朱蜿萍, 孔繁智, 陈小囡[1]2005年在《壳寡糖抗肿瘤免疫效应研究》文中研究说明随着对壳聚糖分子的改造及对其作用研究的不断深入,发现壳聚糖通过化学法、酶法、糖基转移法解聚而成低分子壳聚糖,不仅水溶性大,而且具有多种生物学功能,因而成为国内外开发甲壳质研究中最为活跃的领域之一,尤其是壳寡糖抗肿瘤的研究更为关注。壳寡糖的抗肿瘤效应和免疫调节作用已被人们所关注,本实验通过对壳寡糖抑瘤作用、抗肿瘤转移及对荷瘤小鼠免疫功能的测定,以探讨其抗肿瘤免疫效应的机制。为开发壳寡糖抗肿瘤新药的研制提供理论依据。
朱婉萍[2]2003年在《壳寡糖抗肿瘤免疫效应研究》文中研究说明背景和目的 壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是甲壳素的脱乙酰化产物。广泛存在于海洋生物蟹、虾等的甲壳及藻类植物中。在自然界中，甲壳质的生物合成量约为1×10~9～1×10~(11)t/d，是地球上第二有机资源，也是人类取之不尽的再生绿色资源。研究发现，壳聚糖具有一定免疫调节、抗肿瘤、抗感染等作用。由于壳聚糖分子量大，水溶性较低，因此很难通过胃肠道吸收而产生其疗效。所以改造壳聚糖的结构已成为该领域开发研究的一个热点。进一步实验证明，经降解制备的水溶性壳寡糖不仅分子量小，易溶于水，且有良好的组织相容性，并在提高机体免疫功能和抗肿瘤诸方面比改造前的壳聚糖发挥了更好效应。 本实验通过对不同批次的壳寡糖抑瘤作用的筛选，而后又对其进行了抗肿瘤转移及对荷瘤小鼠免疫功能的测定，以进一步探讨其抗肿瘤免疫效应的机制。为开发壳寡糖抗肿瘤新药的研制提供理论依据。 浙江大学硕士学位论文 材料与方法1．对S；s。肉瘤抑制作用：给ICR小鼠接种S；s。肉瘤侄 XIO＼ml）0．Zml／只，隔日静脉注射各批号壳寡糖共 4次，停药次日分离实体瘤，计算抑瘤率。实验同时设CTX阳性对照组和阴性对照组。 2．对Lewis肺癌抑制作用：C。7BL历种小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞悬液门‘ml）0．Zml／只，隔日尾静脉注射各批号壳寡糖共 6次，停药次日计算抑瘤率（％人对照组同上。 3．抗Lewis肺癌自发肺转移的作用：C。而L历小鼠肌肉注射Lewis肺癌细胞悬液门‘／ml）0．Zml／只，隔日尾静脉注射 V号壳寡糖共6次，停药次日取肺计算肺转移率和肺转移灶数。 4．抗B；。黑色素瘤血道肺转移的作用：C。在L历小鼠尾静脉注射B；。黑色素瘤乃 X 10’／ml）0．Zml／只，隔H日尾静脉注射V号壳寡糖一次，共6次，对照组同上，停药次巳 计算肺转移率及肺转移灶数。 5．T淋巴细胞增殖功能测定：将V号壳寡糖分为高、中、低叁个剂量组，分别给C。BL伍荷瘤小鼠用药，每间隔一日尾静脉注射一次共六次，CTX对照组间隔1日尾静脉注射，共3次，停药次日无菌取脾脏分离细胞，以刀豆蛋白 A（Con．A）诱导，采用’H1dR掺入法测定T淋巴细胞增殖功能。 6．NK细胞活性测定：给药方法同5，以YACl 为靶细胞，用’H－TdR法测 NK细胞活性。 7．IL上、IFN－Y含量测定：给药方法同5，取血分离血清，用ELISA双抗体夹心法测IL－2、IFN－Y含量。 2 浙江大学硕士学位论文 8．溶血素值测定：用比色法对荷瘤小鼠进行溶血素测定，结果用HC。。值表示。 9．吞噬功能的测定：给荷瘤小鼠分别注射不同剂量的V号壳寡糖（200mg／kg X 4d（l），100mwg X 4d（tv），300mwg X gd（ig）），隔日尾静脉注射一次共4次，对照组同上。停药次日，作腹腔吞噬细胞吞噬功能测定（吞噬百分率（％厂。 结果和讨论 1．壳寡糖对 S；s。肉瘤生长的影响：I号壳寡糖抑瘤率（0）在 l．71～14．760，作用不明显。11号壳寡糖的抑瘤率（％）在 2二 6～52刀7％，而抑瘤率在 52刀7％的 400m叭g剂量组，动物死亡率达60％，说明样品毒性太大。Ill号壳寡糖尾静脉给药，抑瘤率（o）在6．50o左右，腹腔给药抑瘤在9．64～14．75o，口服给药抑瘤率在 6＊5％。