周康平[1]2017年在《纤溶酶QK在毕赤酵母内的表达和发酵研究以及针对重组QK夹心酶联免疫吸附法的研发与运用》文中研究说明在生活水平日益提高的现在,血栓类疾病已经成为对人类生命健康威胁最严重的疾病之一。血栓类疾病具有极高的致死致残率,且发生形式多样,对血栓类疾病的预防和治疗越来越引起人们的关注。目前针对血栓类疾病的治疗主要主要有手术和药物治疗两种。本文主要研究一种具有良好应用前景的高纤溶活性的溶栓酶。纤溶酶QK是一种来从天然菌株Bacillus subtilis QK02发酵产物中分离得到的丝氨酸蛋白酶。其与纳豆激酶高度同源,在体内和体外都具有高纤溶活性,并且能抵抗胰蛋白酶分解,可以通过口服发挥抗血栓作用,同时其副作用小,安全性高,使其具有良好的潜力应用于血栓类疾病的预防和治疗。本文通过毕赤酵母表达系统成功表达重组QK,并对其大规模发酵、纯化和冻干体系进行了研究,研发了针对重组QK的双抗夹心ELISA检测方法并对其药代动力学进行了初步研究,研究结果分为以下叁个部分:1、针对毕赤酵母偏爱密码子对QK基因序列进行了优化,并将优化后的基因序列连接到穿梭质粒pPPICZαA上,转化入GS115中,成功获得了重组表达菌株GS115/pPPICZαA-QK。构建的菌株能高效分泌表达具有良好纤溶活性的重组QK蛋白。2、在摇瓶发酵的基础上确立了 GS115/pPPICZαA-QK重组菌株大规模发酵条件。甘油诱导菌体扩张和甘油补料阶段,控制温度在28℃,控制pH在5.0左右,溶氧不低于20%。在甘油补料阶段,控制甘油补料时间,使细胞湿重达到190-200g/L。甲醇诱导表达阶段开始后,发酵温度下降到26℃,继续控制pH在5.0左右,整个诱导过程控制发酵中溶氧不低于20%。在甲醇诱导发酵92h后,重组QK酶活最高可达到112,000IU/mL,发酵液中总蛋白浓度可达7.63 g/L。发酵液经过疏水层析(HIC)和凝胶过滤层析(GFC),后,91.73%的酶活性得到回收,同时重组QK蛋白纯度达到95%以上。此外对多种冻干保护剂在重组QK冻干过程中的保护效果进行了研究,5%的海藻糖和1%的脱脂奶粉的保护效果最好,可保持重组QK经过冻干后依然有94.2%和96.2%的活性,而在保存过程中海藻糖可以使重组QK冻干粉末在室温下一周活性基本无变化。3、通过对兔和小鼠使用纯化的重组QK蛋白进行免疫,获取了特异性针对重组QK蛋白的多克隆抗体和4株单克隆抗体,并在此基础上对抗体配对筛选,构建了以单抗为包被抗体,多抗为检测抗体的双抗夹心ELISA检测方法。通过对ELISA方法进行优化,成功建立了具有较高的灵敏度,高度的准确度、精密度,良好的重复性的针对重组QK蛋白的双抗夹心ELISA方法,检测灵敏度可达1.207ng/mL,组间和组内变异系数小于5%,回收率在95%-105%之间。成功运用ELISA方法初步分析了重组QK在大鼠中静脉注射药代动力学,确定其为二室房室模型,并获得了其主要动力学参数,T为后续更进一步的研究打下了基础。本论文中利用毕赤酵母表达系统表达分泌表达了具有纤溶活性的重组QK,并为其工业化大规模生产提供了参考方法。同时其检测方法和药代动力学的研究,也为溶栓酶QK的进一步推广和应用,以及其代谢机理的阐明打下乐基础。
沙冲[2]2015年在《华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶在异源宿主中的高效分泌表达》文中进行了进一步梳理在研究异源蛋白表达过程中,大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统是最为常见的也是使用最为广泛的两种表达系统。大肠杆菌由于具有培养周期短、遗传背景清晰和目的基因表达水平高等优点而被广泛使用,但是异源蛋白(尤其是真核蛋白)在大肠杆菌表达过程中,易产生包涵体,而且由于分泌机制尚不健全导致目标蛋白难以分泌。而毕赤酵母易进行高密度发酵培养和胞外分泌,并且能够进行相关的真核蛋白翻译后修饰。但是其高水平表达往往受外源基因剂量、外源基因的转录翻译和蛋白质的折迭转运等因素影响。因此,本论文以华根霉脂肪酶pro RCL(Rhizopus chinensis lipase)为研究对象,利用分子生物学技术手段,开展了pro RCL在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中高效表达机制的研究,主要研究内容包括:(1)大肠杆菌表达真核蛋白(特别是富含二硫键的蛋白)易产生包涵体,针对这一问题,构建了表达pro RCL的大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-pel B-pro RCLC,通过优化表达条件,仅5%的脂肪酶实现了可溶表达。为加强脂肪酶在大肠杆菌中的可溶高效表达,采取了两种策略。一方面,从大肠杆菌基因组中克隆得到了叁种膜蛋白基因lpp、Omp X和Osm Y。经过诱导条件优化后发现,融合蛋白Osm Y-pro RCL在17℃诱导温度下可溶性蛋白占总表达蛋白达90%以上。细胞定位分析发现,该融合蛋白存在于细胞质中,而非定位于细胞表面或分泌到细胞外。