导读:本文包含了微小隐孢子虫论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:孢子,微小,肝素,受体,流行病学,犊牛,白细胞。
微小隐孢子虫论文文献综述
张宽宽[1]（2019）在《新疆部分地区新生犊牛微小隐孢子虫流行病学调查》一文中研究指出随着我国养牛业集约化养殖不断加快,犊牛腹泻防控已成为亟待解决的重要问题。微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是重要的人兽共患机会性致病原虫,是目前公认的引起犊牛腹泻的四种主要病原之一,在世界范围内流行广泛。牛被认为是导致人类人畜共患微小隐孢子虫病的主要宿主,且与许多人类介水隐孢子虫病的爆发有关,具有较大的人兽共患风险。本研究从奶牛业生产实际出发,对新疆部分地区新生犊牛微小隐孢子虫进行流行病学调查,掌握新生犊牛微小隐孢子虫的感染情况及流行特点,可为了解微小隐孢子虫在动物和人之间传播的潜在危害性、传播动态,以及为我国新疆奶牛源微小隐孢子虫流行病学研究及防治提供基础资料。(1)于2017年9月至2018年7月期间,采用饱和蔗糖溶液漂浮法、改良抗酸染色法、巢式PCR、PCR-RFLP分析和隐孢子虫SSU rRNA基因序列分析,对新疆乌什、阿拉尔、温宿、石河子、呼图壁、铁门关和奎屯7个地区12个集约化奶牛养殖场232头1月龄内新生犊牛粪便进行微小隐孢子虫感染情况调查。显微镜检查发现隐孢子虫直径4~6μm,具有蓝紫色的折光性,呈卵球形或椭圆形,具有1个大的残体和4个子孢子;经改良抗酸染色法染色后,隐孢子虫卵囊呈玫瑰红色,周边背景呈淡蓝色。基于SSU rRNA基因对12个奶牛场的232头1月龄内新生犊牛粪便DNA样品进行巢式PCR扩增,隐孢子虫总体感染率38.4%,微小隐孢子虫感染率为37.9%,研究发现腹泻和未腹泻犊牛之间微小隐孢子虫感染率在统计学上存在极显着差异(P<0.001)。基于SSU rRNA基因的RFLP分析和序列分析,共鉴定出3种隐孢子虫虫种:微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫,其中微小隐孢子虫是优势感染虫种,在研究区域新生犊牛中普遍存在,具有较大的人兽共患风险。(2)于2017年9月至2018月9月期间,对新疆南疆阿克苏地区两规模化牛场进行了1年的跟踪调查,采用方差齐性分析发现微小隐孢子虫感染率季节性差异不明显(P>0.05),十团牛场微小隐孢子虫感染无季节差异(P>0.05),五团牛场夏季和冬季微小隐孢子虫感染率存在差异(P=0.044)。(本文来源于《塔里木大学》期刊2019-06-01）
张天宇[2]（2019）在《微小隐孢子虫含整合素α结构域蛋白（CpITGA）黏附特性研究》一文中研究指出隐孢子虫属于水源性顶复门寄生虫,是一种重要的胞内寄生虫。目前硝唑尼特是FDA唯一批准的治疗隐孢子虫病的药物,但对免疫缺陷病人无效。因此,阐明微小隐孢子虫对宿主细胞黏附与入侵的机制对防控微小隐孢子虫至关重要。整合素是一种跨膜蛋白,可以促进细胞与细胞外基质(ECM)的黏附,激活信号传导途径,介导细胞信号(如细胞周期)的调节,细胞内骨架的组装,以及新受体向细胞膜的运动。目前,整合素样蛋白已经在很多寄生虫如疟原虫和弓形虫中发现,其通过与宿主细胞表面的硫化肝素分子相互作用介导虫体对宿主细胞的黏附。相关研究表明,肝素以及硫化肝素可以有效抑制微小隐孢子虫子孢子与宿主细胞的黏附。但目前对微小隐孢子虫的含整合素结构域蛋白的研究还没有报道。在本实验中,选取微小隐孢子虫含整合素α结构域的蛋白质为研究对象,对其进行亚细胞定位和相关黏附功能的研究。