IV号壳寡糖 100m叭g、200mg／kg和 400mg／kg剂量组尾静脉给药，抑瘤率为3．30～12．80％，而提高壳寡糖剂量800mg／kg尾静脉注射，小鼠在实验第四大己全部死亡，说明该剂量毒性太大；V号壳寡糖 100mg／kg、200mg／kg的抑瘤率为 22厂％和 9．19％；V号壳寡糖300mgthg灌胃组，抑瘤率为3．90％，降低V号壳寡糖剂量 （150 100、50m吵g）以尾静脉给药其抑瘤率为 门．80％、23二0％。15刀0％。 L V号壳寡糖对 Lewis肺癌抑制作用：V号壳寡糖以 15 0、100、50mgthg尾静脉注射，对小鼠 Lewis肺癌的抑制率分别为10．73％、ZI．95％、16．74％，其结果与 S；s。实验相似。 3．V号壳寡糖抗Lewsi肺癌自发肺转移的作用：V号壳寡糖对 3 浙江大学硕士学位论文Lewis肺癌的肺转移抑制率（％）为20～30％；对肺转移灶数抑制率（O）为13．6～29．50。其中以100mg／kg剂量组抑制转移效果最佳。 4．V号壳寡糖抗B；。黑色素瘤血道肺转移的作用：V号壳寡糖对B；。黑色素瘤血道肺转移灶数的抑制率（0）为 11．73～25．0％，其中100mg／kg剂量组抑制作用最强，抑制转移灶数为 25％。 5．V号壳寡糖对T淋巴细胞增殖的影响：V号壳寡糖对荷瘤小鼠的T细胞增殖有明显的促进作用p＜0刀5～0刀1人 6．V号壳寡糖对 NK细胞活性的影响：V号壳寡糖以 100mg／kg静脉
罗福文[3]2009年在《壳寡糖经肠道吸收效率以及与肝癌细胞结合特点和抗肿瘤机制》文中认为背景:甲壳素是昆虫和甲壳类动物的外壳中所含的一种物质,是由乙酰氨基葡萄糖组成的聚糖。甲壳素经脱乙酰基处理得到壳聚糖,再经过进一步降解,形成壳寡糖。壳寡糖的化学名为聚氨基葡萄糖胺。据研究,壳寡糖是目前已知自然界中唯一带正电荷的碱性多糖,也是唯一的动物性膳食纤维素。由于壳寡糖分子量低,水溶性好,生物活性高,人体吸收好,从而克服了甲壳素不溶于水、不易被人体吸收的技术难题。所以壳寡糖成为当今国内外研究、开发的重点领域。研究表明,壳寡糖具有广泛的生物学活性:提高机体免疫力,抗菌抑菌作用,促进钙及其它矿物质的吸收,增殖双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌群,对降血糖、降血脂、降血压、保护肝功能等有辅助治疗作用。此外,壳寡糖具有明显的抗肿瘤作用,其对肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、白血病、肉瘤等都有显着抑制效果,然而壳寡糖抗肿瘤机制十分复杂,是多方面、多层次的过程。肝癌,是全球最为常见的恶性肿瘤之一。因其恶性度高、病情进展快、治疗难度大、生存期短,一般发病后生存时间仅为6个月,故肝癌有癌中之王之称。并且肝癌是富含血管的肿瘤,极易发生转移。目前,临床上的治疗一般以手术、放疗、化疗为叁大支柱,但由于肝癌起病隐匿,发展变化快,患者就诊时往往已进入中晚期,失去了最佳手术时机。大多数化疗药物虽可抑制肿瘤细胞过度增生,但毒副作用大,对正常组织细胞也有很强的杀伤作用。故寻找新的抗肝癌药物迫在眉睫。本实验组前期致力于壳寡糖吸收分布状况的研究,发现壳寡糖能被小肠吸收入血。为了揭示壳寡糖抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡的机制,本实验组通过使用荧光物质标记壳寡糖来研究其对肿瘤细胞的作用,进而探讨在肿瘤细胞表面是否存在与壳寡糖特异性结合的受体。再通过检测一些与细胞凋亡相关的蛋白以及与肿瘤转移相关的细胞因子进一步探寻壳寡糖抗肿瘤机制。目的:1、研究壳寡糖在体内的吸收状况以及吸收入血和直接排出的比例。2、通过FITC荧光标记壳寡糖来检测肝癌SMMC-7721细胞表面是否存在与壳寡糖结合的受体。3、检测壳寡糖对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制效果及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。