人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴定

论文摘要

人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses,HPV）属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对女性的杀伤力。另外,HPV的感染也可能导致生殖器癌、口腔癌、咽喉癌,及生殖器疣等疾病的产生。L1蛋白HPV病毒上的主要衣壳蛋白,占HPV衣壳蛋白总比例的80%至90%,能自组装成类病毒颗粒,具有良好的免疫原性。现上市的HPV疫苗均以L1的类病毒颗粒为基础研制。但L1蛋白具有较强的型别特异性,对研发广谱的HPV疫苗造成了一定的困难。L2蛋白是HPV病毒上的次要衣壳蛋白,与病毒感染、入核、以及成熟后组装等过程有关。L2蛋白上含有HPV的广谱综合表位,且型别特异性较小,具有诱导机体产生交叉综合抗体、提供交叉保护的潜能。因此,解析L2蛋白的结构对更深入地研究HPV的感染机制以及研发HPV的广谱疫苗具有重要的意义。为了研究L2的结构与功能,本研究首先开展了在杆状系统中表达L1与L2相互作用的VLPs的工作。分别通过共感染与共表达路径进行表达,此时的L1与L2蛋白上均不含相互作用位点。经鉴定,两条路径表达的VLPs均由L1蛋白组成,未鉴定到L2蛋白的存在。通过细胞沉淀中的包涵体鉴定发现,L2蛋白存在于包涵体中。由此能够推论:L1、L2蛋白在昆虫细胞中同时表达后,未能有效相互作用。后续本研究在L1与L2上分别引入了半胱氨酸点突变,期望两个半胱氨酸位点能形成二硫键,增强相互作用。随后将蛋白L1-Q317C与L2-E338C同时表达,结果显示,在共感染路径表达的VLPs中,可检测到L2蛋白,但含量极少。本研究继续通过HPLC比较了不同VLPs的出峰时间并推论出,发现颗粒中L2的含量虽少,却能增大VLPs的直径。相互作用位点的引入是具有一定的效果。免疫原性评价的结果显示,此VLPs的免疫未能诱发小鼠体内产生高滴度的L2中和抗体。这可能与L2在HPV大部分的生命周期中均存在于五聚体内部、极少暴露中和位点有关。由于上述获得的VLPs并不均一,不利于冷冻电镜结构解析,本研究进行了L1与L2蛋白相互作用的五聚体的表达工作。经SDS-PAGE/WB/HPLC/TEM鉴定后,确认可在杆状系统中表达经175位与428位双点突变的16L1蛋白,且此蛋白具有自组装形成HPV-L1五聚体的能力。除了L2-E338C,我们根据本实验室其他课题方向的研究结果,在L2蛋白上引入了新的突变位点——T421C,以期能更好地加强L1与L2蛋白的相互作用。但从鉴定结果发现,旧相互作用位点与新相互作用位点的作用效果均不明显,共表达L1与L2形成的五聚体中不含L2蛋白。第三部分,本研究通过截短表达L2部分功能域蛋白。第一轮截短后,本研究首先通过Co柱对截短的L2蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,洗脱样品中杂蛋白含量太高,难以用于结构解析及疫苗生产。本研究继续尝试第二轮的L2蛋白的截短,使用不同的载体和截短长度,最后用Co柱对其中六个截短蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,L2-140-340蛋白具有最佳的纯化效果,洗脱样品中杂蛋白较少,L2含量很高,纯度较高,可能以三聚体或单体的形式存在。后续将继续研究该截短L2蛋白的生物性质和活性,获得均一的L2蛋白用于结晶和结构解析。

论文目录

摘要

Abstract

缩略词（Abbreviations）

第一章前言

1.1 人乳头瘤病毒（HPV）概述

1.1.1 HPV流行病学

1.1.2 HPV分子生物学

1.1.3 HPV衣壳蛋白L1与L2研究进展

1.1.4 HPV的疫苗研究进展

1.2 蛋白表达系统

1.2.1 蛋白表达系统简介

1.2.2 杆状病毒中基因的表达

1.2.3 杆状病毒-昆虫细胞表达系统

1.3 本研究的意义、思路及目的

第二章材料与方法

2.1 主要设备

2.2 所购试剂与材料

2.2.1 菌株

2.2.2 细胞株

2.2.3 质粒与转染试剂

2.2.4 培养基

2.2.5 酶及单克隆抗体

2.2.6 实验动物

2.2.7 其它试剂

2.2.8 其它材料

2.3 配置培养基及试剂

2.3.1 配置培养基

2.3.2 配置试剂

2.4 实验方法

2.4.1 分子克隆相关

2.4.2 昆虫细胞的培养

2.4.3 杆状病毒的生产

2.4.4 外源基因的表达

2.4.5 VLPs的制备

2.4.6 五聚体的制备

2.4.7 单独L2蛋白的纯化

2.4.8 性质鉴定与分析

第三章结果部分

3.1 L1与L2相互作用的VLPs的制备

3.1.1 选用相应的载体表达L1蛋白与L2蛋白

3.1.2 表达不含L1与L2相互作用位点的VLPs

3.1.3 表达含有L1与L2相互作用位点的VLPs

3.1.4 第一部分小结

3.2 L1与L2相互作用的五聚体的制备

3.2.1 杆状系统表达单独HPV-16L1的五聚体

3.2.2 在HPV-16L2上引入新的相互作用位点

3.2.3 L1与L2相互作用的五聚体的纯化与验证

3.2.4 第二部分小结

3.3 L2蛋白的截短表达

3.3.1 第一轮L2蛋白的截短表达纯化

3.3.2 第二轮L2蛋白的截短表达纯化

3.3.3 第三部分小结

第四章讨论

4.1 L1蛋白与L2蛋白的相互作用位点

4.2 L2蛋白的广谱中和表位

小结与展望

参考文献

在校期间发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 姚巧缤

导师: 夏宁邵,李少伟

关键词: 人乳头瘤病毒,次要衣壳蛋白,杆状病毒昆虫细胞表达系统,相互作用,截短蛋白

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 厦门大学

分类号: R373

总页数: 90

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人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴定

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