首先,利用生物信息学的方法对微小隐孢子虫的整合素样蛋白质(CpITGA)的序列进行分析。然后对CpITGA进行原核表达并纯化重组蛋白质。利用HIS标签重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,随后用Western blot对天然虫体蛋白进行验证,并检测多克隆抗体的特异性。通过间接免疫荧光的方法对CpITGA进行亚细胞定位。分别提取微小隐孢子虫卵囊、子孢子及虫体入侵细胞不同时期的总RNA,用荧光定量PCR的方法对CpITGA基因的转录水平进行分析。为了研究该蛋白是否在虫体入侵宿主细胞的过程中起到作用,利用GST标签重组蛋白质通过细胞ELISA、间接免疫荧光以及流式细胞术分析GST-CpITGA与宿主细胞的结合情况。通过重组GST-CpITGA蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制重组蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制重组蛋白与HCT-8细胞结合试验以及用肝素酶将HCT-8细胞表面硫化肝素移除后,重组蛋白质与宿主细胞的结合试验,验证硫化肝素作为GST-CpITGA结合HCT-8细胞的受体。最后,通过荧光定量PCR的方法评价抗CpITGA-HIS多克隆抗体阻断虫体入侵HCT-8细胞的效果。生物信息学分析表明,微小隐孢子虫整合素样蛋白(CpITGA)含有4个整合素样结构域,一个N端信号肽,一个C端跨膜区,一个短的胞质尾区以及3个糖胺聚糖结合基序。以Cp18S作为内参进行荧光定量PCR,结果表明CpITGA基因在虫体各个时期均有转录,在虫体入侵HCT-8细胞12 h时转录水平最高。Western blot结果表明抗CpITGA多克隆抗体能够特异性识别大小为120 kDa的虫体天然蛋白。间接免疫荧光实验表明CpITGA定位在微小隐孢子虫子孢子和裂殖子的表膜。根据整合素α结构域以及糖胺聚糖结合基序所在的位置原核表达并纯化出可溶性重组蛋白质GST-CpITGA,利用细胞ELISA,间接免疫荧光以及流式细胞术分析重组蛋白质与宿主细胞的结合情况,结果显示GST-CpITGA能够与宿主细胞结合,其结合呈剂量依赖性和可饱和性。进一步研究发现,GST-CpITGA能够与肝素磁珠结合,并且这种结合可以被肝素钠盐所抑制,而硫酸软骨素没有抑制效果,表明GST-CpITGA与肝素磁珠的结合是特异的,同时,肝素钠盐可以抑制重组蛋白与HCT-8细胞的结合,并且当用肝素酶移除宿主细胞表面的硫化肝素时,重组蛋白与宿主细胞的结合能力明显下降。最后,抗体体外抑虫结果表明,抗CpITGA抗体能够显着抑制微小隐孢子虫入侵宿主细胞,其抑制效果呈剂量依赖性,当抗体浓度为100μg/mL时,抑制率达到55%。综上所述,CpITGA通过与宿主细胞表面硫化肝素的结合参与了微小隐孢子虫的黏附过程,有望成为防治微小隐孢子虫病的靶标及疫苗候选抗原。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
