体愈伤组织叶绿素含量均有下降趋势。且在相同处理浓度下,突变体愈伤组织中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均高于非转基因樱桃番茄愈伤组织。表明在盐胁迫条件下突变体愈伤组织的光合作用较强。以上结果表明,转基因樱桃番茄突变体愈伤组织的耐盐性明显提高,与SOD、POD和APX活性变化以及可溶性糖含量的积累密切相关。4转基因樱桃番茄突变体组培苗对盐胁迫的生理响应本试验以HBsAg转基因樱桃番茄突变体组培苗为试验材料,分析了其在不同盐浓度下的生理生化变化,旨在为突变体温室栽培的抗性研究提供前期理论基础。研究结果表明：1) NaCl处理转基因樱桃番茄突变体组培苗的过程中,盐的半致死浓度为150mmol/L。转基因樱桃番茄突变体组培苗耐盐的阈值大约在100mmol/L-200mmol/L。2)盐胁迫下,突变体组培苗SOD、POD、CAT、APX活性和脯氨酸含量随着NaCl浓度的增大呈先升高后降低的趋势。在盐浓度大于60mmol/L时,各抗氧化酶活性开始受到盐胁迫的影响。在100mmol/LNaCl浓度胁迫下,脯氨酸的积累量达到顶峰。相同盐浓度胁迫下,突变体组培苗各酶活性以及脯氨酸含量均高于非转基因樱桃番茄。3)随着NaCl浓度逐渐增大,突变体组培苗的H202含量、MDA含量、可溶性糖含量和电导率均随NaCl处理浓度的增大而大幅度增加。但在相同NaCl浓度胁迫下,突变体组培苗的H202含量、MDA含量和细胞膜渗透性均低于非转基因樱桃番茄。4)盐胁迫处理明显降低了各组培苗的叶绿素含量,总体上随着胁迫强度的加剧,叶绿素含量呈下降趋势。在同一盐浓度处理下,突变体组培苗的叶绿素a、b含量及总叶绿素含量均高于非转基因樱桃番茄组培苗,表明突变体的光合作用较强。以上结果表明,SOD和APX活性的变化、可溶性糖和脯氨酸的积累以及叶绿素含量的变化与转基因樱桃番茄突变体组培苗的耐盐性较强有关。5转基因樱桃番茄突变体发育过程中的形态结构变异基于转基因樱桃番茄突变体的倍性、生理生化特性以及抗性都发生明显的变化,本研究从胚胎学角度研究其变异特性。以相同培养条件下的非转化樱桃番茄和转基因樱桃番茄突变体叶片为试验材料进行愈伤诱导,通过石蜡切片技术和电子显微镜技术观察了其在外植体分化和愈伤发育过程中形态发生的变化特征。组织学分析表明,培养21d时,在突变体愈伤组织块的腋生部位出现不定芽原基,进而发育成不定芽。培养35d时,同时出现各种类型的胚状体。表明转基因樱桃番茄突变体在再生过程中,同时出现器官发生和体细胞胚发生两种途径,且以器官发生为主；非转基因樱桃番茄只通过一种形态发生途径即体细胞胚发生进行再生。进一步通过扫描电镜和透射电镜观察其细胞超微结构变化。结果表明,与非转基因樱桃番茄相比,突变体愈伤组织细胞在发育的各个阶段,一些细胞器的形态和数量(如高尔基体、线粒体、叶绿体等)有明显的变异。进一步证明转基因樱桃番茄突变体在形态建成和器官发育的过程中出现变异。该部分研究结果将于《电子显微学报》2011年vo1.30 No.2发表。6转基因樱桃番茄突变体发育过程中的生理生化变化生理生化变化是形态发生的基础。本研究以转基因樱桃番茄突变体叶片外植体器官发生和体细胞胚发生的诱导为基础进行组织培养,研究了突变体叶片再生过程中外植体抗氧化酶活性和某些生理参数(生长量、可溶性蛋白质含量、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及IAA氧化酶活性等)的变化趋势。结果表明：樱桃番茄转基因突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性有明显的变化。在培养初期SOD活性逐渐增高,在培养21d时达到最大活性,此后其活性缓慢降低。POD活性在整个发育过程中呈下降趋势。CAT活性整体呈上升趋势,但变化幅度较小。IAAO(吲哚乙酸氧化酶)活性在培养42d前表现为缓慢的上升趋势,并在42d活性最高。表明SOD和POD活性与器官发生的早期事件密切相关。IAAO活性与芽的形成有关。突变体的愈伤增长率在培养21-28d时快速降低,在28d后又表现为快速的增长趋势。该现象的出现是由于突变体在愈伤分化期间,首先出现了器官发生方式所致。突变体愈伤组织的可溶性蛋白质含量在整个发育过程中变化趋势与非转基因樱桃番茄相似,但发生变化的时期不同。表明可溶性蛋白质含量与器官发生密切相关。该部分研究结果已被《核农学报》录用,将于2011 vol.25 No.3发表。综上所述,本研究成功地进行了HBsAg/adr基因在樱桃番茄中的表达,并获得一株转基因突变体。研究表明,该突变体的倍性、生理生化特性、抗性以及形态发生途径都发生了明显的变异。