另一方面,将多种大肠杆菌可溶性标签(Trx A、Dsb C、Skp、Nus A和MBP)融合于脂肪酶pro RCL的N端,仅重组融合蛋白Trx A-pro RCL和MBP-pro RCL完全可溶表达。进一步细胞定位分析,两种融合蛋白仍均存在于细胞质中;胞内酶活力测定结果表明,重组蛋白MBP-pro RCL的酶活力达到98 U?m L-1,是重组蛋白Trx A-pro RCL的两倍以上;研究了大肠杆菌胞质氧化还原环境对脂肪酶MBP-pro RCL和pro RCL酶活力的影响,发现宿主菌BL21 trx B(DE3)和Origami2(DE3)提高了胞质中二硫键的合成能力,显着提高了目标脂肪酶的蛋白比活力。(2)针对异源蛋白在大肠杆菌表达系统中难以分泌的问题,将五种II型分泌途径中的信号肽融合于可溶性标签MBP的N端,再将脂肪酶基因分别融合于五种表达载体可溶性标签MBP的C端,构建了脂肪酶系列表达质粒SP-MBP3-pro RCL。经过诱导表达,其中叁种融合蛋白Omp A-MBP-pro RCL、Dsb A-MBP-pro RCL和Ycd O-MBP-pro RCL表达成功并分泌到细胞周质空间(细胞周质空间中酶活力所占的比例分别为39%、54%、41%)。提高诱导温度后,Omp A-MBP-pro RCL和Dsb A-MBP-pro RCL的周质空间分泌水平明显增加,而且Ycd O-MBP-pro RCL的胞外酶活力也明显增加。通过流式细胞仪检测细胞死活率及透射电子显微镜(TEM)观察分析发现,胞外目标蛋白的分泌可能是由于细胞渗漏所致。(3)异源蛋白在毕赤酵母中高水平表达易激发UPR效应,针对这一问题,通过优化外源基因剂量调控蛋白的表达水平,实现外源蛋白的高效表达。利用荧光定量PCR技术,建立了一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法,并准确鉴定了分别含有1、3、5、7拷贝华根霉脂肪酶基因muts表型的重组菌SRCL-1、SRCL-3、SRCL-5和SRCL-7。通过基因剂量的优化,重组菌SRCL-3的最高胞外酶活力达到280 U?m L-1,而重组菌SRCL-5和SRCL-7的胞外脂肪酶活力和蛋白浓度均有所下降。(4)从毕赤酵母基因组中成功克隆到了与UPR效应相关的伴侣蛋白基因PDI,并系统研究了不同拷贝PDI基因对不同拷贝脂肪酶基因表达的影响。研究发现,1拷贝伴侣蛋白基因对不同拷贝脂肪酶基因的重组菌均有不同程度的提高,其中5拷贝重组菌的表达水平达到355 U?m L-1。继续考察了伴侣蛋白基因剂量对多拷贝脂肪酶基因表达的影响,研究结果表明,多拷贝的伴侣蛋白基因过量表达反而不利于脂肪酶的高效表达及分泌,而1拷贝的伴侣蛋白基因PDI能够促进华根霉脂肪酶的高效表达。(5)通过荧光定量PCR的方法进一步筛选并鉴定了mut+表型含不同拷贝数脂肪酶基因的毕赤酵母基因工程菌。与muts表型不同,5拷贝重组菌达到了最高酶活力为260U?m L-1。另外,分析了不同重组菌胞内脂肪酶基因的相对转录水平,XY RCL-6的胞内脂肪酶基因转录水平在发酵初期(24 h)达到最高后则迅速下降。进一步分析了各株菌中蛋白折迭相关的伴侣蛋白基因ERO1和PDI的转录水平,从中推测高拷贝的重组菌由于胞内脂肪酶基因剂量过高,蛋白过量表达后进而激发了UPR效应的产生。基于酵母内质网中“ERO1p介导的氧化折迭模型”,构建了协同共表达两种伴侣蛋白ERO1p和PDI的毕赤酵母基因工程菌。单一共表达伴侣蛋白ERO1p或PDI无法提高mut+表型重组菌表达华根霉脂肪酶的能力,而协同共表达两种伴侣蛋白基因成功地提高了不同拷贝数脂肪酶基因的表达水平。其中,5拷贝重组菌的最高酶活力达到370 U?m L-1。通过共表达内质网中的两种伴侣蛋白为外源蛋白在毕赤酵母细胞中的高效表达提供了新的策略。
王长远[3]2008年在《甜味蛋白Brazzein酵母表达系统的建立》文中研究指明甜味蛋白是一类天然非糖类甜味物质,具有高甜度、低热卡、无毒安全、多功能等优点。Brazzein甜味蛋白是1994年从非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实中分离提纯得到,其甜度是等质量蔗糖的2000倍。到目前发现的7种甜蛋白中,Brazzein分子量最小,仅为6.5kD,它具有良好的水溶性,其结构相对简单并具有良好的热稳定性和pH稳定性,这些特性可有效解决目前甜蛋白应用过程中稳定性差,提取、加工困难等的问题,应用前景十分广阔。但天然产生的Brazzein资源有限,提取、分离成本昂贵;目前利用生物工程获得甜味蛋白的的研究中,原核系统表达获得的甜味蛋白易形成包涵体,表达的目的蛋白生物活性低或无生物活性;而用毕赤酵母表达系统获得Brazzein的报道较少。本研究采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建高效、分泌型的Brazzein毕赤酵母表达系统。根据文献报道Brazzein的氨基酸序列,按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因。