滨州市中心医院甲状腺乳腺外科山东滨州251700
摘要：目的：研究mTOR/P70S6K信号通路在乳腺癌组织中的表达，探讨其在乳腺癌发生、发展中的作用及临床意义。方法：采用免疫组织化学技术分别检测32例乳腺癌组织、癌旁组织以及22例正常乳腺组织中mTOR、P70S6K表达情况；并分析乳腺癌组织中mTOR及P70S6K的表达与相关临床参数的关系.结果：mTOR在乳腺癌组织、癌旁组织及非肿瘤乳腺组织中的阳性表达率分别为59.4％、28.1％及15.6%；P70S6K表达率分别为56.3％、31.3％及27.3%，乳腺癌组分别与癌旁组及正常人乳腺组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；mTOR与P70S6K在乳腺癌组织中的表达关系呈正相关；mTOR及P70S6K在乳腺癌组织中的表达与TNM病理分期、淋巴结转移等关系密切，而与肿瘤大小、年龄及ER状态等无明显关系。结论：mTOR/P70S6K信号蛋白分子在乳腺癌组织中过量表达，提示此信号通路可能在乳腺癌发生、发展过程中发挥重要作用；多项临床病理因素分析显示mTOR及P70S6K的表达与淋巴结转移、TNM病理分期有关。
关键词：乳腺癌；mTOR；P70S6K；免疫组化技术；
ExpressionandclinicalsignificanceofmTOR/P70S6Ksignalingpathwayinbreastcarcinoma.
WenXianDing，HaiZhouShi.
Binzhoucentralhospital，Binzhoucity，ShanDongprovince，China；
AbstractAim：ToinvestigatetheexpressionofmTOR/P70S6Ksignalingpathwayinhumanbreastcarcinoma.Methods：ImmunohistochemicalmethodwereemployedtodeterminetheexpressionofmTOR/P70S6Ksignalingpathwayincancerousandparacanceroustissuessof32casesandnormalhealthytissuesof22cases.TherelationshipbetweenexpressionofthemTOR/P70S6Kproteininbreastcarcinomtissuesandrelatedparameterswasanalyzed.Results：TheexpressionlevelofmTOR/P70S6Ksignalingpathwaywasmarkedlyhigherinthebreastcarcinomatissuesthanintheparacanceroustissuesornormalbreasttissues.TherewasapositivecorrelationbetweenmTORproteinandP70S6Kproteinexpressioninbreastcarcinomtissues.TheexpressionofmTORandP70S6KinthebreastcarcinomtissueswassignificantlycorrelatedwiththeTNMstagingandlymphnodemetastasis，butnotwithtumorsiz，ageandtheexpressionofER.Conclution：ThemTOR/P70S6Ksignalingpathwayisspecificallyactivatedinbreastcarcinomtissues.ThemTOR/P70S6Ksignalingpathwaymightplayanimportantroleinthepathogenesisofbreastcarcinoma.