王东强[3]（2019）在《微小隐孢子虫TSP7蛋白质通过硫化肝素介导子孢子对HCT-8细胞的黏附》一文中研究指出微小隐孢子虫是一种肠道寄生虫,属于顶复门原虫,是导致全球腹泻病的主要病原之一。对于隐孢子虫病,缺乏有效的治疗药物,部分原因是隐孢子虫与宿主细胞之间互作机制了解太少,为此,寻找微小隐孢子虫黏附及入侵宿主细胞的相关分子显得十分关键。研究发现,顶复门寄生虫在入侵宿主细胞时是一个连续的过程,其必要条件是寄生虫的多种分子(配体)与宿主细胞表面的分子(受体)结合,进而入侵宿主细胞。肝素类糖胺聚糖分子是一类重要的黏附受体,其能够显着抑制虫体对宿主细胞的黏附入侵。本研究中选取了与之前报道的TRAP蛋白家族里的TRAP-C1和TSP8结构相似微小隐孢子虫TSP7蛋白质作为研究对象,对其进行亚细胞定位和相关黏附功能研究。首先通过生物信息学分析,合成一段特异性好、免疫原性强的多肽序列“361QISQWTDWSTC371”,分别偶联至载体蛋白KLH和BSA上,分别用于免疫动物和ELISA检测,制备了抗TSP7单克隆抗体。通过间接免疫荧光的方法,利用单抗对TSP7蛋白质进行亚细胞定位。通过Western blot的方法,对子孢子中的TSP7天然蛋白质进行鉴定。通过荧光定量PCR的方法,分别提取微小隐孢子虫卵囊、子孢子及细胞内不同时期的总RNA,对TSP7基因的转录水平进行分析。为了进一步研究TSP7的相关黏附功能,利用原核表达系统表达重组蛋白质TSP7-GST,通过Western blot、间接免疫荧光、流式细胞术叁种试验方法分析TSP7-GST与HCT-8细胞的黏附情况。通过重组TSP7-GST蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制该重组蛋白质与肝素磁珠结合试验及肝素钠盐抑制重组蛋白与HCT-8的结合试验,验证硫化肝素作为该重组蛋白结合HCT-8的主要受体。最后,通过荧光定量PCR的方法评价抗TSP7单抗阻断虫体入侵HCT-8的效果。生物信息学分析结果表明TSP7蛋白质N端为信号肽,C端为跨膜区,含有3个TSP1结构域,1个EGF样结构域,4个肝素结合基序。间接免疫荧光实验结果表明TSP7蛋白质位于微小隐孢子虫子孢子与裂殖子表膜,且能够与微小隐孢子虫已知膜蛋白Gp15共定位。Western blot结果表明anti-TSP7单抗能够特异性识别大小为125 KDa的虫体天然蛋白。以虫体Cp18S为内参,进行荧光定量PCR,结果表明TSP7基因在各时期均有转录,在虫体入侵HCT-8细胞12 h时转录水平达到最高。通过原核表达系统表达并纯化出可溶性重组蛋白质TSP7-GST,利用流式细胞术、间接免疫荧光、细胞ELISA分析该重组蛋白质与HCT-8的结合情况,结果表明与对照组(标签蛋白质GST)相比,TSP7-GST能够与HCT-8结合,结合曲线呈剂量依赖性和可饱和性。进一步研究发现,TSP7-GST能够与肝素磁珠结合,且这种结合受到肝素钠盐的竞争性抑制,表明这种结合是特异性的,而且不同浓度肝素钠盐能够抑制TSP7-GST与HCT-8细胞的结合。最后,单抗阻断结果表明,单抗能够显着阻断虫体入侵HCT-8细胞,并呈现剂量依赖性,当抗体浓度达到100μg/m L时,抑制率达到48%。综上,TSP7蛋白质在虫体与宿主细胞的互作方面扮演重要角色,可通过结合HCT-8表面的硫化肝素介导虫体的黏附和感染,有望成为防治隐孢子虫病的一个潜在的药物靶标及疫苗候选抗原。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
刘婷丽[4]（2019）在《微小隐孢子虫感染HCT-8细胞的lncRNAs筛选及其对隐孢子虫增殖的影响》一文中研究指出微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种重要的人兽共患肠道原虫,是造成免疫功能缺陷的人和畜禽严重腹泻甚至死亡的重要病因之一。然而,目前尚无有效的药物和疫苗用于防控隐孢子虫的感染。研究发现,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通过调节宿主基因的表达在多种癌症、寄生虫病、病毒病和细菌病中发挥重要作用。