朱军, 胡永华, 黄惠琴, 鲍时翔[6]2005年在《ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析(英文)》文中认为本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR的方法对ACS启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1185bp的ACS启动子片段,与GenBank报道序列相比较同源性为93.2%。经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导。为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI101.2中间表达载体上的GUS基因5'端前,构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS。用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中,结果表明:用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点。因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达。同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak序列,经PCR克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp。NCBIBLAST分析的结果表明,获得的HBsAg基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%。将经过改造的HBsAg基因替代pBACS中的GUS基因,成功构建了含有ACS启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg蛋白的转基因植株奠定了基础。
娄晓鸣[7]2004年在《乙肝表面抗原大蛋白（S1S2S）基因在苹果和番茄中的转化与表达研究》文中提出本文以乙肝表面抗原大蛋白S1S2S为目的基因，构建了由番茄2A11果实特异启动子控制PRS-S1S2S基因表达的植物双元载体pYF9616；以苹果叶片为受体材料，通过研究影响农杆菌介导苹果遗传转化的因素，确立了红爱佳和凉香季节叶片高效再生和转化体系，获得了能正常转录和表达S1S2S基因的转基因苹果和番茄。实验内容和结果如下。 1．植物表达载体的构建 从番茄品种强力米寿的总DNA中克隆番茄果实特异启动子2A11，通过PCR方法合成乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因，在其3，端引入一段内质网滞留序列(SEKDEL)，5，端引入烟草分泌信号肽序列(PR-S)，构成带分泌信号肽及内质网滞留序列的乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S，并完成全序列测定。再构建由番茄2A11果实特异启动子控制PRS-S1S2S基因表达的植物双元载体pYF9616。 2．苹果叶片高频再生和转化系统的建立 通过分析不同细胞分裂素、不同固化剂、继代培养时间、暗培养时间、叶片极性、CH浓度对苹果叶片再生的影响，确立了苹果两品种再生系统。红爱佳添加7DZ1mg/L，NAA0.1mg/L的MS培养基，以近轴面接触培养基，经15-20天的暗培养获得再生频率100％的再生系统，凉香季节宜TDZ2mg/L，NAA0.1mg/L的MS培养基，其它条件同红爱佳，获得95.2％的再生频率。 研究了Km选择压、Cb浓度、农杆菌浸染时间、共培养时间等遗传转化的必要条件，确立了苹果两品种的转化体系：红爱佳以MS培养基添加TDZ1mg/L，NAA0.1mg/L，凉香季节MS培养基中添加TDZ2mg/L+NAA0.1mg/L为基本培养基，外植体经农杆菌浸染5min，共培养2天，再进行红爱佳Km12.5mg/L，Cb250mg/L或凉香季节Km6.25mg/L，Cb250 mg/L的选择培养，经1-2次筛选，以获得抗性芽。 3．转基因苹果、番茄的鉴定，目的蛋白的定量，金免疫电镜观察 利用优化的转化体系，通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳、凉香季节和番茄中，得到了抗卡那霉素抗性的GUS阳性转化植株。GUS染色阳性的转基因苹果经PCR扩增及RT-PCR检测证实S1S25基因已整合入转基因苹果的基因组，并在转录水平得到了表达，EILSA检测证明在苹果中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白.根据El LsA定童结果，苹果叶片最大表达童为1 1.180ng/g鲜重.番茄成熟果实最高表达童为523.53呵g鲜重，是叶子等其它器官表达量的110一285倍，实现了果实特异的高表达童.对转基因苹果叶片和番茄成熟果的蛋白初提液进行金免疫电镜观察，证实转基因苹果和番茄具有自我组合抗原蛋白的能力，观察到了和人血清中HBsAg、酵母中表达的重组HBsAg大小相近的平均直径为22nm左右的HBs人g颗粒.