敲除N端第一个氨基酸,同时将Brazzein蛋白中的第29位的天冬氨酸(Asp)变为天冬氨酰(Asn),41位的谷氨酸Glu(E)变为赖氨酸Lys(K),并根据表达载体pGAPZαA多克隆位点特点以及Brazzein基因酶切特性,设计4对引物,在上、下游引物分别引入Xba I与Xho I酶切识别位点。采用SOE-PCR法人工合成甜蛋白Brazzein基因,构建克隆载体pUC57- Bra,通过PCR、酶切和测序鉴定后,将正确的Brazzein基因克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,经鉴定,结果表明成功构建了pGAPZαA-Bra酵母表达载体。将重组质粒经限制性内切酶AvrⅡ线性化,用电转化的方法导入Pichia. pastoris SMD1168中,整合到毕赤酵母染色体的高效启动子3,-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的下游。用高浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子,用Brazzein基因特异引物进行PCR鉴定,结果证明已获得整合型阳性重组菌株,命名为SMD1168/pGAPZαA-Bra。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,筛选菌株后进行大规模培养,通过收集不同时间段的表达产物,进行SDS-PAGE分析表明,在诱导72h后目的蛋白表达量最大,达0.12g/L,表达蛋白的分子量约为6.5KD左右。对纯化后的蛋白进行了生物活性测定,经品尝鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好。综上所述,本研究成功构建了甜蛋白的真核表达载体pGAPZαA-Bra,并在SMD1168酵母受体菌中成功表达,为甜蛋白的进一步研究与应用打下了坚实基础。
左小虎[4]2012年在《毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究》文中指出胞内菌的治疗是目前临床医疗的难题之一。如结核分枝杆菌、沙门伤寒菌、嗜肺军团菌等胞内菌,它们通常寄生在人体吞噬细胞内,往往会对人体造成慢性持续性感染。当这些病菌侵染人体后会被吞噬细胞吞噬,但吞噬细胞不能像裂解大肠杆菌等非胞内菌那样将其杀死。例如胞内菌中的结核分枝杆菌已演化出了逃逸吞噬细胞裂解的机制,它通过阻止其所在吞噬泡的酸化进程,来阻止吞噬泡与溶酶体的融合。这样结核分枝杆菌就能长期寄生在胞内,并在人体免疫能力下降时侵染周围细胞。胞内菌的治疗主要是用抗生素等抗菌药长期疗法,大多数的抗生素等抗菌药治疗胞外菌疗效好,但它们很难进入细胞内或入胞浓度低难以杀死胞内寄生菌,并且长期用药也容易产生耐药菌。为探索解决胞内菌的治疗难题,本研究利用毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶,并利用该酶具有的甘露糖残基是巨噬细胞表面甘露糖受体的配体这一特点,研究利用巨噬细胞受体与配体之间的相互作用介导甘露糖化人溶菌酶内吞,以达到杀死寄生在巨噬细胞内病菌的目的。巨噬细胞等吞噬细胞是人体的固有免疫细胞,它们构成人体的第二道防线。巨噬细胞能通过细胞表面受体来识别入侵机体的病原体,在众多的表面受体中,甘露糖受体是重要的病原体模式识别受体之一。巨噬细胞能通过甘露糖受体的介导作用,将带有甘露糖糖链修饰的病原体内吞到胞内。因此利用甘露糖残基修饰的药物靶向巨噬细胞是一条值得探索的药物递送途径。巴斯德毕赤酵母表达系统是成功的蛋白分泌表达系统之一,该系统能对蛋白进行多种翻译后加工修饰,如能特异性在NXS/T(X为除脯氨酸以外的所有氨基酸)位点的天冬酰胺上进行外侧链为甘露糖残基的糖基化修饰。利用毕赤酵母的这一特性,可以使具有N-糖基化位点的蛋白进行甘露糖化修饰。人溶菌酶具有水解细菌肽聚糖层中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间的β-1.4糖苷键能力,它能杀死革兰氏阳性菌,在体内的补体的帮助下对革兰氏阴性菌也有一定的抑杀作用,因此具有潜在的药用价值。但是天然的人溶菌酶没有N-糖基化位点,理论上用毕赤酵母表达该蛋白也不会产生N-糖基化修饰。为获得甘露糖化修饰的人溶菌酶及对其相关特性的研究,本实验从以下几个方面进行：1、利用毕赤酵母表达甘露糖化修饰的人溶菌酶突变体本研究得到C-端融合2个N-糖基化位点序列的人溶菌酶突变体的融合基因,并以此构建了pPICZaA-hLYZ-myc-His载体,将该载体转化毕赤酵母GS115菌株。得到重组菌分泌表达的蛋白通过SDS-PAGE分析显示为一弥散的条带,弥散蛋白相对分子质量(Mr)位于20-45kDa之间。取其中Mr最小的带做肽指纹图谱分析,结果该重组蛋白的氨基酸序列与人源溶菌酶lysozyme precursor(EC3.2.1.17)的氨基酸重合率达36%；Western印迹表明弥散的重组蛋白均能与鼠抗人溶菌酶单克隆抗体特异性结合；重组蛋白经过PNGase F酶切分析,SDS-PAGE显示弥散条带消失,在理论Mr附近出现一条分子量均一的条带；用伴刀豆蛋白A(ConA)对该重组蛋白进行检测,结果表明该重组蛋白可以与ConA特异性结合。