冷波[1]2003年在《一种新的球孢白僵菌内切几丁质酶的纯化和抗血清的制备》文中进行了进一步梳理当前，病虫害已成为阻碍世界农林业发展不可忽略的一个重要因素，而传统的化学杀虫方式正随着其对环境的巨大破坏作用以及病虫害对化学农药产生的耐抗药性等因素，其使用越来越受到限制。研制和开发广谱高效的生物杀虫剂已成为一个亟待解决的课题。昆虫病原真菌是自然界中存在的一大类能以多种昆虫为寄主、有效控制昆虫种群数量的昆虫天敌。相比于其他生物杀虫剂，昆虫病原真菌具有寄主范围广、对环境和天敌安全、传播范围广、可循环杀虫、资源丰富、害虫不易产生抗性以及主动杀虫作用等优点，在生物杀虫产业中有着广阔的应用前景。然而，昆虫病原真菌杀虫剂在实际使用中，由于受到其致死昆虫速度慢、效果不稳定等因素的影响，造成其市场占有率很低。究其原因，主要是人们对昆虫病原真菌的致病分子机理还不甚了解。已有研究表明，几丁质是昆虫体表的重要组成成分，是昆虫防止机械损伤和抵御病原菌入侵的重要结构。昆虫病原真菌侵染昆虫过程中最重要的一步是对昆虫体壁的穿透，该过程是由真菌孢子在昆虫体壁萌发时所产生的机械压力，和其所分泌的一系列包括几丁质酶在内的水解酶的作用下完成的。为进一步研究昆虫病原真菌的致病分子机理，及利用基因工程技术改良杀虫菌株奠定基础，本论文开展了球孢白僵菌几丁质酶的纯化工作。另一方面，基于抗原抗体的特异性反应，应用免疫技术来研究分析蛋白质的结构、功能、同源性、进化及其基因表达等，已成为一种广为应用的研究手段。为此，本论文还进行了几丁质酶抗血清制备等研究。现将主要研究内容和结果总结如下： 1．产几丁质酶菌株的比较 以胶体几丁质为唯一碳源，利用几丁质酶的可诱导性和分泌性，在27±1℃、170±10rpm的诱 西府农业人学二月叁届后上学应用文导条件下培养3d，比较各菌株每6h的几了质酶活性变化情况，从本实验室的保存菌株中筛选出了产田能力相对较高的el习用于实验。2．sbl－l由样几丁质酶活住的诱导曲线 以经筛选得到的Bbll为实验对象，在诱导培养基或含h葡萄糖的诱导培养基中，27士互℃、170士 10po的诱导条件下诱导培养 10d，根据每 12h的几丁质访活性变化情况，得到了其产几了质酶的时间曲线。发现阶11在168h时酶活性可达到最高，并依此设定了纯化工作的诱导时间。同时，研究结果也显示，葡萄糖对几丁质酶的产生具有抑制作用。3．回巴1一互几丁质酶的纯化 诱导培养Bbll得到的发酵波经抽滤、75＄的破获盐析、AcAS4凝胶过滤层析和DEAE－Cellulose离子交换层析等纯化技术处理后，得到了电泳纯的内切几丁质酶。4．几丁质酶性质的鉴定 将经各步纯化操作处理后得到的内切几了质历进行SDS－RAOE电泳，银染后显示为单带，测得其分子量为33kDa。IEF电泳检测得知其p值为5．6，与其它已报道的杀虫真菌几丁酶对比结果表明，该几了质酶为一种新的几了质酶，命名为Blxlll ti．5．BI，c．’．tl几丁质酶抗血清的制备 以纯化得到的Blx’lltl为抗原，按一定的免疫程序经区部、背部、腹腔及耳静脉等途径免疫家兔，6周后获得收价达到l：32的几丁质酶抗血清，该抗血清经流技分级盐析后效价可保持在1：16。
范艳华[2]2006年在《球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良》文中研究指明昆虫病原真菌具有主动侵染宿主的特点，是自然界昆虫种群数目的重要调节因素，也是防治刺吸式害虫和鞘翅目害虫的有效手段，因此具有广阔的应用前景。但是，击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点限制了昆虫病原真菌更广泛的应用。研究表明，昆虫病原真菌菌丝穿透体壁是其侵染致病的关键步骤。在此过程中，真菌要分泌蛋白酶、几丁质酶、脂酶等多种水解酶来降解昆虫体壁，其中几丁质酶和蛋白酶具有重要作用。 研究表明，在昆虫病原真菌中超量表达几丁质酶和蛋白酶基因可以提高菌株的毒力。为了进一步提高杀虫真菌的防治效果，本文采用DNA shuffling和结构域融合等技术对球孢白僵菌降解体壁的几丁质酶(Bbchit1)和蛋白酶(CDEP-1)基因进行分子改良。利用DNA shuffling技术对球孢白僵菌的几丁质酶基因Bbchit1进行定向进化，获得了几丁质酶活性提高的突变体；通过对不同来源几丁质结合域的比较，发现家蚕几丁质结合域与几丁质的结合能力最强。转基因结果表明，带有家蚕几丁质结合域的融合几丁质酶和融合蛋白酶均可以显着提高球孢白僵菌的毒力。该结果表明，几丁质结合域在提高杀虫真菌的毒力上具有重要作用。据我们所知，目前还未有利用DNA shuffling技术提高几丁质酶活性的成功例子，也未有在降解昆虫体壁水解酶上添加几丁质结合域提高昆虫病原真菌毒力的报道。主要研究结果如下： 1．Bbchit1的DNA shuffling 1．1 以大肠杆菌为展示菌DNA shuffling体系的建立 DNA shuffling中的关键技术是高效筛选体系的建立。本文选择大肠杆菌作为展示菌，根据菌落在几丁质平板上形成透明圈的大小筛选几丁质酶活性提高的突变体。因此，在大肠杆菌中表达的Bbchit1必须分泌到胞外并具有生物学活性。 比较了5种不同来源的信号肽对Bbchit1分泌的影响。结果表明：1)胡萝卜欧氏杆菌果胶酶PelB信号肽引导Bbchit1分泌的能力最强；2)低温有利于Bbchit1在周质空间和胞外的累积。在18℃，胞外Bbchit1的产率是37℃的10倍。根据以上结果，选用PelB信号肽作为Bbchitl shuffling筛选体系的前导肽，并采用18℃低温筛选shuffling文库。 1．2 通过DNA shuffling获得几丁质酶活性提高的突变体 经过叁轮DNA shuffling，筛选了约1.5×10~5个克隆，最终获得两个几丁质酶活性分别提高了36％和56％的突变体shu-1和shu-2。其中，shu-1突变发生在V251E，shu-2突变发生在D71N和A281E。shu-1和shu-2的Km值低于野生型几丁质酶，
参考文献：
[1]. 一种新的球孢白僵菌内切几丁质酶的纯化和抗血清的制备[D]. 冷波. 西南农业大学. 2003
[2]. 球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良[D]. 范艳华. 西南大学. 2006