马立克病病毒编码的miR-M11-5p宿主靶基因的筛选与鉴定

马立克病病毒编码的miR-M11-5p宿主靶基因的筛选与鉴定

论文摘要

作为α疱疹病毒的重要成员,马立克病病毒(MDV)感染鸡可引起免疫抑制及快速发作的T细胞淋巴瘤,即马立克病(MD)。此前发现MDV基因组编码大量病毒miRNA,可能在病毒复制、潜伏感染及肿瘤发生中起重要作用。基因敲除miR-M11-5p可显著增强MDV致病性及致瘤性,表明其可能是MD肿瘤抑制因子。为进一步揭示miR-M11-5p介导的调控机制,本研究利用鸡胚成纤维细胞(CEF)总RNA的cDNA为模板,通过hybrid-PCR扩增miR-M11-5p的候选宿主靶基因片段,然后连接至pMD19-T载体、转化至E.coli JM109中构建cDNA文库。对文库菌落进行PCR鉴定、测序分析以及Blast序列对比,共获得77个候选宿主靶基因,其中37个miRNA结合靶点位于候选靶基因的3′-UTR中。进一步通过双荧光素酶报告试验、miR-M11-5p过表达以及RT-qPCR分析,最终鉴定鸡MAFB、LOC776816和RFX7为miR-M11-5p的宿主靶基因。本研究为进一步阐明miR-M11-5p在MDV肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 毒株与细胞
  •   1.2 试剂与载体
  •   1.3 引物设计与合成
  •   1.4 miR-M11-5p候选靶基因文库构建
  •   1.5 双荧光素酶报告载体构建
  •     1.5.1 候选靶基因3′-UTR报告载体构建
  •     1.5.2 候选靶基因3′-UTR突变载体构建
  •   1.6 双荧光素酶报告试验
  •   1.7 RT-qPCR
  •     1.7.1 总RNA的提取
  •     1.7.2 cDNA制备
  •     1.7.3 qPCR
  •     1.7.4 数据分析
  • 2 结 果
  •   2.1 miR-M11-5p候选靶基因cDNA文库的构建及鉴定
  •   2.2 双荧光素酶报告载体的构建及鉴定
  •   2.3 双荧光素酶报告试验
  •   2.4 miR-M11-5p过表达对靶基因转录的抑制
  • 3 讨 论
  • 4 结 论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 刘豪丽,滕蔓,李会珍,余祖华,刘金玲,丁轲,张改平,罗俊

    关键词: 马立克病病毒,微小,靶基因,实时荧光定量

    来源: 畜牧兽医学报 2019年05期

    年度: 2019

    分类: 农业科技,基础科学

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共卫生重点实验室,河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室,河南农业大学牧医工程学院,扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患防控协同创新中心

    基金: 国家自然科学基金(31602050,U1604232),中原千人计划-中原基础研究领军人才,河南省农业科学院杰出青年科技基金(2019JQ01),河南省农业科学院科研发展专项资金(2019CY012)

    分类号: S852.652

    页码: 1026-1038

    总页数: 13

    文件大小: 2299K

    下载量: 157

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