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猪伪狂犬病病毒的分离鉴定和比较基因组学分析

2020-12-02阅读(667)

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定和比较基因组学分析

论文摘要

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）引起的一种传染病,又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s Disease,AD）,引起猪出现高热、腹泻、沉郁厌食、精神、神经紊乱等临床症状,传染性强,给畜牧业带来巨大的经济损失。借鉴部分欧美国家成功净化伪狂犬病的经验,我国引入了Bartha-K61疫苗并广泛运用于临床,有效地控制了猪伪狂犬病。但自2011年底始,许多免疫过疫苗的规模化猪场爆发伪狂犬病,gE抗体由阴转阳,出现由伪狂犬病毒引起所谓的“流产风暴”,对我国养猪业造成严重影响。多数学者认为该次伪狂犬病的全国性暴发可能与病毒毒力变强、基因变异等因素有关,究其原因尚没有确定。本实验从四川和福建疑似PRV感染的病料中成功分离4株伪狂犬病毒,分别命名为FJ01、FJ03、MS2018和YK株,滴度分别为10-6.63、10-7.08、10-8.1和10-7.18TCID50s/0.1mL。Balb/c小鼠毒力实验结果显示,LD50分别为102.17、102.72、103.51和103.44TCID50s,FJ01毒力最强;除YK株外,其他三株病毒均使小鼠产生严重瘙痒症状。疫苗血清中和实验结果显示,YK毒株中和效价为1:512,显著高于FJ01、FJ03和MS2018毒株,中和效价分别为1:64,1:16,1:32。对4个PRV毒株的主要免疫原性基因和毒力相关基因gB、gC、gE和TK进行扩增和测序,分析其核苷酸与氨基酸同源性并建立进化树,结果显示,无论在核苷酸还是氨基酸水平,FJ01、FJ03和MS2018三个毒株的gB、gC、gE和TK基因与2011年后分离的变异株（TJ、HNX株等）同源性更高,与Fa株比对核苷酸同源性达到96.9%-100%,氨基酸同源性达到98.9%-100%,在进化关系上虽然同属于中国毒株在内的大分支,但与Fa属于不同的进化亚枝,这也在基因水平上说明变异毒株的抗原可能发生了变化;YK毒株gB、gC、gE和TK基因与Bartha株比对核苷酸同源性在98.6%-99.7%,氨基酸同源性在97.8%-99.7%,YK在进化关系上与国外毒株在同一大分支上,与Kaplan亲缘性最近。根据分离毒株的抗原基因进化关系和毒力强弱,我们挑选毒力最强的FJ01株和主要毒力基因进化关系与国外毒株更接近的YK毒株进行PacBio三代测序,测得全长分别为145465bp和142576bp,GC含量为73.53%和73.64%,均编码70个基因,与以前测得PRV基因组结构相同,由独特长区（UL）、独特短区（US）、内部重复序列（IRs）和末端重复序列（TRs）组成。将FJ01和YK株分别与参考序列进行全基因组比对和编码基因同源性分析发现:FJ01全基因组的核苷酸序列与2011年后分离的变异株同源性为96.36%-98.06%,与2011年前分离的毒株同源性为96.36%-96.86%;YK株与Kaplan株同源性最高,可达97.72%,而与其他毒株均低于95%,两个毒株的差异均主要在非编码基因区域。YK株与Kaplan大部分基因同源性为100%,但在UL36、UL47和US1中有数十个氨基酸的连续缺失和插入。全基因组进化分析显示:FJ01株进化关系更靠近HNX和HNB的亚分支;YK株与Kaplan位于同一个分支,可见YK毒株在全基因组进化水平上更接近国外毒株,间接证明毒株抗原不同于国内毒株,这也与前面疫苗血清中和抗体实验结果相一致。利用RDP4软件对FJ01和YK毒株全基因组进行重组分析,均发现重组信号:FJ01在121004bp到135532bp之间发生了重组,该区域亲本株为HLJ8和TJ株,6种重组分析算法支持该结果;YK在66201bp到66735bp之间与Kaplan株具有相同的亲本株-Becker,与新变异株HNX株发生了重组,有5种算法支持该结果。此外,分析免疫原性基因、毒力相关基因和同源性差异较大的基因重组情况,发现YK在UL36与UL47区分别和Becker与Ea发生重组。基因重组的现象对研究PRV进化变异有重要意义。综上所述,本实验分离了4株PRV毒株,测定了其对小鼠毒力;测定了其中2株的全基因组序列,并分析了基因组特性,发现了分离株具有基因重组情况的发生,为猪伪狂犬病毒的进一步研究提供了参考。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩写对照表（Abbreviation）
  • 第一章 文献综述
  •   1 研究背景
