首页> 正文

宿主Prdx6与生殖系统相关细胞内布鲁氏菌寄生关系的研究

2020-12-02阅读(929)

宿主Prdx6与生殖系统相关细胞内布鲁氏菌寄生关系的研究

论文摘要

布鲁氏菌（Brucella）可在吞噬细胞和非吞噬细胞内寄生,引起在我国流行较为广泛的传染性人兽共患布鲁氏菌病（Brucellosis）。近年来,随着畜牧业的快速发展,种群数量和饲养密度逐年增加,导致动物间布鲁氏菌病的感染率和发病率骤然上升。该病感染初期不易被察觉,一旦进入慢性期可导致多种器官和系统受损。动物布鲁氏菌病主要引起公畜睾丸炎、母畜流产、死胎等生殖系统疾病;布鲁氏菌病患者发病主要表现为男性睾丸炎、前列腺炎、女性卵巢炎等。布鲁氏菌病的流行严重威胁养殖业的发展和人类健康,同时造成巨大的经济损失。过氧化物还原酶6（Peroxiredoxin 6,Prdx6）是半胱氨酸依赖性过氧化物酶家族的一员,具有三种酶活性,包括过氧化物酶活性、磷脂酶A2活性以及溶血磷脂胆碱脂酰转移酶活性。本课题组前期研究发现,布鲁氏菌感染绵羊后,引起绵羊Prdx6的表达水平发生明显的差异变化。为了深入探讨Prdx6与布鲁氏菌胞内寄生的关系,本课题组成功表达羊和小鼠Prdx6重组蛋白,并制备抗Prdx6兔源多抗和鼠源单抗。经研究发现,宿主Prdx6对巨噬细胞内布鲁氏菌的寄生起促进作用,其表达量的变化与炎症反应、白细胞迁移明显相关。目前未见在其它细胞中研究布鲁氏菌感染与宿主Prdx6关系的研究报道。基于巨噬细胞中Prdx6与布鲁氏菌寄生的重要联系,结合布鲁氏菌感染主要侵袭生殖系统,本研究以HPT-8（小鼠胚胎滋养层细胞）、TM4（小鼠睾丸支持细胞）和CHO（中国仓鼠卵巢细胞）等生殖系统相关细胞为研究对象,利用过表达、沉默和基因敲除等技术手段,进一步探讨宿主Prdx6与生殖系统相关细胞中布鲁氏菌胞内寄生能力的关系,并分析Prdx6表达量变化引起布鲁氏菌感染生殖系统相关细胞内细胞因子差异表达情况,为进一步探讨布鲁氏菌引发宿主生殖系统疾病的分子机制提供科学依据。本研究利用猪种布鲁氏菌S2菌株感染生殖系统相关细胞,通过Western Blot技术分析胞内Prdx6蛋白表达的变化情况。结果显示:在HPT-8、TM4和CHO三种细胞中,在12 h-48 h Prdx6的表达量均呈显著上升趋势。表明布鲁氏菌感染可以引起生殖系统相关细胞Prdx6的差异表达。通过RNA干扰载体和过表达载体调节HPT-8、TM4和CHO细胞中Prdx6表达水平,分析Prdx6的差异表达对布鲁氏菌在生殖系统相关细胞内存活的影响。同时,利用CRISPR/Cas9技术敲除HPT-8、TM4和CHO细胞系Prdx6基因,以非脂质体转染法将构建的Prdx6-pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA载体转入细胞,经筛选验证,成功建立Prdx6基因缺失的HPT-8细胞系,并利用猪种布鲁氏菌S2菌株侵染Prdx6基因缺失的HPT-8细胞。结果显示,Prdx6的过表达可以提高布鲁氏菌在HPT-8、TM4和CHO等生殖系统相关细胞内的寄生能力。Prdx6的敲降和缺失可减弱布鲁氏菌胞内的生存能力。在对HPT-8、TM4和CHO中的Prdx6进行过表达和干扰后,进行细菌侵染实验,利用荧光定量PCR技术检测相关细胞因子DLL4、ICAM-1、JAM-A、MCSF、MIP-1b和Progranulin的表达。结果显示:在布鲁氏菌侵染条件下,当Prdx6上调表达时,Progranulin呈现下调表达趋势,MCSF呈现上调表达趋势;在Prdx6敲降组细胞中则相反。而DLL4、ICAM-1、JAM-A和MIP-1b无明显差异。Progranulin和MCSF可能与宿主Prdx6响应布鲁氏菌感染相关,但仍需进一步研究。本研究发现宿主Prdx6的表达有利于生殖系统相关细胞内布鲁氏菌的寄生。且在布鲁氏菌感染下,Prdx6的差异表达会引起Progranulin和MCSF细胞因子表达的变化,为深入探究布鲁氏菌在生殖系统相关细胞中感染与寄生机制提供新的切入点,为布鲁氏菌病防控治疗的进一步研究提供依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • abstract
  • 引言
  • 第一篇 文献综述
  •   第一章 布鲁氏菌的研究进展
  •     1.1 布鲁氏菌病病原学
  •     1.2 布鲁氏菌的感染机制
  •       1.2.1 布鲁氏菌感染吞噬细胞
  •       1.2.2 布鲁氏菌感染非吞噬细胞
  •       1.2.3 布鲁氏菌感染与宿主反应相关蛋白的研究
  •     1.3 布鲁氏菌病的流行及危害
  •       1.3.1 人间布鲁氏菌病
  •       1.3.2 动物布鲁氏菌病
  •     1.4 诊断
  •       1.4.1 病原学诊断
  •       1.4.2 血清学诊断
  •       1.4.3 分子生物学诊断
  •     1.5 布鲁氏菌病的治疗
  •   第二章 PEROXIREDOXIN6 的研究进展
  •     2.1 PRDX6 蛋白的结构
  •     2.2 PRDX6 的酶活性
  •       2.2.1 Prdx6 过氧化物酶活性
  •       2.2.2 Prdx6 磷脂酶A2 活性
  •       2.2.3 Prdx6 溶血磷脂胆碱脂酰转移酶活性
  •     2.3 PRDX6 生物体及组织分布
  •     2.4 PRDX6 在疾病中的作用
  •       2.4.1 Prdx6 在阿尔茨海默病中的作用
  •       2.4.2 Prdx6 在肌萎缩侧索硬化症中的作用
  •       2.4.3 Prdx6 在多发性硬化症中的作用
  •       2.4.4 Prdx6 在感染性疾病中的作用