以上结果表明得到的重组蛋白为甘露糖化修饰的人溶菌酶。2、甘露糖化修饰的人溶菌酶可以被巨噬细胞内化通过构建人溶菌酶与增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的融合基因载体pPICZaA-hLYZ/eGFP,电转GS115构建重组菌GS115/pPICZaA-hLYZ/eGFP,该重组菌诱导表达重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、G25柱脱盐、镍亲和层析纯化获得目的重组融合蛋白,脱去咪唑与盐后冻干浓缩,将该重组融合蛋白与Raw264.7细胞共孵育,用激光共聚焦显微镜观察,发现有绿色荧光物质进入Raw264.7,而在有甘露糖竞争性配体甘露聚糖存在时,观察不到有绿色荧光物质进入Raw264.7细胞。此现象说明甘露糖化人溶菌酶能进入巨噬细胞且这一过程是由甘露糖受体介导的。3、低甘露糖化糖基酵母工程菌GJK05表达人溶菌酶及其活性鉴定通过构建pPICZaA-hLYZ载体及用作对照的载体pPICZaA-hLYZ(N/Q),电转化低糖基化酵母工程菌及GS115菌株,分别构建重组菌表达重组蛋白hLYZ及hLYZ(N/Q)。用伴刀豆蛋白A(ConA)检测重组蛋白的甘露糖化修饰；平板抑菌圈法比较重组人溶菌酶的活性,发现GS115表达高甘露糖化的重组人溶菌酶影响了其抑菌的活性。低糖基化酵母工程菌GJK05表达的重组人溶菌酶与Raw264.7进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜可观察到Raw264.7细胞内有荧光物质。综上述：本研究获得了具有活性的甘露糖化的重组人溶菌酶,该重组蛋白具有体外抑菌活性,并且能够在巨噬细胞表面的甘露糖受体的介导下进入巨噬细胞,为进一步研究甘露糖化人溶菌酶的胞内抑菌活性奠定基础。
林雪[5]2010年在《蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化》文中认为金黄色葡萄球菌蛋白A,简称蛋白A(Staphylococcus aureus protein A, SPA)能够特异性地与多种哺乳动物抗体结合,在抗体分析、分离以及医学领域有广泛的应用。但金黄色葡萄球菌为致病菌,蛋白A为细胞壁结合蛋白,因此,通过规模化培养金黄色葡萄球菌的方法获取蛋白A不仅有一定风险,且分离纯化也有一定难度。本论文的工作目标是研究利用基因工程技术生产重组蛋白A的方法。研究内容包括表达蛋白A的基因工程菌的构建以及培养条件(包括摇瓶和发酵罐培养)的优化。论文首先选择原核表达系统进行研究。选用大肠杆菌作为表达宿主菌,pET系列质粒作为表达载体,选择含有抗体结合域的不同长度的蛋白A编码基因进行基因构建。分别获得了四种不同分子量蛋白A的胞内表达,发现spa4的表达量最大,且与IgG结合活性良好,因此,选择该表达菌株进行后续研究。分别在摇瓶和发酵罐中进行了培养条件和诱导条件的优化。在摇瓶培养中,对诱导剂加入时间和加入量进行了初步优化,发现在菌体培养1～6小时时间段内,随着诱导剂加入时间的延后,工程菌的生长密度逐渐增加,但单位菌体蛋白A的表达量相差不大。诱导剂IPTG和乳糖均能有效诱导蛋白A表达,但乳糖对菌体生长的抑制作用较弱。在5 L发酵罐中,利用指数流加的补料方式,对补料速率进行优化。获得优化的培养模式为：以300 g/L的葡萄糖、50g/L的酵母提取物作为补料培养基,以0.1 h-1为理论比生长速率计算补料速率,在菌体OD600nm达到60时加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG。在优化的条件下,最终发酵液的菌体密度OD60nm达70以上,重组蛋白A表达量占菌体胞内总蛋白的比例约为22%,每升菌液重组蛋白A表达量约为2.6 g。为了简化重组蛋白A分离纯化的难度和成本,论文进一步对能够实现蛋白A外泌表达的真核表达系统进行了研究。利用毕赤酵母作为表达宿主、pPIC9K作为表达载体、选择仅含抗体结合功能区的蛋白A编码基因成功构建了外泌表达蛋白A的基因工程菌。在摇瓶培养中,考察了培养基组成,诱导剂甲醇加入量及诱导时间对重组蛋白A表达的影响。实验结果表明,利用BMGY/BMMY培养基,诱导阶段每24 h加入甲醇至终浓度0.5%,诱导84 h,目标蛋白的表达量最大。所表达的重组蛋白A与人IgG结合活性良好。通过本论文的研究,建立了重组蛋白A的原核和真核表达体系,对其培养和诱导条件进行了系统优化,研究结果为规模化生产重组蛋白A奠定了基础。
