李宏[1]2004年在《植物MARs的ARS功能鉴定以及对gus基因表达活性的研究》文中研究表明转基因技术已被广泛应用于物种改良和分子生物学的基础研究,随着大量转基因植株的获得,人们发现外源基因沉默和外源基因表达量过低的问题普遍存在。近年来发现将 MAR 序列构建到表达盒两侧不仅可以克服基因沉默增强外源基因表达,还可以促进外源基因在后代中的稳定遗传。因此,MAR 是一种很好的基因表达调控元件,分离具有良好增强效果的 MAR 序列对于优化转基因技术有着重要意义。 我们分别对本试验室分离得到的六个植物 MARs (TM1, TM2,TM3,AM1,AM2,AM4)进行 ARS(Autonomous Replicating Sequence)功能鉴定,发现 TM1 和 AM4 具有强的自主复制功能,而其他四个植物MARs 序列无 ARS 活性。为了进一步对酵母自主复制功能进行深入研究,利用 PCR 方法对 TM1 和 AM4 进行亚克隆,相应亚克隆分别命名为TM1-1、TM1-2、TM1-3、AM4-1、AM4-2 和 AM4-3。实验发现,TM1-3和 AM4-3 不仅具有比完整 MARs 更高的活性,而且在酵母转化效率、转化稳定性及生长速度方面也优于完整片段。为进一步证明具有 ARS 功能的 MAR 增强外源基因表达作用,我们将具有 ARS 功能的 TM1 和 AM4 以及具有 ARS 功能的亚克隆片段 TM1-3和 AM4-3 分别插入植物表达载体 pBI121 中 gus 基因表达盒的两侧,通过转基因植株来检测这四个片段对 gus 基因表达的影响。实验结果表明,TM1、TM1-3、AM4、AM4-3 分别使外源基因在烟草中稳定表达增强 1.38倍、2.41 倍、1.23 倍和 1.81 倍,实验中发现尽管 TM1, TM1-3, AM4, AM4-3 1
黄慧珍[2]2005年在《烟草和杨树核基质附着区（MARs）的分离及其功能分析》文中提出核基质附着区 (Matrix Attachment Regions, MARs) 是与核基质(或核骨架)特异结合的DNA 序列,属于非编码序列,富含AT。通过与核基质的结合,它能使染色质形成独立的环状结构,调控基因的转录,减少由于位置效应引起的转基因沉默。MARs在抑制转基因沉默、提高转基因表达水平、消除转基因个体间表达水平的差异等方面起着重要的作用。 本文采用两种不同的方法分别从烟草和欧洲黑杨中分离出MARs,并把它们构建到植物表达载体中,研究它们对转基因表达的调控作用。 以PCR 方法从烟草基因组中扩增到两个DNA 片段(M14 和M17)的序列分析表明,它们具有90%A-T box,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列(ARS,autonomously replicating sequences),碱基非配对区(BUR,base unpairing region),MAR 识别序列(MRS,MAR recognition sequence),复制起始点(ORI,origin of replication),弯曲DNA 序列(curved DNA motifs)等典型的MAR 序列特征。将它们分别构建到植物表达载体pCAMBIA2301 GUS 基因(uidA)表达盒一侧及两侧,通过农杆菌介导转化烟草。组织化学染色法定性检测GUS 活性表明,带有M14 和M17 的uidA 基因在转基因烟草中稳定表达。GUS 活性的定量检测表明,表达载体uidA 基因一端或两端连接有MAR 的转化烟草中,GUS 的表达水平与对照相比都有了明显提高,而uidA 基因两侧连有MAR 的载体其提高表达水平的效果优于一端连有MAR 的载体,可使GUS 活性增强3.14 倍,但不同转化个体之间表达水平的差异仍然明显。