蓝细菌中α-酮戊二酸到琥珀酸转化途径关键酶的催化功能与机理研究

论文摘要

三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。然而,由于缺乏α-酮戊二酸脱氢酶,蓝细菌需要通过非传统的三羧酸循环途径完成α-酮戊二酸到琥珀酸的代谢。本课题对集胞藻PCC6803中sll1981基因和鱼腥藻PCC7120中all3556基因编码蛋白作了详细研究,以深入理解蓝细菌中的三羧酸循环。蓝细菌α-酮戊二酸至琥珀酸的代谢途径中主要涉及两个关键酶,分别是α-酮戊二酸脱羧酶和琥珀酸半醛脱氢酶。α-酮戊二酸脱羧酶催化α-酮戊二酸非氧化脱羧生成琥珀酸半醛。生物信息学分析表明集胞藻PCC6803中sll1981基因可能编码α-酮戊二酸脱羧酶。本研究从集胞藻PCC6803基因组中克隆得到sll1981基因并将其连接至pCold-TF载体后转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞。通过亲和层析法纯化得到重组sll1981蛋白后研究表征了重组sll1981蛋白对丙酮酸、D-葡萄糖-6-磷酸和α-酮戊二酸的底物特异性和动力学参数。结果表明sll1981蛋白极不稳定,触发因子TF（Trigger Factor）和分子伴侣质粒pTf16表达的tig蛋白可以增加sll1981蛋白溶解性。稳态动力学数据表明sll1981蛋白是一种双功能酶,其作为α-酮戊二酸脱羧酶活性是作为乙酰乳酸合成酶活性的444倍,然而其并不具备肌醇-1-磷酸合成酶活性。尽管先前报道sll1981蛋白是肌醇-1-磷酸合成酶。琥珀酸半醛脱氢酶催化琥珀酸半醛生成琥珀酸。同源序列比对发现鱼腥藻PCC7120中all3556基因很可能编码一个琥珀酸半醛脱氢酶。本研究构建了pET28a-all3556表达质粒并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞中进行诱导表达,然后通过亲和层析法纯化得到均一稳定的all3556蛋白。酶动力学测试表明all3556蛋白是一个NADP+-依赖型琥珀酸半醛脱氢酶,同时all3556蛋白具有强烈的底物抑制性,其底物抑制浓度为0.1 mmol/L。此外,研究发现Ser157残基决定辅因子的选择性。将该残基突变成Glu或Pro后,倾向使用的辅因子由原来的NADP+转向NAD+。同时,将催化活性中心的残基突变后,发现其活性大大降低甚至没有活性,生物信息学分析和模型结构表明这些氨基酸残基是高度保守的。根据野生型和突变型蛋白的动力学参数提出了琥珀酸半醛脱氢酶的催化机理。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王小琴

导师: 李志敏

关键词: 集胞藻,酮戊二酸脱羧酶,鱼腥藻,琥珀酸半醛脱氢酶,定点突变,动力学分析

来源: 江西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江西农业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000095

总页数: 76

文件大小: 4378K

下载量: 112

相关论文文献

• [1].生物法合成α-酮戊二酸及其衍生物的研究进展[J]. 中国酿造 2020(03)
• [2].α-酮戊二酸对L-羟脯氨酸产量的影响[J]. 中国酿造 2018(07)
• [3].酶法α-酮戊二酸取得新进展[J]. 化学与生物工程 2013(12)
• [4].发酵法生产α-酮戊二酸技术的研究[J]. 食品与生物技术学报 2012(02)
• [5].α-酮戊二酸对动物肠道黏膜作用的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医 2010(11)
• [6].过程优化提高解脂亚洛酵母积累α-酮戊二酸[J]. 微生物学杂志 2019(04)
• [7].α-酮戊二酸改性壳聚糖对低浓度U(Ⅵ)的吸附性能[J]. 原子能科学技术 2015(02)
• [8].提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进α-酮戊二酸合成[J]. 微生物学报 2008(07)
• [9].双水相萃取分离α-酮戊二酸[J]. 食品与发酵工业 2018(12)
• [10].双水相萃取发酵液中的α-酮戊二酸[J]. 化学工程 2019(03)
• [11].α-酮戊二酸对肥育猪生长性能、氮沉积及氮排放的影响[J]. 饲料工业 2019(18)
• [12].中草药结合α-酮戊二酸作为饲料添加剂对断奶仔猪消化吸收功能的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医 2011(07)
• [13].α-酮戊二酸的生理功能及其在动物生产中的应用[J]. 动物营养学报 2018(10)
• [14].α-酮戊二酸对“麒麟肉鸡”早期生长性能、血液生化指标及组织器官的影响[J]. 中国家禽 2018(21)
• [15].玉米浆和表面活性剂添加对α-酮戊二酸发酵的影响[J]. 发酵科技通讯 2017(04)
• [16].α-酮戊二酸对金针菇菌丝生长及赖氨酸合成的影响[J]. 食用菌学报 2019(02)
• [17].α-酮戊二酸二甲酯抑制乳腺癌细胞增殖的机制研究[J]. 中国药理学通报 2016(05)
• [18].α-酮戊二酸与动脉粥样硬化的关系研究进展[J]. 生命的化学 2018(01)
• [19].α-酮戊二酸对动物营养物质代谢和一些功能性指标的调控作用及其机理[J]. 动物营养学报 2018(05)
• [20].亮氨酸和α-酮戊二酸对小鼠体重、血清及脏器的影响[J]. 食品与机械 2019(08)
• [21].酵母R6中α-酮戊二酸的筛选、鉴定和发酵性能的研究（英文）[J]. Agricultural Science & Technology 2015(05)
• [22].L-谷氨酸氧化酶生物合成α-酮戊二酸的工艺优化[J]. 当代化工研究 2019(03)
• [23].α-酮戊二酸对肌肉蛋白质合成的影响[J]. 中国饲料 2019(15)
• [24].强化解脂亚洛酵母菌体积累产α-酮戊二酸的pH调控策略[J]. 过程工程学报 2017(01)
• [25].蓝杆藻ATCC 51142中α-酮戊二酸脱羧酶的克隆与表达[J]. 江苏农业科学 2018(19)
• [26].α-酮戊二酸对免疫应激仔猪肝脏氨基酸代谢的影响[J]. 饲料工业 2010(03)
• [27].反相高效液相色谱法测定黄酒中的有机酸[J]. 中国酿造 2009(03)
• [28].α-酮戊二酸对脂多糖应激仔猪肠黏膜能量代谢的影响[J]. 动物营养学报 2009(06)
• [29].α-酮戊二酸对免疫应激下断奶仔猪肝损伤的影响[J]. 中国兽医学报 2010(02)
• [30].解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化[J]. 生物技术通报 2014(07)

标签：集胞藻论文;  酮戊二酸脱羧酶论文;  鱼腥藻论文;  琥珀酸半醛脱氢酶论文;  定点突变论文;  动力学分析论文;