贺红霞[8]2003年在《乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建及草莓再生体系建立》文中认为乙型肝炎(Hepatitis B，HB，以下简称乙肝)是世界上分布最广泛的传染病之一，是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV，以下简称乙肝病毒)引起的。我国是乙型肝炎的高发区，该病毒携带者的人数已达到甚至超过10％。此病呈慢性病程，可引发急、慢性肝炎，严重的导致肝硬化甚至肝癌。目前尚无彻底治愈本病的药物。预防和控制乙肝病毒(HBV)感染最主要的措施是接种乙肝疫苗。乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)是HBV包膜蛋白的组分，具有良好的免疫原性；克隆HBsAg基因，将其转入酵母中，表达产物进行加工处理即为目前广泛使用的乙肝病毒基因工程疫苗，因其生产成本高，贮运过程需要冷藏链，注射接种需要一定的设备及专业医务人员，难以在广大发展中国家推广。 20世纪90年代初，世界卫生组织提出需要廉价，不需冷藏的疫苗之后，查尔斯J安特贞提出了一个设想，即通过植物基因工程来生产食用疫苗。就是将抗原基因导入植物，使其在植物中表达，人或动物摄取该植物或其中的抗原蛋白质，就可以产生某抗原的免疫应答。目前乙型肝炎病毒的转基因食用疫苗研究已有很大进展，HBsAg基因导入烟草、马铃薯、羽扇豆和莴苣、花生等植物中，有关HBsAg基因导入草莓中的研究未见报道。 用草莓为载体生产乙肝疫苗有如下特点：(1)改变了传统人类疫苗的接种方式，以口服草莓或草莓汁的途径来接种疫苗；(2)降低了疫苗的生产成本；(3)可以将转基因草莓苗分发到各个地区，用各地栽种后生产的新鲜草莓作为疫苗供给当地，这种形式保证了疫苗的质量和生产的持续性，简化了疫苗的保藏和运输条件。 本研究旨在构建HBsAg的高表达载体用以转化草莓，最终实现利用转基因草莓生产口服乙肝疫苗，这对于我国防治乙型肝炎有重要的意义。吉林农业大学硕士论文乙肝表面抗原墓因植物表达载体的构建及草芬再生体系的建立 我们对以下叁方面的内容进行了研究: 1、根据Genebank上发表的乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)序列设计一对引物，用PCR法从乙肝病毒DNA中扩增出8 1 Obp的DNA片段。随后将该基因克隆到T一载体上，热激法转化大肠杆菌，对重组质粒中的插入片段进行DNA测序，证明与HBsAg的碱基序列基本相同。 2、利用实验室保存的sK(一)和PBADH质粒，构建了HBsAg基因的植物表达载体PBH.PBADH是一个双元表达载体，由PBin438载体和外源基因BADH(甜菜碱合成酶基因)组成，pB 1 n438载体上含CaMv双重355启动子和翻译增强子翎v的 “O”片段和一个嵌合的NOS一NPTn基因，NPTll基因产物能够磷酸化卡那霉素及其衍生物，因此这个基因可用于转化植物的筛选。把BADH基因从PBADH中去除，将HBsAg基因连入，使其在双355启动子控制下，构建出植物表达载体pBH。 3、检验了所构建的植物表达载体。首先优化了百脉根的叶盘法转化体系，之后利用农杆菌介导法将pBH转入百脉根，获得了36株卡那霉素杭性筛选苗，经PCR检测有9株为阳性，从而初步验证了该载体能将HBsAg基因导入植物中.为下一步转化草毒提供了表达载体，为研究利用转基因草毒生产乙肝疫苗莫定良好的差J出。
高正伦[9]2007年在《乙肝病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达》文中认为我们在前期工作中建立了人参愈伤组织细胞表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的植物表达系统,并就提高表达进行了培养条件的摸索。