核盘菌线粒体蛋白SsMIT1的功能研究

核盘菌线粒体蛋白SsMIT1的功能研究

论文摘要

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是常见的死体营养型植物病原菌,其寄主范围十分广泛,可以侵染400多种植物包括多种重要作物,引起作物菌核病,并造成严重的产量损失和品质下降。核盘菌寄生于油菜引起的菌核病,它会对油菜生产造成极大的危害,常常导致极大的经济损失。核盘菌的菌核可抵御不利的生存环境,在菌核病的病害循环中起重要作用。筛选核盘菌菌核形成过程中基因的差异表达,并研究其在菌核形成过程中的功能,有助于探索控制核盘菌菌核形成的防治措施,对生产实践中防治菌核病具有重要意义。本研究克隆出核盘菌线粒体载体蛋白编码基因序列SsMit1,根据同源重组的原理,并使用分割标记法对目标基因进行基因敲除,利用PEG介导原生质体转化技术获得SsMit1敲除突变菌株。通过不断挑取菌丝尖端的方法纯化出纯和的敲除突变体。对SsMit1在核盘菌生长、发育及致病过程中的作用进行了研究,主要结果如下:(1)与野生型相比,SsMit1缺失突变体菌丝生长速率有差异,菌丝尖端分支多且长度变短,产酸能力没有明显改变,菌核发育存在差异,突变体仍然可以形成菌核但形成时间推迟,菌核干重和菌核数量不存在显著差异。(2)与野生菌株相比,SsMit1缺失突变体接种在油菜和大豆离体叶片上,病斑直径明显较小,推测SsMit1与核盘菌的致病力相关。(3)在刚果红(Congo Red)、SDS、山梨醇和NaCl、KC1等胁迫因子作用下,与野生型菌株相比,突变体在含有刚果红(Congo Red)、SDS、山梨醇、NaCl、KC1的培养基上生长明显受到抑制,且在这5种胁迫下突变体均不能完成菌核的发育。综上所述,SsMit1参与了核盘菌的菌核发育和致病过程,该结果为核盘菌的防治提供理论基础,其具体的分子机制需要进一步研究。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 文献综述
  •   1.1 核盘菌与菌核病
  •     1.1.1 核盘菌及其病害简介
  •     1.1.2 菌核病的防治
  •     1.1.3 核盘菌的致病因子
  •     1.1.4 油菜菌核病的生活史及病害循环
  •   2.1 线粒体载体蛋白
  •   3.1 基因功能的研究策略
  • 2 引言
  • 3 材料与方法
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 供试菌株
  •     3.1.2 培养基
  •     3.1.3 载体
  •     3.1.4 试验试剂
  •     3.1.5 试验仪器
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 基因CDS的克隆
  •     3.2.2 基因相对表达量的测定
  •   3.3 基因敲除
  •     3.3.1 基因敲除策略
  •     3.3.2 基因组DNA的提取
  •     3.3.3 转化用片段的扩增
  •     3.3.4 原生质体的制备
  •     3.3.5 PEG介导的原生质体转化
  •     3.3.6 敲除转化子的纯化
  •   3.4 敲除突变体基因功能初步研究
  •     3.4.1 菌丝生长速率的测定
  •     3.4.2 转化子菌丝尖端形态
  •     3.4.3 转化子产酸能力
  •     3.4.4 转化子菌核形成过程及菌核分布形态
  •     3.4.5 转化子致病力测定
  •   3.5 SsMitl敲除突变体对5种胁迫因子敏感性测定
  • 4 结果与分析
  •   4.1 核盘菌SsMit1的克隆与分析
  •   4.2 核盘菌SsMit1的表达模式
  •   4.3 基因敲除转化子的获得与验证
  •     4.3.1 敲除片段的获得与转化
  •   4.4 基因敲除转化子的PCR验证
  •   4.5 敲除突变体基因功能的初步研究结果
  •     4.5.1 SsMit1敲除突变体的菌丝生长速度
  •     4.5.2 SsMit1敲除突变体菌丝尖端形态的观察
  •     4.5.3 转化子产酸能力的测定
  •     4.5.4 转化子菌核形成过程及菌核分布形态情况
  •     4.5.5 转化子致病力测定
  •   4.6 敲除突变体在5种胁迫子作用下敏感性测定
  •     4.6.1 基因敲除对核盘菌高盐逆境下耐力测定
  •     4.6.2 基因敲除对核盘菌细胞壁完整性的影响
  •     4.6.3 基因敲除对核盘菌细胞膜完整性的影响
  •     4.6.4 基因敲除对核盘菌高渗逆境下耐力测定
  • 5 小结与讨论
  •   5.1 讨论
  •   5.2 结论
  • 参考文献
  • 附录A 常用缓冲溶液和培养基
  • 附录B 仪器设备
  • 附录C 核盘菌总RNA的提取
  • 附录D cDNA的合成
  • 附录E 荧光定量PCR所加试剂及操作步骤
  • 附录F 胶回收试剂盒
  • 附录G 核盘菌DNA的提取步骤
  • 作者简介
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 贾春妍

    导师: 潘月敏

    关键词: 核盘菌,基因敲除,菌核形成,致病性

    来源: 安徽农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

    单位: 安徽农业大学

    分类号: S432.4

    DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000351

    总页数: 49

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