4、研究壳寡糖能否促进人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡以及对凋亡调控蛋白Bcl-2和Caspase-3的影响。方法:1、利用异硫氰酸荧光素FITC标记壳寡糖,并通过聚丙烯酰胺凝胶层析柱(P2凝胶)将游离的FITC除去,再给禁食后的小鼠用FITC标记的壳寡糖灌胃,1小时后取血清和肠溶物,经处理后,通过荧光分光光度计分别检测血清样品和肠内溶物中荧光的强度,进而确定壳寡糖是否被吸收入血,以及入血和直接从肠道排出的比例。2、将FITC标记的壳寡糖单独作用于人肝癌SMMC-7721细胞,并与先用未标记的壳寡糖作用于肝癌细胞再用标记的壳寡糖作用细胞进行比较,观察壳寡糖与肝癌细胞结合是否有饱和现象进而探索肝癌SMMC-7721细胞表面是否存在与壳寡糖特异性结合的受体。3、利用MTT法检测不同浓度壳寡糖作用于人肝癌SMMC-7721细胞不同时间后细胞增殖活性;应用免疫细胞化学和Western-blotting检测壳寡糖作用肝癌细胞后VEGF表达量的变化。4、镜下观察不同浓度壳寡糖作用肝癌细胞后发生的形态学变化,并利用荧光Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡状况,通过免疫细胞化学方法研究壳寡糖对肝癌细胞SMMC-7721中Bcl-2和Caspase-3表达的影响。结果:1、FITC能够标记壳寡糖,并且利用P2聚丙烯酰胺凝胶层析柱可以很好的分离出游离的FITC;用标记的壳寡糖给小鼠灌胃,从血清和肠溶物中都检测到荧光强度,两者比值为2:1。2、单独使用标记的壳寡糖作用肝癌细胞在荧光显微镜下观察所有细胞均发出很强的荧光,而先用未标记的壳寡糖作用肝癌细胞再用标记的壳寡糖作用后荧光强度明显减弱。3、壳寡糖对SMMC-7721细胞增殖有明显的抑制作用,呈剂量依赖关系,并且壳寡糖能明显降低SMMC-7721细胞中VEGF的表达。4、壳寡糖能促进SMMC-7721细胞凋亡,并能上调促凋亡蛋白Caspase-3的表达和降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论:1、壳寡糖能通过小肠被人体吸收,吸收入血的壳寡糖与直接排出的壳寡糖的比例为2:1。2、壳寡糖能与肝癌细胞结合并呈现出饱和性,此现象说明在肝癌细胞表面有可能存在壳寡糖的特异性受体。3、壳寡糖对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,此作用可能是通过抑制VEGF的表达来实现的。4、壳寡糖能促进人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡,此作用可能是通过促进Caspase-3的表达和抑制Bcl-2的表达来实现的。
曹秀明[4]2010年在《壳寡糖及衍生物抗肿瘤作用、免疫调节作用及其机制的研究》文中提出占地球面积71%的海洋里生活着约40万种生物,占地球生物物种总数的80%。生长在海洋这一特殊环境(高盐、高压、缺氧、缺少阳光等)中的海洋生物,在其生长和代谢过程中,产生并积累了大量具有特殊化学结构并具有特殊生理活性和功能的物质,是开发新型海洋药物和功能食品的重要资源。壳寡糖是甲壳素脱乙酰制得壳聚糖,再经降解得到的低分子聚糖,氨基葡萄糖是壳聚糖的单体糖。它显示出良好的水溶性和多方面的生物活性,一直是近些年来研究的一个热点。本文通过体内体外实验对壳寡糖及其衍生物D-氨基葡萄糖盐酸盐(GlcNH2·HCl),N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)的抗肿瘤活性、免疫活性进行了研究。应用细胞形态学、流式细胞术、免疫化学及Western Blot方法和技术探讨了相关的作的机理。实验结果表明,D-氨基葡萄糖盐酸盐在125μg/ml-1000μg/ml浓度范围内可以抑制胃癌细胞SGC-7901细胞的生长,最大抑制率达到63.2±2.5%、壳寡糖对SGC-7901抑制作用不明显。在这个浓度范围内GlcNH2·HCl对人肝癌细胞HepG-2也有一定的抑制作用,最大抑制率为36.8±2.4%。