为了进一步提高HBsAg的表达,我们从表达载体的改造上做了一些探索,对调控HBsAg基因表达的启动子以及翻译增强子进行了改造,构建了十二种不同的植物细胞表达载体pBI/EP、pBI/2EP、pBI/3EP、pBI/4EP、pBI/5EP、pBI/6EP、pBI/7EP、pBI/8EP、pBIBSa(pBI35S)、pBI/2EPomega、pBI/35Somega和pBI/35SRomega,用这些载体分别转化农杆菌LBA4404,再与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞,从而将HBsAg基因以及调控基因整合到人参细胞基因组中,经过连续继代培养选育出一株高产细胞系PBIo。PBIo是由质粒pBI/35Somega转化的人参细胞选育而来,携带花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子以及与之串联的烟草花叶病毒TMV(U1株)翻译增强子omega序列。通过对表达载体的改造使HBsAg基因表达有显着提高。在实验中还发现,omega反义RNA序列也具有较强的提高翻译效率的功能。
李田[10]2008年在《乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达》文中指出乙型肝炎是一种严重危害人类健康的全球性疾病,接种乙肝疫苗是目前预防乙肝病毒(HBV)感染的主要措施。乙肝病毒表面抗原(HBSAg)为HBV包膜蛋白的组分,不具感染性,是乙肝疫苗的有效成分。现行乙肝疫苗主要通过酵母表达系统得到,其生产工序复杂、需要专门的纯化设备和相应的技术人员,成本较高,从而限制了乙肝疫苗的广泛应用,而利用植物生产乙肝疫苗可有效弥补这一不足。因此,本实验构建了含乙肝病毒表面抗原基因的植物表达载体,并将其分别在烟草和番茄中成功进行了表达。本实验首先构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,具CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于根癌农杆菌的转化;其次将表达质粒导入农杆菌,用于对烟草外植体的遗传转化,获得的抗性植株经检测,结果表明乙肝病毒表面抗原基因在烟草中得到表达;最后,将HBSAg基因用于番茄的遗传转化,其间建立了番茄再生体系以及番茄遗传转化体系,获得的抗性植株经检测,证明HBSAg基因在番茄植株中也同样获得了表达,这为利用转基因番茄生产口服疫苗提供了一定的理论指导和实验基础。
参考文献：
[1]. HBsAg基因的克隆及香蕉果实表达载体的构建[D]. 胡永华. 华南热带农业大学. 2004
[2]. 香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建[J]. 胡伟, 徐碧玉, 张建斌, 杨晓颖, 李美英. 果树学报. 2008
[3]. 乙肝表面抗原（HBsAg）基因转化番茄的研究[D]. 林炳英. 华南热带农业大学. 2007
[4]. ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析[C]. 朱军, 胡永华, 黄惠琴, 鲍时翔. 2005植物分子育种国际学术研讨会论文集. 2005
[5]. 樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究[D]. 关正君. 西北大学. 2011
[6]. ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析(英文)[J]. 朱军, 胡永华, 黄惠琴, 鲍时翔. 分子植物育种. 2005
[7]. 乙肝表面抗原大蛋白（S1S2S）基因在苹果和番茄中的转化与表达研究[D]. 娄晓鸣. 南京农业大学. 2004
[8]. 乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建及草莓再生体系建立[D]. 贺红霞. 吉林农业大学. 2003
[9]. 乙肝病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达[D]. 高正伦. 吉林大学. 2007
[10]. 乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达[D]. 李田. 福建师范大学. 2008
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