  •   第三章 CRISPR/CAS9 研究进展
  •     3.1 CRISPR/CAS系统的发展史及其分类
  •     3.2 CRISPR/CAS9 的作用机制
  •     3.3 CRISPR/CAS9 技术的应用
  •     3.4 CRISPR/CAS9 与基因治疗
  •     3.5 小结与展望
  • 第二篇 研究内容
  •   第一章 布鲁氏菌侵染生殖系统相关细胞差异表达PRDX6 分析
  •     1.1 材料
  •       1.1.1 主要试剂
  •       1.1.2 主要仪器
  •       1.1.3 主要材料
  •     1.2 方法
  •       1.2.1 猪种布鲁氏菌S2 株的培养与鉴定
  •       1.2.2 布鲁氏菌侵染生殖系统相关细胞Prdx6 差异表达及胞内活菌计数分析
  •       1.2.3 胞内Prdx6 蛋白表达量的检测
  •       1.2.4 统计分析
  •     1.3 结果
  •       1.3.1 猪种布鲁氏菌S2株16S rDNA扩增与菌种鉴定
  •       1.3.2 猪种布鲁氏菌S2 株侵染细胞引起Prdx6 蛋白表达差异的分析
  •     1.4 讨论
  •       1.4.1 细胞的选择
  •       1.4.2 生殖系统相关细胞Prdx6 差异表达及胞内活菌数变化的分析
  •     1.5 小结
  •   第二章 生殖系统相关细胞PRDX6 对布鲁氏菌胞内存活的影响
  •     2.1 材料
  •       2.1.1 主要试剂
  •       2.1.2 主要材料
  •     2.2 方法
  •       2.2.1 质粒的转化
  •       2.2.2 质粒的提取
  •       2.2.3 乙醇沉淀法提纯质粒
  •       2.2.4 生殖系统相关细胞Prdx6 过表达对布鲁氏菌胞内寄生的影响
  •       2.2.5 生殖系统相关细胞Prdx6 的干扰对布鲁氏菌胞内寄生的影响
  •       2.2.6 统计分析
  •     2.3 结果
  •       2.3.1 HPT-8 细胞内Prdx6 过表达验证
  •       2.3.2 HPT-8 细胞Prdx6 过表达对胞内布鲁氏菌存活的影响
  •       2.3.3 TM4 细胞内Prdx6 过表达验证
  •       2.3.4 TM4 细胞Prdx6 过表达对胞内布鲁氏菌存活的影响
  •       2.3.5 CHO细胞内Prdx6 过表达验证
  •       2.3.6 CHO细胞Prdx6 过表达对胞内布鲁氏菌存活的影响
  •       2.3.7 HPT-8 细胞Prdx6 RNA干扰载体的筛选
  •       2.3.8 HPT-8 细胞Prdx6 敲降对细胞内布鲁氏菌存活的影响
  •       2.3.9 TM4 细胞Prdx6 RNA干扰载体的筛选
  •       2.3.10 TM4 细胞Prdx6 敲降对细胞内布鲁氏菌存活的影响
  •       2.3.11 CHO细胞Prdx6 RNA干扰载体的筛选
  •       2.3.12 CHO细胞Prdx6 敲降对胞内布鲁氏菌存活的影响
  •     2.4 讨论
  •       2.4.1 RNA干扰载体的选择
  •       2.4.2 转染方法的选择
  •       2.4.3 生殖系统相关细胞Prdx6 的差异表达对布鲁氏菌存活的影响
  •     2.5 小结
  •   第三章 PRDX6 敲除细胞系的建立与布鲁氏菌侵染分析
  •     3.1 材料
  •       3.1.1 质粒、菌种和细胞株
  •       3.1.2 主要试剂
  •     3.2 方法
  •       3.2.1 Prdx6 基因CRISPR/Cas9 敲除载体的构建
  •       3.2.2 质粒的提取
  •       3.2.3 细胞的复苏及培养
  •       3.2.4 细胞转染
  •       3.2.5 Prdx6 基因敲除细胞株的筛选
  •       3.2.6 阳性细胞株的鉴定
  •       3.2.7 脱靶检验
  •       3.2.8 细菌侵染
  •       3.2.9 统计学分析
  •     3.3 结果
  •       3.3.1 Prdx6-pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA表达载体的构建及鉴定
  •       3.3.2 敲除Prdx6 基因的细胞系筛选
  •       3.3.3 Western-blot结果
  •       3.3.4 细菌侵染
  •     3.4 讨论
  •     3.5 小结
  •   第四章 布鲁氏菌感染生殖系统相关细胞差异表达细胞因子分析
  •     4.1 材料
  •       4.1.1 主要试剂和仪器
  •       4.1.2 引物
  •     4.2 方法
  •       4.2.1 荧光定量PCR样品
  •       4.2.2 细胞总RNA提取及反转录操作步骤
  •       4.2.3 荧光定量PCR分析
  •       4.3.5 统计分析
  •     4.3 结果
  •     4.4 讨论
  •     4.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 导师简介
  • 作者简介及科研成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 翟菲菲