NAG对SGC-7901和HepG-2细胞生长没有抑制作用。体内实验表明GlcNH2·HCl在125 mg/kg-500 mg/kg剂量范围内可以抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长并延长H22荷瘤小鼠的生存时间,并有一定的保护免疫器官的作用。壳寡糖在65 mg/kg-125 mg/kg剂量范围内可以抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长并延长H22荷瘤小鼠的生存时间,并有保护免疫器官的作用。在抗肿瘤机制研究的实验中观察到,GlcNH2·HCl处理后的SGC-7901细胞β-半乳糖苷酶表达增加,细胞发生衰老。荧光显微镜观察到D-氨基葡萄糖盐酸盐作用后的SGC-7901细胞形态,,部分染色质出现浓缩状态。可见凋亡小体形成,说明细胞发生了凋亡,流式细胞仪检测结果表明SGC-7901细胞周期被阻滞,G2/M细胞几乎为零。激光共聚焦显微镜观察到GlcNH2·HCl作用后,在不同时间观察SGC-7901细胞内钙离子浓度,发现各个实验组细胞内钙离子浓度明显高于对照组,趋势为24h<48h>72h,48h时,SGC-7901细胞内钙离子浓度达到最高。GlcNH2·HCl作用48h钙调神经磷酸酶的表达有升高,钙调神经磷酸酶的活性也有显着升高。而CyclinB1的表达量下降。流式细胞仪检测到细胞内活性氧(ROS)和细胞色素C浓度也明显高于对照组,线粒体膜电位下降,说明GlcNH2·HCl通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖,其机理为细胞内钙离子浓度升高,激活钙信号通路调控细胞周期的进程,使细胞周期阻滞于S期,损伤线粒体,降低线粒体膜电位,升高细胞内活性氧浓度,Caspase-3活性增加,诱导细胞凋亡。在壳寡糖及其衍生物免疫活性的研究中发现100μg/ml—50μg/ml浓度的壳寡糖能显着提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力(P<0.01)。对巨噬细胞产生NO、和TNF-a水平均有明显的促进作用。而GlcNH2·HCl和NAG在50μg/ml—200μg/ml浓度范围对巨噬细胞的吞噬能力和产生NO、和TNF-α与对照组相比没有显著差异。GlcNH2·HCl、NAG在浓度范围50μg/ml—200μg/ml内能够激活淋巴细胞,促进T淋巴细胞增殖,诱导T淋巴细胞进入S期。但COS对淋巴细胞增殖没有促进作用。GlcNH2.HCl、NAG作用体外分离的T淋巴细胞2h、4h、6h、24h后,淋巴细胞内的Ca2+浓度均显着高于对照组。其中加药6h后淋巴细胞内的Ca2+浓度最高。24小时后有所下降。GlcNH2.HCl、NAG作用于淋巴细胞72小时后,钙调蛋白表达,钙调神经磷酸酶表达增加,淋巴细胞分泌的IL-2也高于对照组。上述结果说明COS、GlcNH2·HCl和NAG对细胞免疫有不同的调节作用,壳寡糖对巨噬细胞具有调节作用,而GlcNH2·HCl和NAG能够通过激活T淋巴细胞Ca2+信号通路使之发生增殖增殖,并分泌信号物质IL-2。综上所述,COS和GlcNH2·HCl有明显的抗肿瘤作用和免疫调节作用,这种双重作用有利于肿瘤患者的治疗和康复。NAG对淋巴细胞的功能也有一定的调节作用,但没有抗肿瘤作用。本研究为进一步应用壳寡糖、D-氨基葡萄糖盐酸盐和N-乙酰氨基葡萄糖提供依据。
冯洁[5]2004年在《壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究》文中研究指明背景和目的 几丁质是由N-乙酰葡萄糖胺组成的多糖，它是世界上除纤维素之外含量最丰富的天然多聚物。壳聚糖是几丁质不完全脱乙酰的产物。几丁质和壳寡糖具有多种生物效应，包括抑瘤、抗菌和免疫增强等。但是它们的高粘度和在水溶液中的不溶性极大的限制了在体内的应用。于是低分子量、水溶性好、无毒且生物适应性好的壳寡糖逐渐得到了重视。 