上述结果表明,所得DNA 序列为两条新的MAR 片段,并且具有提高转基因表达水平的功能。 采用高盐方法从欧洲黑杨悬浮细胞中分离到两个DNA 片段,并对它们的序列进行了详细的分析。发现它们具有MARs 序列的部分特征基元如:90%A-T box,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列,碱基非配对区,MAR 识别序列,复制起始点,弯曲DNA 序列等。将它们构建到植物表达载体pCAMBIA1305.1 中GUS 基因(uidA)表达
薛华[3]2006年在《烟草TM2序列在转基因植物中的应用与功能分析》文中进行了进一步梳理植物基因工程研究为培育作物优良新品种开辟了一条新的路径,植物转基因技术作为植物基因工程的关键组成部分已经成为改良作物品种的重要手段。一个优秀的转基因植物我们首先希望它的外源基因能够按照设计要求有效的进行表达,但是转基因沉默现象的发生使基因的商品化进程受到了严重的影响。因此,提高外源基因的表达水平、减少转基因沉默的发生是一个亟待解决的问题。以往研究者往往通过去甲基化或者是改变启动子等方式来试图减少转基因沉默现象的发生,这些措施都取得了一定的效果,但不是十分理想。近些年来,研究者开始试图从染色质结构的调控水平上来破解转基因沉默的秘密,因此,把基因组DNA和染色质骨架/核骨架联系起来的核基质结合序列的研究逐渐受到了研究者的重视。核基质结合序列(Matrix Attachment Regions,MARs)是真核生物基因组上一段富含A/T的序列,通过与染色质结合,MARs之间的染色质区域会形成染色质环,每一个环为一个独立的结构单位和基因表达调控单位。TM2是本实验室从烟草核基质中分离得到的一个具有一般MARs结构特征的DNA序列,核基质体外结合实验证明TM2与水稻核基质具有很强的体外结合能力。为了验证TM2在植物体内的功能,我们构建不同的植物表达载体转化了烟草和水稻,对转基因植株中TM2连接的外源基因的表达情况进行了分析。为了进一步研究TM2的作用机理,本试验还对TM2进行了序列的缺失分析以及转基因植株T-DNA的插入位点分析,主要试验结果如下:1.通过体内核基质结合序列的分离,首先从烟草中分离得到了一些含有核基质结
王健美[4]2002年在《烟草MARs序列的克隆、功能研究及其在杨树中的应用》文中研究指明在转基因植物的研究中，常常出现转基因沉默现象，又叫转基因失活，这种现象对于植物基因工程的应用与作物改良是一大障碍。过去，人们常常通过去甲基化或改变启动子等方式试图缓解这一现象的发生，但效果甚微。近年，MARs序列的发现及功能研究为克服转基因沉默、培育外源基因高效表达的转基因工程农作物提供了一条有效的途径。本试验通过PCR方法从烟草基因组中分离出叁段MARs序列，并对其序列特征及其功能进行了分析研究，从中筛选出具有明显降低转基因沉默功能的强MARS序列，并将其应用于杨树基因工程育种。具体试验结果如下： 1．根据MARs序列的特征设计了两对引物，以烟草基因组DNA为模板进行PCR，得到了叁段MARs序列，分别命名为TM1(1165bp)、TM2(1002bp)和TM3(475bp)。将这叁段MARS序列与GenBank中的所有MARs序列进行DNA同源性比较，发现TM1与Rb7同源性高达99％，故认为二者是同一段MARs序列。而在GenBank中未发现TM2和TM3的同源性序列，将其作为两个新MARs序列在GenBank中注册，注册号码分别为：AF373415和AF373413。 2．序列分析表明，TM1、TM2和TM3富含AT序列，并且具有几个MARS序列中常见的DNA结构域，如：A-box、T-box、TATAAA、拓扑异构酶Ⅱ识别切割序列、DNA解旋序列等。 3．