重复模块对重组蛛丝性能的影响

论文摘要

蛛丝作为一种性质非常优异的天然高分子材料一直备受世界各国学者的青睐。其不仅在生物医学工程具有巨大的应用潜能,而且也能在物理学相关领域发挥出色的作用。例如蛛丝纤维可以用作制造超级透镜。面对天然蜘蛛丝如此广泛的应用前景,研究人员没有停下探究蛛丝人工生产的方法的步伐。现在研究人员已经能够借助基因工程实现蛛丝的异源表达,这离不开分子生物学技术的进步。到目前为止,梨状腺丝（PySp）是七种蛛丝中被研究得最少的。原因是该天然丝产量极少,而且与其它丝蛋白混合在附着盘中。因此到目前为止,尚无天然梨状腺丝力学性能的报导。本实验室筛选出编码大腹园蛛梨状腺丝的一个重复区的DNA序列。利用分子生物学技术,获得重组梨状腺丝蛋白的编码序列,再通过湿纺的方法获得了三种不同的重组梨状腺丝。本实验室筛选到一条639bp的PySp1编码DNA,其编码的蛛丝蛋白有213个氨基残基,PySp的氨基酸序列包含于PXPXP和QQ两种特有的重复模块。以PySp1的DNA为模板,通过四种不同的引物PCR扩增出四种不同的PySp重复区段,借助无缝克隆技术将扩增得到的重复区段拼接起来。最后把所得到的编码重组PySp蛛丝蛋白的DNA片段插入到到改良的表达载体上。成功地获得了3种质粒,分别能够表达1到3个连续重复区的重组蛛丝蛋白。通过摸索诱导表达与纯化的条件,上述三种质粒均可以在E.coli BL21（DE3）中大量表达。通过分析得知上述三种蛋白均存在于包涵体中。通过变性纯化,以上三种蛋白的纯度可在90%以上。此三种重组蛛丝蛋白均不易溶于水而可溶于HFIP（六氟异丙醇）。目前存在多种纺丝途径,包括手工拉丝、静电纺丝技术与湿法纺丝技术。本实验采用湿纺装置连续拉伸收集到三种重组蛛丝纤维。三种丝纤维表面较为平坦,粗细均匀（≤20μm）。拉伸测试结果显示R、2R与3R分别具有不同的力学性能。其中R的性能达到了100.21MPa,超过了此前报道的类似分子量大小的重组蛛丝。然而其延展性较小。2R表现出了良好的抗张强度与延展性,分别为153.92MPa与68%。3R表现出极好的延展性,达到了132%。超越了目前现有的合成丝纤维。但其抗张强度较弱,为67MPa。显微红外测试结果分析显示三种丝纤维的二级结构α-helix、β-sheet、random coil与β-turn的含量没有明显差异,均超过了20%。这明显有别于以往报道过的重组丝蛋白。分析结果进一步表明此三种丝纤维的α-helix的比例在25%左右。天然产生的蛛丝纤维PySp中含有20%到30%的α-helix。就这一点而言,本实验构建的三种重组丝纤维在二级结构上与天然PySp纤维存在相似性。本课题首次获得了有关梨状腺丝的力学数据,为这些丝纤维的未来应用提供了理论依据。

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摘要

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第一章绪论

1.1 引言

1.2 蛛丝的微观结构

1.3 蛛丝腺体的结构与成丝机理

1.4 重组蛛丝的种类与研究进展

1.5 重组蛛丝的应用

1.6 静电纺丝

1.7 湿法纺丝

1.8 人工纺丝与重组蛛丝的局限性

1.9 本课题研究内容及意义

第2章实验材料与方法

2.1 基因、菌株与载体

2.2 DNA聚合酶与主要试剂

2.3 主要仪器与设备

2.4 主要试剂配制

2.5 基本实验技术

第3章实验步骤

3.1 克隆构建

3.2 蛋白表达

3.3 大规模蛋白纯化

3.4 蛋白溶液透析与冷冻干燥

3.5 湿纺

3.6 应力应变测试

3.7 显微红外测试

第四章结果分析

4.1 过渡质粒与表达质粒构建

4.2 重组蛛丝蛋白R、2R与3R的表达纯化

4.3 重组蛛丝蛋白的大规模纯化

4.4 透析与冷冻干燥

4.5 纺丝液制备

4.6 湿法纺丝制备重组蛛丝纤维

4.7 观察重组蛛丝纤维

4.8 重组蛛丝纤维的应力应变测试

4.9 显微红外测试单纤维二级结构

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 易拓

导师: 孟清

关键词: 梨状腺丝,重组蛛丝蛋白,湿纺,力学性能

来源: 东华大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工

单位: 东华大学

分类号: TQ340.1;Q78

DOI: 10.27012/d.cnki.gdhuu.2019.000610

总页数: 80

文件大小: 3883k

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