巨噬细胞(Macrophage)既是免疫细胞，又是辅佐免疫应答细胞，可通过吞噬、抗原呈递、分泌细胞因子、激活淋巴细胞和产生活性氧、NO等作用而行使抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节作用，是机体免疫系统的重要组成部分。整体动物实验表明壳寡糖能激活巨噬细胞，增强巨噬细胞的杀伤活性，诱导如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒单核集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-6(IL-6)等细胞因子的分泌，增加T细胞和NK细胞的活性。但壳寡糖在巨噬细胞表面的受体及壳寡糖对巨噬细胞免疫功能的调节机理报道甚少。 本实验通过体外研究荧光标记壳寡糖与小鼠巨噬细胞的结合情况，揭示巨噬细胞壳寡糖结合组分的糖结合特异性，为进一步阐明壳寡糖对巨噬细胞的免疫调节机理和分离巨噬细胞壳寡糖结合组分提供一定的实验依据，为壳寡糖抗肿瘤药物和功能食品的开发提供理论依据。 材料和方法 1．RAW264.7巨噬细胞的培养：RAW264.7巨噬细胞于RPMI 1640培养液(加上10％灭活的小牛血清，2mmol／L L-谷氨酰胺，100U／ml青霉素和100U／ml链霉素)中培养。2．2-氨基吖啶酮标记壳寡糖：取5ul 20mmol／L壳寡糖于0.5ml Eppendorf管，离心冷冻干燥，加10ul 100mmol／L 2-氨基吖啶酮，10 ul 1.0mol／L硼氢氰化钠，混匀，离心。置于45℃水浴反应5小时，取出，离心冷冻干燥。3．在激光扫描共聚焦显微镜下观察2-氨基吖啶酮标记壳寡糖与巨噬细胞的结合，用流式细胞仪分析荧光强度。 结果和讨论 1．2-氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞的结合情况：2-氨基吖啶浙江大学硕士学位论文酮标记的壳寡糖先与巨噬细胞膜有结合，然后分布于整个细胞质，最后进入细胞核，随时间的进展而呈现了一个内在化过程。2.2一氨基叮睫酮标记的壳寡糖与巨噬细胞的结合是一个依赖时间、温度和浓度的过程，Scatchard分析后发现它对巨噬细胞的作用是通过膜上特异性的受体(Kd为2.1 X 10一SM)进行的。3.不同的壳寡糖组成结构单位对巨噬细胞摄取壳寡糖产生不同的影响，说明壳寡糖的结构是受体识别的关键。4.竞争试验表明甘露糖能抑制壳寡糖的摄取，脂多糖、p-葡聚糖则不能，提示巨噬细胞壳寡糖结合组分可能为甘露糖受体。5.甘露糖一BSA、岩藻糖一BsA、N一乙酞葡萄糖胺一BsA都能抑制壳寡糖的摄取。结论1.壳寡糖可与巨噬细胞膜结合，并随时间的延长逐步进入巨噬细胞内。2.壳寡糖在巨噬细胞膜表面有特异性结合的受体(Kd为2.1 x 10一SM)，可能为一廿露糖受体。
官杰, 王琪, 许惠玉[6]2007年在《壳寡糖协同双歧杆菌诱导抗肿瘤免疫机制研究》文中提出目的通过建立H22肝癌荷瘤鼠作为实验动物模型,研究壳寡糖协同双歧杆菌对荷瘤鼠免疫功能的影响。方法采用体内注射的方法将壳寡糖和双歧杆菌注入荷瘤小鼠体内,观察肿瘤生长情况,对其进行免疫功能的测定。结果壳寡糖协同双歧杆菌对肿瘤的生长有抑制作用,可提高荷瘤小鼠血清的IL-2和INF-γ含量,增加荷瘤小鼠免疫器官脾脏和胸腺重量。结论壳寡糖协同双歧杆菌可抑制肿瘤生长,提高机体免疫功能。
余琦琦[7]2002年在《壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究》文中研究表明背景和目的 自1977年第一届国际几丁质、壳聚糖专题学术研讨会在美国召开以来，有关几丁质和壳聚糖的研究和开发在国内外得到了广泛的重视。但由于几丁质和壳聚糖溶解性能差，大大限制了它们的应用。所以，由几丁质／壳聚糖降解制备水溶性的几丁寡糖(Oligochitin)和壳寡糖(Oligochitosan)成为几丁质／壳聚糖产品的开发和研究的一个重要方向。国内外许多学者在这方面进行了多年的研究工作，并已使低聚产品产业化。 近年来，随着研究的深入，壳寡糖已被发现有许多独特的生理活性和功能。如：(1)分子量较小，易溶于水，有良好的组织相容性。