沈伟[6]2016年在《毕赤酵母醇氧化酶启动子调控相关激酶的研究与应用》文中研究表明毕赤酵母表达系统是应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,目前已经有超过5000种蛋白通过毕赤酵母系统实现了重组表达。重组蛋白的表达主要依赖一个高效的醇氧化酶基因启动子PAOX1,该启动子受到甲醇的强烈诱导但在其他碳源如葡萄糖、甘油、乙醇中被严格阻遏。由于PAOX1的诱导需要甲醇,其有毒、易燃易爆等特性使得在大规模发酵及生产食用医用产品等方面存在很大限制。其中一个行之有效的解决办法是开发一种不使用甲醇而能够使用其他碳源来高效诱导PAOX1表达重组蛋白的非甲醇依赖型毕赤酵母表达系统。这一设想的实现首先要求对毕赤酵母PAOX1的调控机制需要有较为清楚的认知。目前的研究还仅停留在单个因子的研究上,例如碳源感受体、转运子以及转录因子。激酶在信号转导中扮演着重要的角色,而目前对于激酶的研究则非常少。因此本研究在毕赤酵母数据库中查找了所有目前已注释为激酶的基因,将这些激酶基因单独缺失后建立突变体文库,进行了在不同碳源中的生长状态以及Aox酶活的检测。而后我们从中选取了一个具有比较明显表型的缺失株△hog1,对其在甘油培养条件下进行磷酸化蛋白质组鉴定并与甲醇和甘油培养的野生型毕赤酵母菌株进行了比较与分析。另外我们还根据激酶敲除的结果针对△gut1与△dak菌株成功构建了 2个具有开发潜力的新型非甲醇诱导表达系统,分析了其表达异源重组蛋白的能力。本文首先在毕赤酵母数据库中查找到了 152个已注释的激酶基因,成功地对其中的92个激酶基因进行了单独的缺失。通过对缺失株在不同碳源中的生长状况检测,鉴定了23个激酶基因与毕赤酵母的生长有关,其中影响最为明显的包含有3个碳源非特异性生长相关基因:PAS_chr3_0667,PAS_chr2-1_0168和PAS_chr3_0112,这些基因的缺失株在葡萄糖、甘油及甲醇碳源中生长均受抑制;一个甘油特异性生长相关基因:PAS_chr4_0783,该缺失株仅在甘油碳源中的生长受到抑制;以及8个甲醇特异性生长相关基因:PAS_chr1-4_0340,PAS_chr1-4_0498,PAS_chr3_0841,PAS_chr1-3_0213,PASchr3_0360,PASchr2-10211,PASchr30042以及PAS_FragB_0061,其缺失株仅在甲醇中的生长受到抑制。通过对缺失株进行不同碳源中的Aox酶活检测,鉴定了 9个激酶基因与毕赤酵母PAOX1的激活/阻遏调控相关,其中包含5个与PAOX1甘油碳源阻遏相关的基因:PAS_chr1-3_0232,PAS_chr1-40271,PASchr1-1_0105,PAS chr3_0220和PASchr40783;4个与PAOX1甲醇碳源激活相关的基因:PASchr2-1_0641,PAS_chr2-1_0028,PAS_chr2-1_0639 及 PAS_chr1-4_0498。基于激酶筛选结果我们挑选了△hog1菌株,将WT在甲醇及甘油碳源培养条件下以及△hog1菌株在甘油培养条件下叁个样品的全蛋白进行磷酸化蛋白质组的鉴定。结果发现在肽段的磷酸化位点数量分布,磷酸化氨基酸的种类分布情况在叁个样品中均呈现一个较为一致的情况,仅在绝对数量上有一定区别。对于磷酸化蛋白的GO以及COG分析我们同样也发现,GO分析与COG分析结果在叁个样品中的分布在总体状态上呈现一致。而通过叁个样品间差异磷酸化蛋白的分析我们鉴定了各类在不同菌株不同碳源中特异性磷酸化的蛋白以及157个Hog1激酶可能的作用底物。这些数据结果给未来的进一步研究提供了一定的基础。基于激酶筛选结果我们挑选了△gut1和△dak菌株,在这2个菌株的基础上我们成功构建了具有一定开发前景的△gut1-HpGCY1-Glycerol以及△dak-DHA非甲醇诱导型表达系统。△gut1-HpGCY1-Glycerol系统可以使用甘油作为唯一碳源诱导PAOX1的表达,△dak-DHA系统可以使用二羟基丙酮(DHA)作为唯一碳源诱导PAOX1的表达,两个系统中PAOX1在葡萄糖碳源中均被完全阻遏。因此,这两个系统均保留了毕赤酵母PAOX1原本的可调控能力。转录分析表明在两个系统中,在甘油或DHA碳源培养条件下,甲醇代谢通路与过氧化物酶体相关合成基因相对于野生株都有不同程度的提升,PAOX1的脱阻遏发生在转录水平。而在Western bolt检测中,两个系统在甘油或DHA碳源中在蛋白层面上均能够检测到Aox蛋白的存在。通过表达绿色荧光蛋白我们发现,△dak-DHA系统异源重组蛋白的表达水平要优于△gut1-HpGCY1-Glycerol系统。进一步通过表达3种不同来源不同定位的异源重组蛋白,我们发现△dak-DHA系统的表达水平能达到传统以甲醇为碳源进行诱导的50～60%,并在单细胞表达能力上均优于组成型启动子PGAP。