  •     1.1 伪狂犬病毒的发现
  •     1.2 伪狂犬病毒的分子生物学
  •       1.2.1 伪狂犬病毒的形态结构和基因组特征
  •       1.2.2 伪狂犬病毒的蛋白及功能
  •     1.3 伪狂犬病的危害和流行情况
  •       1.3.1 临床特点和危害
  •       1.3.2 国外流行情况
  •       1.3.3 国内流行情况
  •     1.4 伪狂犬病的防控
  •       1.4.1 疫苗研究
  •       1.4.2 防控措施
  •     1.5 PRV全基因组测序的研究进展
  •   2 研究目的与意义
  • 第二章 PRV的分离鉴定及分子特征分析
  •   1 材料
  •     1.1 病料
  •     1.2 主要试剂与病毒株
  •     1.3 主要仪器与设备
  •     1.4 实验动物
  •   2 方法
  •     2.1 病料组织样品的收集处理
  •     2.2 病毒分离与纯化
  •     2.3 病毒DNA的提取
  •     2.4 PRV分子特征测定方法
  •       2.4.1 引物与反应条件
  •       2.4.2 扩增片段的回收
  •       2.4.3 回收片段连接载体
  •       2.4.4 转化
  •       2.4.5 质粒提取
  •       2.4.6 阳性质粒鉴定
  •     2.5 病毒的增殖效价
  •       2.5.1 病毒噬斑实验
  • 50测定'>      2.5.2 TCID50测定
  •       2.5.3 病毒血清中和实验
  •     2.6 小鼠感染实验
  •   3 结果
  •     3.1 病毒的分离纯化
  •     3.2 组织样品的PCR检测
  •     3.3 四株PRV重要基因同源性与进化树
  •     3.4 病毒的增殖效价
  •       3.4.1 病毒噬斑
  • 50测定'>      3.4.2 TCID50测定
  •       3.4.3 血清中和效价
  •     3.5 PRV对小鼠的致病性
  •       3.5.1 PRV对小鼠LD50测定
  •       3.5.2 小鼠临床症状
  •   4 讨论
  •     4.1 PRV分离鉴定
  •     4.2 PRV毒力基因序列分析
  •   5 小结
  • 第三章 PRV全基因组测序和比较基因组学分析
  •   1 材料
  •     1.1 细胞与病毒株
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 实验仪器设备
  •   2 方法
  •     2.1 试剂配制
  •     2.2 病毒粒子纯化
  •     2.3 PRV DNA的提取
  •     2.4 PRV FJ01株和YK株全基因组测序和拼接
  •     2.5 基因同源性和进化树分析
  •     2.6 基因重组分析
  •   3 结果
  •     3.1 PRV FJ01株和YK株的基因组序列特征
  •       3.1.1 样本基因组拼接
  •       3.1.2 与参考序列比对分析
  •     3.2 PRV基因组同源性分析
  •       3.2.1 基因组序列同源性比对
  •       3.2.2 PRV各基因组核苷酸同源性比对
  •       3.2.3 PRV各基因组氨基酸同源性比对
  •       3.2.4 基因同源性差异较大区域比对
  •     3.3 PRV进化树分析
  •       3.3.1 全基因组进化树
  •       3.3.2 各基因序列的进化树分析
  •     3.4 重组分析
  •       3.4.1 全基因组重组分析
  •       3.4.2 基因编码序列的重组分析
  •   4 讨论
  •     4.1 测序方法
  •     4.2 全基因组和各基因遗传进化分析
  •     4.3 基因重组现象
  •   5 小结
  • 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 易可可

    导师: 颜其贵

    关键词: 伪狂犬病毒,变异株,全基因组测序,基因重组

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 四川农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000737

    总页数: 78

    文件大小: 3319k

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