(2)可提高巨噬细胞的吞噬功能，抑制肿瘤细胞的生长和转移。(3)在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、乳酸杆菌，调节肠道的微生物生态平衡。(4)在体外微酸环境中具有较强的抑菌抗菌作用，并有显着的保湿、吸湿能力。(5)可作为植物功能调节剂，刺激植物生长，增强植物对病虫害的防御能力等。壳寡糖具有多种功能已被人们所普遍认同，但其确切的作用机制却并不十分清楚。 巨噬细胞(Macrophage)既是免疫细胞，又是辅佐免疫应答细胞，可通过吞噬、抗原呈递、分泌细胞因子、激活淋巴细胞和产生活性氧、NO等作用而行使抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节作用，是机体免疫系统的重要组成部分。 浙江大学硕士学位论文 本实验观察荧光标记壳寡糖在体外与小鼠腹腔巨噬细胞的结合情况，了 解巨噬细胞壳寡糖结合组分的糖结合特异性，并初步探讨壳寡糖与巨噬细胞 结合后的信号传导途径。通过本实验为进一步阐明壳寡糖对巨噬细胞的免疫 调节机理和分离巨噬细胞壳寡糖结合组分提供一定的实验依据，为壳寡糖抗 肿瘤药物和功能食品的开发提供理论依据。这对于浙江省海洋资源的开发利 用具有重要的意义。以上实验内容在国内外的文献检索中未见类似研究报道。 材料和方法 INIH小鼠腹腔巨噬细胞的制备：由NIH小鼠的腹腔 冲洗液制备巨噬细胞。巨噬细胞浓度为 IXIO‘／ml。2 丹磺酚盼标记壳寡糖： 160 mg壳寡糖溶于 lml水，2 mll％新鲜配制的丹磺酚姘，lml3％叁氯乙 酸，将上述叁种物质混合，于真空离心机中干燥。3．丹磺酚肘标记的壳寡糖 与巨噬细胞的结合情况：实验组以3厂smLmolil丹磺酚姘标记的壳寡糖与巨噬 细胞共同培养1。二和24小时：以处理过的丹磺酚姘作为对照组。冲洗后于 荧光倒置显微镜下观察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。4．D（＋） －甘露糖、In。，ertase、日－葡聚糖对丹磺酚胁标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响 作用：实验组先用 D ＋）－甘露糖、Invertase或日－葡聚糖作用 20分钟，加 入375mmol；’l丹磺酚肘标记壳寡糖继续培养2 ’J＼时；对照组加入3厂smrnol／l 丹磺酚盼标记壳寡糖，继续培养2小时。冲洗后在荧光倒置显微镜下观察实 验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。5．2－氨基叮陡酮标记壳寡糖；取400 uls mmo川壳寡糖于 0．5 ml Eppendorf管，离心冷冻干燥，加 30ul 34 nunol／12－ 氨基叶陡酮，100ul刀 mol／l 硼氢氰化钠，混匀，离心，置于 45 ℃水浴反 应5小时，取出，离心冷冻干燥。6．2－氨基叮咳酮标记的壳寡糖与巨噬细胞 的结合情况：实验组以 0二55 mmol／12－氨基叶陡酮标记的壳寡糖与巨噬细胞 共同培养二分钟，5分钟，30分钟。另取处理过的2－氨基叮陡酮作为对照组。 冲洗后激光扫描共聚焦显微镜下观察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱的 差异。7。D（＋）．甘露糖对 2－氨基叮唆酮标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响 2 浙江大学硕士学位论文 作用：实验组先用 4mg／ml（＋）－甘露糖作用 20分钟，加入 0二55 mmol／12－ 氨基叮陡酮标记的壳寡糖继续培养30分钟；对照加入0．255。OI／12－氨基叮 陡酮标记的壳寡糖继续培养30分钟。冲洗后在激光扫描共聚焦显微镜下观 察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。结果采用t检验。8．不同浓度 的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响：巨噬细胞于 37oC、5％CO，’ 孵箱中培养24小时，冲洗后加入10 wtol／IFIOO－3／AM 100 ill，37℃避光孵 育40分钟。冲洗后后置于激光扫描共聚焦显微镜下，首先测定静息状态下的 巨噬细胞胞浆游离钙水平，之后立即加入 ling／ml或 10mg／ml壳寡糖，监测 不同浓度的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影