将TM1、TM2和TM3分别以顺式重复方向插入到pBI121的T-DNA结构域中，使MARs序列位于CaMV35S启动子控制的GUS基因两翼，构建了植物表达载体pBITMIGUSTM1、pBITM2GUSTM2和pBITM3GUSTM3，两段MARs序列之间的距离为2.9kb。 4．将上述叁个表达载体与不包含MARs序列的pBI121表达载体经农杆菌介导转化烟草，分别获得了24株、28株、15株和22株转基因烟草，PCR结果显示，MARs序列已经整合到其基因组中。 5．对获得的转基因烟草叶片进行GUS活性定量测定，发现这叁段MARs序列均能不同程度地提高GUS基因的整体表达水平。与不包含MARs序列的转基因植株相比，TM1、TM2和TM3分别使GUS基因的平均表达水平提高了1.4倍、5.1倍和1.3倍；使转化群体中最高单株GUS基因表达水平分别提高了1.7倍、7.4倍和2.2倍。但是此叁段MARs序列均未能降低由位置效应引起的各转化体之间的转基因表达差异。将pBITM2GUSTM2高效表达载体申请了专利。 6．组织化学染色分析表明，MARs序列对外源GUS基因的瞬时表达无影响。 7．从大豆中克隆得到抗真菌病害的几丁质酶基因，将其构建到高效表达载体pBITM2GUSTM2中替代GUS基因得到表达载体pBITM2chiTM2，将其与对照表达载体pBIchi分别经农杆菌介导转化杨树，目前已建立了杨树再生体系并获得抗性芽。
佘文静[5]2010年在《果蝇gypsy绝缘子有利于拟南芥转基因高效而精确地表达》文中进行了进一步梳理目前,转基因研究已经成为反向遗传学研究的一种常规手段。将外源基因引入到生物体内有利于研究相关基因的功能,同时,对于生理调控以及生长发育方面的探究也颇为重要。然而,这些外源基因在不同的转基因株系间会呈现很大的表达差异。它们可能异常表达,甚至出现转基因沉默,从而影响研究进程。转基因拷贝数,RNA沉默,以及插入位点等诸多可能因素会导致转入基因出现表达差异。这里,我们主要研究转基因插入位点对于外源基因表达的影响及其解决方法。转入基因的一个特性就是会随机整合到宿主染色体中,因此,周围宿主染色质环境会导致插入基因出现表达差异,另外,邻近的一些调控元件(如增强子,沉默子及抑制子等)也会影响转基因的表达,这就是所谓的位置效应。先前,我们利用Gateway Technologytm构建了一系列启动子分析载体,但是,不同株系间的表达差异给后续研究带来了极大不便。因此,我们将果蝇gypsy绝缘子插入到外源基因的两侧来克服拟南芥中的位置效应。Gypsy绝缘子来源于果蝇gypsy反转录转座子,是研究得比较深入的一种绝缘子。研究表明gypsy绝缘子可以通过建立高级染色质结构域,并阻断邻近增强子或抑制子的影响来调控基因的表达,因此,gypsy绝缘子是克服位置效应的理想元件。另外,我们也共表达了gypsy绝缘子的结合蛋白Su(Hw) (Suppressor of Hairy-wing)。结果表明gypsy绝缘子可以将不同的启动子所驱动的报告基因的表达量提高8到13倍。Su(Hw)蛋白的表达能更进一步地提高表达水平,从而进一步降低表达差异系数。我们利用Su(Hw)体系构建了PIN和AFB基因家族的启动子分析载体,发现gypsy-Su(Hw)体系不仅可以提高报告基因的表达量,而且不改变启动子作用的特异性。同时,还发现,gypsy绝缘子能增强选择标记基因的表达,从而有利于转基因植株的筛选。Gypsy-Su(Hw)体系有利于拟南芥中转入基因高效而精确地表达。