林欢[7]2008年在《鸡贫血病毒VP1、VP2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及产物免疫保护性研究》文中研究指明本研究根据GenBank已公布的CAV的VP1和VP2基因序列,利用Oligo6.0分子生物学软件分别设计扩增引物,从已构建的载体pBluemCAV重组质粒中分别扩增出VP1及VP2基因,并将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,分别构建成重组质粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2,将构建好的载体均用SalⅠ线性化后,分别转化给酵母SMD1168细胞,经PCR鉴定、甲醇诱导表达、SDS-PAGE、Dot-Elisa和Western blot试验,结果表明:CAV VP1基因能够分泌表达,在约50KD处出现特异带,经紫外分光光度计测量,重组VP1蛋白在上清中的含量约为15μg/ml;VP2基因经破碎酵母细胞,释放胞内蛋白,在约30KD处出现特异带;经凝胶分析仪分析,紫外分光光度计测量,VP2蛋白占酵母总蛋白的21%。表达蛋白量约为25μg/ml,均属于高效表达。Dot-Elisa结果显示被检重组蛋白CAV VP1及CAV VP2都出现特异性颜色反应;免疫印记试验表明重组蛋白CAV VP1能够与针对CAV VP1的单克隆抗体反应,在50KD处出现特异带,具有良好的反应原性,重组蛋白CAV VP2与针对CAV VP1的单克隆抗体未见反应。分别将重组CAV VP1、CAV VP2蛋白乳化后,免疫6周龄BALB/c鼠,分离血清,Elisa试验结果显示所得血清分别可以与全病毒反应;IFA试验免疫重组蛋白CAV VP1制得的多克隆血清可以和感染CAV的MDCC-MSB1反应,而VP2没有反应。本研究优化了发酵条件与表达产量的关系,确定重组酵母表达CAV VP1及CAV VP2蛋白的最佳条件为:30℃,pH 6.0,溶氧值40%,空气流量1.25 vvm,当确定甘油耗尽时,通过分批补料的方式进行甲醇补料,诱导表达,最终OD600可达到250或更高,通过比较不同温度下保存重组蛋白的降解率得出表达蛋白保存于-20℃。这一工作为CAV VP1及CAV VP2蛋白的大规模发酵表达和应用打下了良好的基础。将发酵表达的重组蛋白CAV VP1、CAV VP2经薄层胶扫描、紫外分光光度计定量后,与等体积FREUND’SADJUVANT(SIGMA公司)乳化后,分为对照组、CAV VP1、CAV VP1+CAV VP2叁组,分别胸肌注射10日龄CAV阴性SPF雏鸡,免疫前后均采血,分离血清,Elisa试验显示免疫3周CAV VP1+CAV VP2组可检测到抗体,直到4周CAV VP1+CAV VP2组抗体滴度有所升高,5周达到最高滴度,6周后抗体滴度成平稳趋势,CAV VP1组3周可检测到较低抗体,之后抗体水平未见升高,对照组成阴性反应;IFA试验结果表明CAV VP1+CAV VP2组免疫3周后可检测到微弱的中和抗体,4周后可见较强荧光,CAV VP1组和对照组均未见到荧光。同时将乳化后的重组蛋白CAV VP1、CAV VP2分为对照组、CAV VP1、CAV VP1+CAV VP2叁组,分别胸肌注射无免种鸡,监测血清及卵黄抗体滴度,Elisa结果显示CAV VP1+CAV VP2组5周血清和卵黄抗体水平同时达到最高,之后波动较小,CAV VP1组及对照组血清和卵黄抗体水平均无明显波动;对免疫后2周孵化雏鸡1日龄攻毒(CAV),对照组攻毒13天增重有明显下降;分别于攻毒后7、14、21天时剖检,进行病理切片检查,免疫CAV VP1试验组和对照组胸腺淋巴细胞坏死、减少,伴有出血、髓质内浆析出;肝细胞空泡变性、小血管淤血;脾脏鞘动脉增生、周围有少量淋巴细胞围绕。免疫CAV VP1+CAV VP2试验组无明显变化。
施建忠[8]2004年在《禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）HA、NA和M2基因的表达》文中指出禽流感（Avian Influenza，AI）是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合征。此病广泛流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病力禽流感（HPAI）多以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致感染鸡群的全群覆没，被国际兽疫局列为A类烈性传染病。97’香港高致病力H5N1亚型禽流感病毒直接感染人并致人死亡这一事件的发生，以及99’从两名出现轻微流感症状的香港儿童体内分离到H9N2病毒，使得禽流感在公共卫生学具有突出意义。2001年，香港再度发现H5N1亚型HPAIV，特区政府又斥资8000万港币扑杀120万只鸡，并且至今没有将H5N1亚型HPAIV污染的活禽市场彻底净化。而对于国内预防和控制禽流感的发生，目前普遍采用的手段主要还是疫苗接种。因此，我们表达H5N1亚型HPAIV的主要免疫原性相关蛋白，将为研制禽流感亚单位疫苗奠定基础。同时，也为建立禽流感病毒单分子诊断试剂盒、蛋白质晶体结构与分子致病机理的关系研究奠定基础。禽流感病毒的主要免疫原性相关蛋白有HA、NA、NP和M2蛋白，HA是位于病毒囊膜表面的一种糖蛋白，可诱导机体产生中和抗体。NA是AIV体液免疫的另一靶抗原，它可诱导机体产生特异性的抗体，但它不具有病毒中和作用。NP只能产生很微弱的抗感染能力。M2在交叉免疫方面，起着较为重要的作用。目前，世界上已用于表达流感病毒免疫原性相关蛋白所用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、昆虫表达系统、酵母表达系统以及哺乳动物表达系统。