张瑜[8]2010年在《壳寡糖对人肝细胞和人肝癌细胞凋亡的影响》文中研究说明目的：比较壳寡糖对人肝细胞(Chang Liver)和人肝癌细胞(SMMC-7721)凋亡诱导作用的影响,并初步探讨其分子机制,以期为临床开发低毒副作用的抗肝癌新药提供实验依据。方法：MTT法检测不同浓度的壳寡糖作用不同时间后,肝细胞与肝癌细胞的增殖抑制率；Hoechst 33258荧光染色法观察壳寡糖作用后,肝细胞与肝癌细胞的形态变化；流式细胞仪检测壳寡糖作用后,对肝细胞与肝癌细胞凋亡率的影响；Western blotting检测壳寡糖作用后,肝细胞与肝癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2.Caspase-3表达的变化。结果：1)0.5-2.5 mg/ml的壳寡糖分别作用24 h、48 h后,肝癌细胞的增殖受到不同程度的抑制,并且存在剂量依赖效应,半数抑制浓度(50％concentration of inhibition,IC50)为2.5 mg/ml,而对肝细胞的增殖无明显抑制;3.0-4.0 mg/ml的壳寡糖分别作用24 h、48 h,对肝细胞和肝癌细胞的增殖均有抑制作用,但对肝癌细胞的抑制率明显大于肝细胞。2)2.5 mg/ml的壳寡糖作用24 h后,肝癌细胞发生明显的凋亡,肝细胞无显着变化。3)2.5 mg/ml的壳寡糖作用24 h后,肝癌细胞的凋亡率显着上升至76.04%,而肝细胞的凋亡率无明显变化。4)2.5 mg/ml的壳寡糖作用24 h后,肝癌细胞中Bcl-2的表达量明显减少,Caspase-3的表达量明显增加；而肝细胞中两种蛋白的表达量均无明显变化。结论：壳寡糖对人肝细胞(Chang Liver)和人肝癌细胞(SMMC-7721)的增殖抑制作用存在显着差异,低浓度的壳寡糖对肝癌细胞有明显的增殖抑制作用,而对肝细胞的增殖无明显抑制。壳寡糖对肝细胞和肝癌细胞的凋亡诱导作用存在明显差异,低浓度的壳寡糖对肝细胞无明显的促凋亡作用,但能够明显促进肝癌细胞的凋亡,并且与下调抑凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Caspase-3的表达有关。壳寡糖对肝细胞与肝癌细胞的凋亡诱导作用表现出了细胞选择性,这可能与细胞和壳寡糖相互作用的方式及结构有关。本文在壳寡糖对人肝细胞(Chang Liver)和人肝癌细胞(SMMC-7721)凋亡诱导作用上进行了比较,并初步探讨了其分子机制,为临床开发低毒高效的抗肝癌新药提供了实验依据与参考。
许翔, 李吕木, 张民扬[9]2015年在《壳寡糖的生物学功能及其在畜禽营养中的应用》文中研究指明壳寡糖是一种新型绿色饲料添加剂。研究表明,壳寡糖具有调节肠道微生态环境、提高机体免疫力的性能,而且还具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、改善动物生长等多种生理功能。此外,因其水溶性好,易被机体吸收,应用前景广阔。文章从抗氧化、抗肿瘤、免疫功能等方面对壳寡糖的生物学功能进行综述,并阐述了其在动物营养中的应用。