KeyWords：Breastcarcinoma；mTOR；P70S6K；Immunohistochemicalmethod
乳腺癌是当前我国严重危害妇女健康的最常见的恶性肿瘤，据统计，我国每年新增乳腺癌患者超过20万人，每年因乳腺癌死亡的人数超过4万人，已成为我国女性位居第一位的恶性肿瘤[1]。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是最近被科研工作者重视的一种重要的信号转导蛋白，在细胞内参与基因转录，核糖体合成，蛋白质翻译等重要的生物学行为[2]。P70S6K（P70S6激酶）是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，进而影响mRNA的翻译[3-5]。多项研究证实，mTOR/P70S6K信号通路在调控细胞生长与增殖方面发挥重要作用，多种恶性肿瘤的发生发展都与mTOR/P70S6K信号转导通路的异常表达有关。本研究运用分子生物学方法初步探讨MTOR/P70S6K信号通路在乳腺癌组织中的表达情况及临床意义。
材料与方法
1.1标本及一般资料：收集滨州市中心医院2011年7月至2013年10月经病理证实并行乳腺癌根治性手术治疗的乳腺小叶癌或乳腺导管癌32例患者（所有患者均为第一次接受手术治，且均未行放、化疗）的乳腺癌癌组织、及对应的癌旁组织（距肿瘤边缘5cm以上），同时收集22例经手术切除的正常乳腺组织（即非乳腺癌乳腺组织）。术中收集的组织先冰冻送快速病理检查确定良、恶性，后用10%福尔马林溶液编号分组保存。纳入研究范围的32例乳腺癌患者平均年龄47.5岁（38～67）；肿瘤大小上，≤2cm的12例，＞2cm的20例；是否伴有淋巴结转移上，伴有的20例，不伴有的12例；3期的为15例，2期及其以下的患者17例。
1.2免疫组织化学S-P方法：试验所用免疫组化用检测试剂盒购自美国SantaCruz公司，DAB显色试剂盒购自上海碧云天公司，其他试剂及设备来自我院病理科。先苏木精-伊红常规组织染色，后行免疫组化（S-P）法检测，将常规石蜡标本连续组织切片，先后经过脱蜡，组织抗原修复，孵育，再按照S-P免疫组化试剂盒所示步骤加入一抗、二抗，经DAB显色，苏木素复染，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，然后在显微镜下进行观察颜色变化，mTOR及70S6K阳性染色标准以细胞浆内出现棕黄色颗粒判断为阳性。
1.3、统计学分析：结果统计学分析方法，采用SPSS19.0统计学软件进行处理，计数资料运用X2检验及相关性分析。均设α=O．05为检验水准，P＜0．05为差异有统计学意义。
结果
2.1p-mTOR蛋白在乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织中的阳性表达情况：标本行免疫组织化学方法染色，p-mTOR主要在细胞质内表达，呈棕褐色（图1，图2）。乳腺癌组织、癌旁组织、正常乳腺组织中的阳性表达率分别为59.4%（19/32）、28.1%（9/32）、2.7%（5/22）。结果表明：p-mTOR蛋白在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织及正常乳腺组织，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表-1。
图2：乳腺癌患者癌旁组织中p-mTOR阳性表达（左图所示）及p-mTOR的阴性表达（x400）
2.2p-P70S6K在乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织中的阳性表达率：p-P70S6K也主要在细胞质内表达，呈棕褐色（图3，图4），p-P70S6K在乳腺癌癌组织中阳性表达率为56.3%（18/32），癌旁组织中的阳性表达率为31.3%（10/32），正常乳腺组织中阳性表达率为27.3%（6/22）。结果显示：p-P70S6K蛋白在乳腺癌癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常乳腺组织，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表-2。
2.4mTOR、P70S6K在乳腺癌组织中的表达与临床病理因素的关系：不同因素（如有无淋巴结转移、TNM病理分期、年龄、肿瘤直径及ER状态）的乳腺癌患者p-mTOR及p-P70S6K的表达情况如表-4所示。分析显示，mTOR在伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中的表达为75.0%（15/20），而在不伴有淋巴结转移乳腺癌癌组织中mTOR的表达为33.3%（4/12），两组间相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；P70S6K在伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中的相对表达为70%（14/20），而在不伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中P70S6K的表达为33.3%（4/12），两者比较，差异亦有统计学意义（P＜0.05）。此外，mTOR﹑P70S6K在乳腺癌组织中的表达与TNM分期明显相关（P＜0.05），与患者的年龄、肿瘤直径及ER状态无显著性关系，差异无统计学意义（P＞0.05）。
