电压门控钙通道亚基Cacnb3调控小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的研究

论文摘要

目的:间充质干细胞具有高度的自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节功能。这些优势使它们成为极具吸引力的研究和临床应用工具。间充质干细胞在治疗骨相关疾病中具有非常重要的意义,此外,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在多种因子和细胞内信号的转录调控下,可分化为多种细胞类型,包括脂肪细胞和成骨细胞。但其在成骨分化中的具体机制还不完全清楚。钙离子电压门控?3亚基（Calcium Voltage-Gated Channel Auxiliary Subunit Beta 3,Cacnb3）作为电压门控通道的一个亚基,与钙离子调控相关,骨骼的形成离不开钙离子的参与。Cacnb3对间充质干细胞的成骨分化研究尚未见报道,因此探讨Cacnb3在间充质干细胞成骨分化中的作用具有重要意义,本研究主要关注了Cacnb3如何影响细胞的成骨分化及其作用机制。方法:（1）从GEO数据库中下载去乙酰化酶抑制剂（HDACi）处理小鼠前体成骨细胞（MC3T3-E1 preosteoblasts）的生物芯片,利用生物信息技术分析该生物芯片,与成骨基因数据集做合集分析,筛选成骨相关基因。（2）通过胶原酶消化法从小鼠脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物。（3）体外培养小鼠脂肪间充质干细胞ADSCs,成骨诱导培养基为实验组,正常培养基为对照组。培养到第14和21天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及茜素红染色,以检测小鼠ADSCs是否具有多向分化潜能和间充质干细胞所具有的干性特征。（4）对小鼠脂肪间充质干细胞ADSCs进行成骨诱导并进行定量分析,检测成骨相关基因和筛选基因的表达。在小鼠成骨前体细胞（MC3T3-E1 preosteoblasts）和人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）进行相同的实验验证基因表达的一致性。并在小鼠成骨前体细胞中成骨诱导14天进行相同的碱性磷酸酶和茜素红染色分析,以验证成骨诱导是否成功。（5）利用siRNA敲低Cacnb3在MC3T3-E1中的表达,检测敲低Cacnb3后对成骨相关基因表达的影响。同时,利用钙离子荧光探针Fluo-4 AM检测敲低Cacnb3对细胞内钙离子浓度水平的影响。结果:（1）利用生物信息技术分析表达谱数据筛选出22个基因,这些基因在成骨分化中表达上调,在脂肪分化中表达下调,且受去乙酰化酶抑制剂的严格调控。通过功能分析,发现有6个基因（Cacnb3、Lpcat2等）与钙离子调控相关。（2）利用酶消化法成功培养出小鼠脂肪间充质干细胞,传代稳定,增殖能力强,利用流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达（CD45、CD44、CD29、Sca-1）,表明我们所分离培养的小鼠脂肪间充质纯度较高,可用于后续实验。（3）小鼠ADSCs成骨诱导14天和21天后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色可看出我们所分离的小鼠ADSCs具有成骨分化潜能和干细胞特有的干性。（4）小鼠ADSCs经成骨诱导后成骨相关基因（Runx2、Alp、Col1a1、Opn）和筛选出来的基因Cacnb3和Lpcat2的表达量在实验组中明显高于对照组（P<0.05）,进一步验证,发现在MC3T3-E1细胞系和人的骨髓间充质干细胞成骨诱导中具有相似的结果。（5）与siRNA-NC组细胞相比,siCacnb3细胞中Cacnb3基因的mRNA表达下调,且mRNA表达水平在敲低效率70%（P<0.001）,成骨相关基因（ALP、Runx2）在沉默第5天后siCacnb3组较siRNA-NC组mRNA表达均下降。此外,敲低Cacnb3后钙离子浓度明显低于siRNA-NC组。结论:Cacnb3在细胞的成骨分化过程中表达上调,表明Cacnb3基因在细胞的成骨分化中可能具有促进作用,敲低Cacnb3会影响细胞内钙离子水平,表明Cacnb3可能是通过钙离子通路调控细胞的成骨分化,本研究为进一步探索间充质干细胞的成骨分化机制奠定了基础。

论文目录

中文摘要

Abstract

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、生物信息分析筛选成骨相关基因

1.1 对象和方法

1.1.1 生物芯片

1.1.2 实验方法

1.2 结果

1.2.1 分析芯片数据筛选成骨相关基因

1.3 讨论

1.4 小结

二、小鼠脂肪间充质干细胞培养及成骨分化诱导

2.1 材料和方法

2.1.1 实验动物

2.1.2 仪器设备

2.1.3 实验试剂

2.1.4 试剂配制

2.1.5 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1 流式细胞术检测小鼠ADSCs细胞纯度

2.2.2 小鼠ADSCs细胞的多潜能分化的鉴定结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、Cacnb3 等钙离子通道蛋白在成骨诱导中的表达

3.1 材料和方法

3.1.1 细胞株

3.1.2 仪器设备

3.1.3 实验试剂

3.1.4 实验方法

3.2 结果

3.2.1 Cacnb3 基因在细胞成骨诱导过程中表达升高

3.3 讨论

3.4 小结

四、敲降Cacnb3 对细胞成骨的影响

4.1 材料和方法

4.1.1 细胞株

4.1.2 实验试剂

4.1.3 实验方法

4.2 结果

4.2.1 敲低Cacnb3 基因抑制了MC3T3-E1 细胞的成骨分化

4.3 讨论

4.4 小结

五、成骨不全小鼠中Cancb3 表达的表达变化

5.1 材料和方法

5.1.1 实验动物

5.1.2 实验试剂

5.1.3 实验方法

5.2 结果

5.2.1 基因型鉴定

5.2.2 成骨不全小鼠成骨表达降低

5.3 讨论

5.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述新型钙通道TRP家族参与骨内稳态的机制研究

综述参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 伏玺

导师: 王峰

关键词: 脂肪组织,间充质干细胞,钙离子,细胞分化,生物芯片

来源: 天津医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 天津医科大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27366/d.cnki.gtyku.2019.000275

总页数: 88

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电压门控钙通道亚基Cacnb3调控小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的研究

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