几十年来，学者们对禽流感病毒免疫原性相关蛋白进行了各种表达研究，文献显示，每个表达系统都有其优缺点。因此，本研究根据文献参考，分析禽流感病毒H5N1亚型NA、HA和M2基因及蛋白的特性，利用毕赤酵母、杆状病毒/昆虫、原核GST融合表达系统分别对其进行表达。1.采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒A/ Goose/Guangdong/1/96（GD1/96）H5N1亚型 NA基因，克隆入pMD18-T vector 中，再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的pichia pastoris酵母表达载体pPIC9K中，从而构建了重组转移载体pPIC9KNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115、筛选高拷贝重组转化子、筛选His＋Mut＋表型转化子后，摇瓶培养，1%甲醇诱导表达，诱导培养上清用于生物学活性检测。SDS-PAGE初步结果显示：表达产物以可溶性的分子形式存在于培养上清中。蛋白胶薄层扫描分析显示酵母培养物上清中NA蛋白的含量为18%。Western-blot、双向琼脂扩散实验、神经氨酸酶实验分析证明，已获得几株高效表达重组表达株，并证明该重组蛋白具有生物学活性。2.经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 H5N1亚型 1.7kb HA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。该株HA基因与Genebank下载的3株H5N1亚型禽流感病毒的HA基因进行序列比较分析，核苷酸同源性较高，分别为99﹪，97.9﹪和98.1﹪。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中，构建的重组转移载体命名为pMelBacH5HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染Sf9昆虫细胞，经叁
许宁[9]2017年在《毕赤酵母中AOX1启动子调控因子的研究以及新型启动子的鉴定》文中研究表明毕赤酵母表达系统广泛应用于重组蛋白的表达,目前已经成为最为常用的真核表达系统之一。但是与其他表达系统比较,毕赤酵母中已经开发并用于重组蛋白表达的启动子数量有限。目前最常用启动子为AOX1启动子,PAOX1非常高效,受甲醇碳源激活,葡萄糖、甘油、乙醇等碳源严格阻遏。但是除了几个已知的转录因子外,PAOX1的调控机制还不甚明朗,因此本课题基于转座子标签突变技术,筛选并研究了与PAOX1的转录调控和过氧化物酶体合成相关的基因。此外由于甲醇有毒易燃等特性限制了毕赤酵母表达系统在食品医药行业以及工业上的大规模应用,本课题也尝试在毕赤酵母中鉴定更多的组成型或碳源特异性诱导型启动子。首先为了更好地研究PAOX1的调控机制,利用FLD1基因缺失后菌株在高甲醇浓度下甲醛氧化为甲酸的途径被抑制,从而积累过多甲醛最终致死的特性,利用转座子突变质粒PMSBHis4MazfARS对GS115-△FLD1进行随机突变。如果突变的基因是AOX1启动子的转录激活因子或过氧化物酶体合成的相关基因,则该菌株Aox酶合成受阻,不会代谢甲醇,即使在高甲醇的条件下也不会积累甲醛致死,如果向培养基中添加非抑制的碳源山梨醇,那么菌株可以利用山梨醇进行生长;而其他的突变菌株由于依然可以合成Aox酶,仍然会代谢甲醇,积累大量甲醛而致死。利用这样的原理,最后筛选到7个在高甲醇浓度下依然可以生长的突变株,通过Aox酶活显色,发现其中两个显色反应明显变弱,通过Tail-PCR测序比对,其中一个是与过氧化物酶体形成有关的基因PEX30,另一个是功能未知的基因PASchr1-4_0251。另一方面,通过比较毕赤酵母野生型菌株在葡萄糖、甘油和甲醇叁种不同碳源条件下的转录组数据,找到在不同碳源下表达差异较大的基因,结合各自RNA折迭结构和吉布斯自由能大小(△G),挑选出在不同碳源中表达强度差异较大的启动子,通过绿色荧光蛋白GFP和重组高温淀粉酶对启动子强度进行鉴定,最终鉴定到两个较有潜力的新型启动子可以应用到重组蛋白表达:分别是甲醇诱导型启动子P0547和组成型启动子P0472。