注1：mTOR在乳腺癌癌组织的表达上，有、无淋巴结转移两者之间比较，X2=5.40，P＜0.05；TNM分期比较，X2=4.67，P＜0.05；肿瘤大小比较，X2=0.726，P＞0.05；年龄比较，X2=0.045，P＞0.05；ER表达比较，X2=0.278，P＞0.05。
注2：P70S6KmRNA在乳腺癌癌组织的表达上，有、无淋巴结转移两者之间比较，X2=6.558，P＜0.05；TNM分期比较，X2=4.750，P＜0.05；肿瘤大小比较，X2=0.165，P＞0.05；年龄比较，X2=0.169，P＞0.05；ER表达比较，X2=2.814，P＞0.05。
讨论
研究证明，恶性肿瘤的发生、发展与细胞信号传导异常关系密切，信号通路蛋白发生异常，导致肿瘤细胞合成大量的促生长因子，最终导致细胞增殖失控。因此，以这些信号通路为靶向的治疗途径已被人们高度重视，mTOR/P70S6K信号通路就是这些信号通路其中之一，近来被人们广泛关注，成为抗癌研究的热点之一。
mTOR/P70S6K信号传导通路接受胰岛素受体、生长因子受体或PTEN基因等刺激因子而激活，继而影响细胞周期循环、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管形成和肿瘤侵袭转移目前已经得到证实[6，7]，mTOR/P70S6K信号通路在多种癌组织中存在失控，如哺乳动物肝癌﹑原发性胆囊癌、胃癌、大肠癌等组织[8-11]。但在乳腺癌组织中的表达情况，目前研究尚少。我们运用分子生物学手段检测乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织中mTOR和P70S6K的表达差异，初步探讨mTOR、P70S6K两者之间的相关性及其与乳腺癌常见临床病理因素之间的关系，以期揭示mTOR/P70S6K信号传导通路在乳腺癌发生、发展中的作用机制。
在本项研究中，我们运用免疫组织化学方法检测了32例乳腺癌组织、癌旁组织及22例正常乳腺组织中mTOR在蛋白水平的表达，结果显示：32例乳腺癌组织中mTOR的阳性表达率为59.4%，显著高于mTOR在癌旁组织及正常乳腺组织中的阳性表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这与其他研究者得出的mTOR在其它恶性肿瘤中呈高表达的结论一致。如Wang等人[12]对肝内胆管癌、徐大志等人[13]对胃癌、Chen等[14]对乳房佩吉特病的研究，均发现肿瘤组织中mTOR的表达均较正常组织高。但是他们并没有检测P70S6K的表达情况。我们的实验同时又检测了p-P70S6K在乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织中表达情况。得出P70S6K在乳腺癌癌组织中阳性表达率为56.3%（18/32），癌旁组织中为31.3%（10/32），正常乳腺组织中为27.3%（6/22），差异亦具有统计学意义（P＜0.05）。这样我们就在2个不同水平得出一致结果，即在乳腺癌癌组织中mTOR、P70S6K的表达水平明显均高于癌旁组织及正常乳腺组织，且mTOR的表达水平越高，mTOR下游的靶点P70S6K的表达水平亦越高，呈正性相关，提示mTOR/P70S6K信号通路在乳腺癌组织中存在着过激活。我们同时发现，mTOR/P70S6K信号通路在乳腺癌组织中的表达与肿瘤病理分期及有无淋巴结转移密切相关，如mTOR在伴有淋巴结转移的乳腺癌癌组织中的表达为75.0%（15/20），而在不伴有淋巴结转移乳腺癌癌组织中mTOR的表达为33.3%（4/12），两组间相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；P70S6K在伴有淋巴结转移的乳腺癌患者癌组织中的相对表达为70%（14/20），而在不伴有淋巴结转移的表达为33.3%（4/12），两者比较，差异亦有统计学意义（P＜0.05）。此外，mTOR﹑P70S6K在乳腺癌癌组织中的表达与TNM分期明显相关（P＜0.05），而与患者的年龄、肿瘤直径及ER状态无显著性关系，差异无统计学意义（P＞0.05）。Bakarakos等人[15]对乳腺癌、Wang等人[16]对结肠直肠癌中p-mTOR的研究发现，得出p-mTOR的表达与淋巴结转移有关，其得出的结论和我们基本一致。
本研究从临床实际出发，应用分子生物学手段检测mTOR﹑P70S6K在乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织中的表达差异，并分析其与常见临床病理特征之间的关系，为更进一步认识乳腺癌发生分子机制提供理论支持，为乳腺癌癌的早期诊断、临床干预提供新的分子标记物，但是其准确的作用机制尚需大量动物实验及临床研究进一步证实。
参考文献：
[1]YangL，LiLD，ChenYd，etal.Timetrends，estimatesandProjeetsforbreastcancerIncidenceandmortalityinChina.ZhongHuaZhongLiuZaZhi，2006，28（6）：438-40.