纪莹[10]2003年在《壳寡糖对经IFN-γ预刺激的巨噬细胞IL-1β、TNF-α基因表达的影响》文中研究指明甲壳质，又名几丁质，是自然界最丰富的生物资源之一，具有多种生理功能，广泛应用于各种行业中。但是，几丁质不溶于水限制了它的应用，往往需要对它进行一些化学修饰或部分降解以增加其溶解性。几丁质部分脱乙酰化产物是壳聚糖，它们的降解产物为几丁寡糖、壳寡糖，具有较好的水溶性，易于分散吸收。众多学者研究发现几丁质、壳聚糖及几丁寡糖、壳寡糖具有免疫调节作用。将这些多糖、寡糖经腹腔或静脉给予小鼠，可以使其腹腔渗出液及外周血中多型核白细胞增多，巨噬细胞、脾脏T淋巴细胞、NK细胞等活性增强。各种免疫功能细胞激活后，分泌各种免疫活性分子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子及干扰素等。通过这些分子介导免疫功能细胞互相调节，增强免疫细胞的活性，巨噬细胞释放过氧化氢、一氧化氮等活性物质，T细胞、NK细胞的细胞毒活性增高，整体免疫系统功能增强。几丁质及其衍生物通过调节机体免疫系统功能，能增强机体对多种病原微生物的抵抗作用，对实验性小鼠Meth A纤维肉瘤、S180肿瘤、MM44实体瘤及Lewis肺癌等肿瘤细胞的生长具有抑制作用。 研究表明壳寡糖具有免疫调节作用，有抗感染及抗肿瘤活性。但众多研究以动物整体实验为主，关于壳寡糖对免疫系统某一特定环节直接作用的研究较少。为了探索壳寡糖对免疫系统调节作用的机理，本课题以小鼠巨噬细胞作为研究对象，通过体外实验将壳寡糖作用于巨噬细胞，并在壳寡糖作用前加入IFN-γ对巨噬细胞进行预刺激，运用相对定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)技术，检测壳寡糖对巨噬细胞 浙江大学硕士学位论文 ILl、TNF—a基因转录水平和翻译水平的影响。 首先确定壳寡糖对巨噬细胞作用的最适时间和最适浓度：通过RT干CR 确定最适作用时间为 18h，同样的方法先确定壳寡糖作用浓度范围为 5～50 n g加＊在此范围内进一步实验发现 10～60 n g／ml的壳寡糖能增强巨噬细胞 IL－lP和 TNF－a基因转录，效应有剂量依赖性。选定 40 n g加l浓度的壳寡 糖继续作用于巨噬细胞， 然后确定IFN－Y预刺激的最适时间和最适浓度，实验组加入IFN－Y预 刺激后再加壳寡糖，对照组仅加壳寡糖，继续培养 18h，通过 RT干CR确定 IFN－Y最适预刺激时间为 4h，最适预刺激浓度为 100U／ml。此外，由于 IFN－Y 单独作用也可促进两种细胞因子基因表达，故在巨噬细胞中加入IFN－Y单独 作用 22h，再经阿一PCR检测，发现加 IFN－Y的实验组细胞的几一lp和 TNF－ a基因转录水平与空白对照组相比较无显着性差异，可见，壳寡糖和IFN－v 对巨噬细胞 IL－lp和 TNF一口基因转录水平的影响在作用时间上无一致性，在 壳寡糖作用最适时间时，仅受 IFN－Y刺激的巨噬细胞 IL－lp和 TNF－Q基因 转录己下降至刺激前水平，因此可以认为，IFN－Y的加入仅起到对巨噬细胞 预刺激使之处于敏感状态的作用，有利于增强壳寡糖对巨噬细胞的作用。 在确定了壳寡糖和IFN－Y的最适作用时间及最适作用浓度之后，选取叁 组细胞状态良好，数目比较一致的巨噬细胞，实验组中加入 100U／ml IFN－v 预刺激 4h后，再加入 40 u g／ml壳寡糖，加糖对照组则只加 40 n g砌l壳寡糖， 空白对照组两者都不加，继续培养18h。收集实验组和对照组上清培养液留 待ELISA实验用，巨噬细胞通过异硫氰酸脱一酚一氯仿一步法提取总RNA。 RT－PCR结果表明两种细胞因子基因转录水平明显提高，加糖对照组 IL一互 p和 TNF－a基因转录水平分别为空白对照组的 2．l倍和 1．9倍…＜0．of人 实验组 IL－lp和 TNF－a基因转录水平分别为空白对照组的 3．7倍和 4．3倍b ＜0．01）。 ELISA实验结果显示，两种细胞因子分泌也显着增多，加糖对照组IL－l p和 TNF－a分泌量分别为空白对照组的 2．4倍和 2倍b＜0．of人实验组几 刀 p和 TNF－a分泌量分别为空白对照组的 4．2倍和 2．9倍（p＜0．01）。 本实验表明，壳寡糖可以增强小鼠巨噬细胞IL－lp及TNF一口的基因表 ．3． 浙江大学硕士学位论文达，使两种细胞因子基因转录及翻译水平增高，且此促基因表达作用在巨噬细胞经IFN－Y预刺激后显着增强。
参考文献：
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