肖俊梅[10]2013年在《ZEN降解酶A4-Prx在酵母中的分泌表达及其应用研究》文中认为玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN，ZEA)是一种由镰刀菌属产生的具有雌激素毒性的真菌毒素，由于ZEN具有生殖发育毒性、免疫毒性以及肿瘤诱发性，易导致动物和人生殖系统发生紊乱，对人和动物的健康有潜在危害，所以日益受到重视。目前，为了减少食品和饲料中残留的ZEN及其衍生毒素对农业和养殖业带来的损失，国内外研究人员开发了物理、化学和生物各类脱毒方法。物理法和化学法脱毒效率低，且破坏原料的营养成分，并带来环境污染；而生物转化法可彻底把ZEN降解转化成为无毒的物质，是一种真正意义上的脱毒方法。本实验室已分离的不动杆菌Acinetobacter sp. SM04可将ZEN降解成极低雌激素活性的无毒产物，本论文主要致力于将Acinetobacter sp. SM04中有降解ZEN作用的关键酶A4-Prx的基因在酵母系统中进行分泌表达研究，包括诱导条件优化、重组蛋白A4-Prx降解ZEN的活性测定及其应用于ZEN污染食品和酒精糟中的脱毒效果等。本论文成功构建了重组分泌表达载体pYα-A4-Prx和pPIC9K-A4-Prx，将其分别转化至酿酒酵母INVSc1和毕赤酵母GS115表达宿主中，构建重组酿酒酵母INVSc1/pYα-A4-Prx和重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx，两者均成功分泌表达得到ZEN降解酶A4-Prx。重组酿酒酵母INVSc1/pYα-A4-Prx的A4-Prx表达量约70.00mg/L，蛋白分子量约20kDa，对ZEN的降解率为47.50%；重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx的A4-Prx表达量约75.97mg/L，SDS-PAGE电泳显示蛋白分子量约为41kDa（A4-Prx可能形成二聚体），对ZEN的降解率为48.00%。本论文选取重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx，单因子实验中，进行单因素表达条件优化实验，确定了各因素的优化范围：pH为6.0~8.0，温度为30℃；而且，不同氨基酸的添加会促进蛋白的表达，其中Gly、Lys和Ala叁种氨基酸的添加效果较好，最佳浓度为0.10%；此外，尝试添加蛋白酶抑制剂EDTA (10mmol/L)，虽可使重组蛋白A4-Prx的表达量略有增加，但其对ZEN的降解效果却大大降低了。本论文进一步采用响应面分析法，研究了pH、温度和Gly浓度对重组蛋白A4-Prx表达的影响。结果表明，当pH为7.0、添加Gly浓度为0.11%、温度为30℃时，重组蛋白A4-Prx的表达量最高，达到130.39mg/L，ZEN降解率为78.44%，相对于优化前对照组均提高近一倍。本论文对污染较严重的几种市售食品以及玉米酒精糟DDGS应用重组蛋白A4-Prx进行ZEN降解实验。结果表明，重组酶A4-Prx对不同程度ZEN污染的食品均有高效降解ZEN的能力，且对ZEN污染最严重的醋和酱油的降解率接近80.00%，对DDGS的降解率为83.45%。针对ZEN生物降解关键酶A4-Prx，本论文采用基因工程研究方法，成功地构建了重组酵母INVSc1/pYα-A4-Prx和GS115/pPIC9K-A4-Prx，两者均成功表达得到重组蛋白A4-Prx，对ZEN都显示出接近50.00%的降解率；对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx进行表达条件优化，当培养基pH7.0、添加0.11%Gly、30℃诱导时，重组蛋白A4-Prx的表达效率可提高近一倍，达到130.39mg/L，ZEN降解率78.44%；将其应用于市售食品和DDGS的ZEN降解实验，获得显着效果，为研究控制食品中ZEN污染奠定了基础。
参考文献：
[1]. 纤溶酶QK在毕赤酵母内的表达和发酵研究以及针对重组QK夹心酶联免疫吸附法的研发与运用[D]. 周康平. 武汉大学. 2017
[2]. 华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶在异源宿主中的高效分泌表达[D]. 沙冲. 江南大学. 2015
[3]. 甜味蛋白Brazzein酵母表达系统的建立[D]. 王长远. 黑龙江八一农垦大学. 2008
[4]. 毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究[D]. 左小虎. 安徽大学. 2012
[5]. 蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化[D]. 林雪. 大连理工大学. 2010
[6]. 毕赤酵母醇氧化酶启动子调控相关激酶的研究与应用[D]. 沈伟. 华东理工大学. 2016
[7]. 鸡贫血病毒VP1、VP2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及产物免疫保护性研究[D]. 林欢. 中国农业科学院. 2008
[8]. 禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）HA、NA和M2基因的表达[D]. 施建忠. 新疆农业大学. 2004
[9]. 毕赤酵母中AOX1启动子调控因子的研究以及新型启动子的鉴定[D]. 许宁. 华东理工大学. 2017
[10]. ZEN降解酶A4-Prx在酵母中的分泌表达及其应用研究[D]. 肖俊梅. 华南理工大学. 2013
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