[2]PolakP，HallMN．mTORandthecontrolofwholebodymetabolism[J].CurrOpinCellBiol，2009，21（2）：209-218.PMID：19261457.
[3]PolakP，HallMN．mTORandthecontrolofwholebodymetabolism[J].CurrOpinCellBiol，2009，21（2）：209-218.
[4]InokiK，KimJ，GuanKL.etal.AMPKandmTORincellularenergyhomeostasisanddrugtargets[J].AnnuRevPharmacolToxicol，2012，52：381-400.
[5]PeponiE，DrakosE，ReyesG，etal.Activationofmammaliantargetofrapamycinsignalingpromotescellcycleprogressionandprotectscellsfromapoptosisinmantlecelllymphoma.AmJPathol2006；169：2171-2180.
[6]PeneF，ClaessensYE，MullerO，etal.Roleofthephosphatidylinositol3-kinase/AktandmTOR/P70S6-kinasepathwaysintheproliferationandapoptosisinmultiplemyeloma.Oncogene2002；21：6587-6597.PMID：12242656.
[7]KimEK，KimHA，KohJS，etal.PhosphorylatedS6K1isapossiblemarkerforendocrinetherapyresistanceinhormonereceptor-positivebreastcancer.BreastCancerResTreat.2011；126：93–99.PMID：21184268
[8]彭贵主，吴波，单人锋等.mTOR/P70S6K信号通路在肝细胞肝癌中的表达及临床意义[J].世界华人消化杂志，2008，16（29）：3279-3282.
[9]肖若冰，肖雅莉，陈云锋等.原发性胆囊癌组织中mTOR/p70S6K信号通路的表达及其临床病理学意义[J].江西医药，2009，44（3）：214-216.
[10]辛利，王庆才.mTOR与胃癌[J]国际肿瘤学杂志，2012，V39（09）：690-693
[11]马慧，刘延庆.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路与大肠癌[J]国际肿瘤学杂志，2012，V39（1）：57-60
[12]WangZ，ZhengT，WuQ，etal.ImmunohistochemicalanalysisofthemTORpathwayinintrahepaticcholangiocarcinoma.Neoplasma.2012；59（2）：137-41.
[13]徐大志，侯景辉，詹友庆等.胃癌组织中p-mTOR表达与患者预后的关系[J/CD].中华普通外科学文献：电子版，2009，3（6）：495-498.
[14]ChenS，NakaharaT，UchiH，etal.ImmunohistochemicalanalysisofthemammaliantargetofrapamycinsignallingpathwayinextramammaryPaget'sdisease.BrJDermatol.2009，161（2）：357-363.
[15]BakarakosP，TheohariI，NomikosAetal.ImmunohistochemicalstudyofPTENandphosphorylatedmTORproteinsinfamilialandsporadicinvasivebreastcarcinomas.Histopathology.2010Jun；56（7）：876-82.
[16]WangD，ChenJ，GuoF，etal.ClinicalsignificanceofmTORandp-mTORproteinexpressioninhumancolorectalcarcinomas.AsianPacJCancerPrev.2011；12（10）：2581-2584.