武建伟[6]2012年在《几个水稻MAR序列的筛选及其初步分析》文中研究表明MAR/SAR(Matrix/Scaffold attachment region or Matrix/Scaffold association region,MAR/SAR)是真核基因组中大量存在的附着在核基质上的一段DNA序列。研究表明,MAR序列可以有效地克服植物基因工程中经常发生的转基因沉默现象,并可使外源基因在转基因受体中高效稳定表达。传统的MAR序列分离纯化方法步骤繁琐,耗时耗材。随着生物序列信息的丰富,可以逐一查看其染色体的基因图谱,并通过MAR预测技术在基因组中筛选MAR序列,可大大加快MAR序列的筛选速度和降低筛选成本。本研究利用BGI基因组数据库,以水稻基因组上转录活跃区中位于基因间隔区的序列为候选序列,使用MAR-Wiz对候选序列预测分析。根据MAR-Analysis Summary Report,筛选出 MAR-potential值较高的 10 条序列做为候选MAR序列。克隆候选MAR序列,选择gus为报告基因,将候选MAR序列连在gus表达框两端构建植物表达载体,共计构建21个植物表达载体(包括1个对照载体),通过农杆菌介导转化法获得了 509株转基因水稻植株。检测转上述转基因株中的gus酶活力,初步确定了可以明显提高外源基因表达水平的4条MAR序列,其中编号M2的序列位于chr07(06882521),可使gus表达水平提高约4倍;编号M3的序列位于chr07(21231402),可使gus表达水平提高约18倍;编号M6的序列位于chr08(25631056),可使gus表达水平提高约1倍;编号M7的序列位于chr09(20378264),可使gus表达水平提高约1倍。
苏军, 管其龙, 陈子强, 陈在杰[7]2019年在《水稻arf1基因3′-UTR片段的克隆和验证》文中进行了进一步梳理终止子是一段位于基因编码之后的序列,作为一种调控信号调控DNA的转录终止和RNA的释放,在基因工程技术应用中通常被构建在目的基因下游,用以调控基因的转录和表达.现有常用的终止子很少,克隆和验证新的终止子是植物基因工程技术发展的需要.通过生物信息学分析和Realtime-PCR表达验证,筛选出候选基因腺苷酸核糖基化作用因子(Similar to ADP-ribosylation factor1,arf1)基因,克隆了水稻arf1基因3′-UTR.结果显示,所克隆3′-UTR片段含有8个多聚信号元件和4个UE片段.将3′-UTR与gus基因融合后分别与玉米泛素启动子Ubiquitin和花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子35S连接构建植物表达载体验证3′-UTR调控表达效果.烟草瞬时表达显示3′-UTR融合的gus基因在35S和Ubi启动子驱动下,在烟草叶片中能正常表达;3′-UTR调控下的gus基因在水稻根、茎、叶、花和种子中均可稳定表达,且表达量与T-Nos终止子相当.本研究表明所克隆的3′-UTR可替代T-nos终止子,可为植物基因工程技术的应用提供新的调控元件.(图5表3参29)
参考文献：
[1]. 植物MARs的ARS功能鉴定以及对gus基因表达活性的研究[D]. 李宏. 山东农业大学. 2004
[2]. 烟草和杨树核基质附着区（MARs）的分离及其功能分析[D]. 黄慧珍. 西北农林科技大学. 2005
[3]. 烟草TM2序列在转基因植物中的应用与功能分析[D]. 薛华. 山东农业大学. 2006
[4]. 烟草MARs序列的克隆、功能研究及其在杨树中的应用[D]. 王健美. 山东农业大学. 2002
[5]. 果蝇gypsy绝缘子有利于拟南芥转基因高效而精确地表达[D]. 佘文静. 浙江大学. 2010
[6]. 几个水稻MAR序列的筛选及其初步分析[D]. 武建伟. 福建农林大学. 2012
[7]. 水稻arf1基因3′-UTR片段的克隆和验证[J]. 苏军, 管其龙, 陈子强, 陈在杰. 应用与环境生物学报. 2019
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