副溶血性弧菌对头孢噻肟耐药微进化机制的初探

论文摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种重要的食源性病原菌,广泛存在于河口、海洋环境和海产品中,生长温度在1044℃,最适温度3537℃。根据国家食源性疾病监测系统的官方统计,副溶血性弧菌是引起我国食源性细菌中毒的主要原因,尤其是在沿海地区。抗生素作为治疗人类传染病的药物非常有用,同时抗生素在畜牧业和水产养殖业中也得到了广泛的应用,抗生素在水产养殖中的过度使用导致了副溶血性弧耐药性的增加。全基因组测序技术和转录组学技术的应用可预测微生物潜在的耐药机制,进一步探明细菌获得耐药性的原因。为了了解副溶血性弧菌耐药进化机制,本论文做了以下研究1.人工诱导副溶血性弧菌对头孢噻肟产生耐药性及其进化前后耐药谱的变化;2.获得耐药型与原始副溶血性弧菌转录组学分析;3.获得耐药型与原始副溶血性弧菌基因组学分析;4.副溶血性弧菌头孢噻肟耐药微进化机制研究。本研究的具体内容和结果如下:1.人工诱导副溶血性弧菌对头孢噻肟产生耐药性及其进化前后耐药谱的变化本研究建立了一种诱导副溶血性弧菌产生头孢噻肟耐药性的方法。主要步骤如下:1).筛选敏感菌株:通过肉汤倍数稀释法筛选出头孢噻肟敏感型的副溶血性弧菌菌株。2).亚致死浓度头孢噻肟对副溶血性弧菌进行初步诱导:用0.5倍MIC值的头孢噻肟对敏感型菌株的菌液进行处理。3).亚致死浓度头孢噻肟连续诱导:用0.5倍MIC值的头孢噻肟对菌液进行处理,使该菌株持续存在于亚致死的头孢噻肟浓度条件下生长,直至副溶血性弧菌产生头孢噻肟的耐药性,即其MIC值达到CLSI规定的耐药标准。在30天内副溶血性弧菌对头孢噻肟产生耐药性,MIC由初始的0.125μg/m L达到第30天的64μg/m L,是原来的512倍。VPC1第17天达到了中介耐药,第28天达到了耐药水平,获得耐药菌株经过8次传代后它仍然对头孢噻肟耐药,说明VPC1获得的对头孢噻肟的耐药性可以稳定遗传。对30天中每天诱导后的菌株进行保存,依次标号为P0,P1,…,P30。有趣的是,相对于P0（即原始菌株VPC1）,P30对第一代头孢类抗生素头孢唑林（KZ）和第二代头孢类头孢西丁（Fox）已产生耐药性,但对第三代头孢类头孢他啶（CAZ）依然敏感。副溶血性弧菌P0和P30都检测出来了flo R,sul I和sul II,诱导前后耐药基因没有变化。2.获得耐药型与原始副溶血性弧菌转录组学分析从转录组学的角度揭示其耐药性进化的初步机制,收集敏感型的副溶血性弧菌与获得耐药型的副溶血性弧菌菌体送到华大基因进行转录组测序。比较了敏感型的副溶血性弧菌与获得耐药型的副溶血性弧菌表达的m RNA的差异性,浮游菌和被膜菌菌体共14个样品（三个生物学重复）,对应的标号为P0,P5,P10,P15,P20,P25,P30和B0,B5,B10,B15,B20,B25,B30。每个样品平均产出2.00Gb数据,参考Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633（NCBI accession:NC004603.1）基因组进行拼接与质量评估,与参考基因组的平均比对率为81.32%。根据每个基因的FPKM值进行样本间表达基因相关性分析,P0菌株与P30菌株之间的基因表达相关系数为0.801,B0与B30相关系数为0.796。本实验差异表达基因筛选用的是NOISeq方法,差异基因筛选条件是:q-value（校正后的p-value）

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 洪斌

导师: 赵勇

关键词: 副溶血性弧菌,诱导方法,耐药表型,耐药机制,全基因组测序,转录组测序

来源: 上海海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海海洋大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000514

总页数: 92

文件大小: 5651K

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