    导师: 任洪林

    关键词: 布鲁氏菌,过氧化物还原酶,生殖系统,胞内寄生

    来源: 吉林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 吉林大学

    基金: 国家重点研发计划 (编号:2018YFD0500900),吉林省科技发展计划项目资助(编号:20170101149JC)

    分类号: S852.61

    DOI: 10.27162/d.cnki.gjlin.2019.000421

    总页数: 110

    文件大小: 5818K

    下载量: 65

    相关论文文献

    • [1].敲低小胶质细胞中过氧还原素6(PRDX6)降低氧糖剥夺再复氧神经元的存活[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2016(08)
    • [2].肿瘤自身抗体NY-ESO-1和PRDX6联合热休克蛋白70检测对肺癌的诊断价值[J]. 中华实用诊断与治疗杂志 2015(10)
    • [3].Prdx6对神经干细胞增殖和分化的影响研究[J]. 临床神经外科杂志 2020(01)
    • [4].Prdx6在缺血缺氧状态下对肝细胞的保护作用及其机制[J]. 广东医学 2017(20)
    • [5].二仙汤及其拆方对肾阳虚证小鼠附睾P34H、Prdx6的影响[J]. 云南中医学院学报 2015(02)
    • [6].妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘ERp29、PRDX6表达及临床意义[J]. 中国妇幼保健 2019(04)
    • [7].脓毒症病人血清中Prdx1和Prdx6水平变化及临床意义[J]. 蚌埠医学院学报 2019(10)
    • [8].蚯蚓体内过氧化物还原蛋白PRDX基因对土壤PAHs污染胁迫的转录响应[J]. 环境科学 2013(03)
    • [9].PRDX6过表达增强肺癌细胞系A549的迁移和侵袭[J]. 基础医学与临床 2019(03)
    • [10].猪PRDX6基因编码区的多态性及遗传效应分析[J]. 遗传 2011(07)
    • [11].PRDX6与阿糖胞苷联合作用于HL-60细胞的体外实验研究[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志 2019(03)
    • [12].利用CRISPR/Cas9系统构建Prdx6基因敲除的RAW264.7细胞系[J]. 动物医学进展 2019(04)

    标签：;  ;  ;  ;  

    宿主Prdx6与生殖系统相关细胞内布鲁氏菌寄生关系的研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6