但是,lncRNA在隐孢子虫感染中的作用尚不明确。基于此,本研究利用lncRNA表达谱芯片鉴定了C.parvum感染的HCT-8细胞的lncRNA和mRNA表达谱,并利用干扰和过表达技术探讨了显着下调表达的lncRNA BACE1-AS对C.parvum增殖的影响。1.获得了C.parvum感染HCT-8细胞的mRNA表达谱:C.parvum感染24 h的HCT-8细胞共检测到20663个mRNA的表达,其中1349个mRNA差异表达(倍数>1.2,P<0.05),包括535个上调表达和814个下调表达的mRNA;随机选择10个显着差异表达的mRNA(5个上调和5个下调)进行qRT-PCR验证,发现其结果与芯片结果趋势一致;功能预测发现,这些差异表达的mRNA主要富集于与隐孢子虫感染相关的通路,如Wnt信号通路、紧密连接和hedgehog信号通路等。2.获得了C.parvum感染HCT-8细胞的lncRNA表达谱:C.parvum感染24 h的HCT-8细胞共检测到16203个lncRNA的表达,其中821个lncRNA(倍数>1.2,P<0.05)显着差异表达,包括557个上调表达和264个下调表达的lncRNA;对其进行类型分析发现,这些差异表达的lncRNA隶属于5种类型,包括22个正义lncRNA、280个反义lncRNA、44个双向lncRNA、33个内含子lncRNA和312个基因间lncRNA;随机选择11个显着差异表达的lncRNA(5个上调和6个下调)进行qRT-PCR验证,发现其结果与芯片结果一致;共表达和靶基因分析发现,29个lncRNA顺式调节27个mRNA,114个lncRNA反式调节109个mRNA;功能预测发现,差异表达lncRNA的靶基因主要参与hedgehog信号通路、紧密连接和Wnt信号通路等。3.初步阐明了lncRNA BACE1-AS对C.parvum增殖的影响:C.parvum感染引起了lncRNA BACE1-AS的显着下调,并且其表达在不同感染剂量(虫体:细胞=1.125:1、2.25:1、4.5:1)及不同感染时间(8 h、12 h、24 h和48 h)均显着低于未感染对照组;在HCT-8细胞中过表达BACE1-AS 24 h后感染C.parvum发现,细胞中隐孢子虫HSP70基因的表达显着低于空载体(pcDNA3.1)转染对照组;在利用siRNA(siBACE1-AS)干扰BACE1-AS表达的HCT-8细胞感染C.parvum发现,隐孢子虫HSP70基因的表达显着高于转染无关siRNA(si-NC)组。综上所述,C.parvum感染引起了HCT-8细胞lncRNA和mRNA表达谱的改变,显着下调的lncRNA BACE1-AS可以抑制C.parvum在HCT-8细胞中的增殖。这些研究结果初步揭示了宿主lncRNA在隐孢子虫感染中的作用,为开发防控隐孢子虫病的疫苗和药物提供了基础数据。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-04-01）
王东强,张天宇,焦新,高鑫,王洪法[5]（2019）在《微小隐孢子虫Ⅰ型跨膜蛋白Cgd7_1430的亚细胞定位及其HCT-8细胞黏附特性研究》一文中研究指出目的对微小隐孢子虫Ⅰ型跨膜蛋白Cgd7_1430进行亚细胞定位,研究其对HCT-8细胞的黏附特性及肝素结合特性,为深入研究微小隐孢子虫的侵入机制提供依据。方法对Cgd7_1430序列进行生物信息学分析,合成特异性多肽并制备抗多肽抗体,通过间接免疫荧光对该蛋白质在子孢子进行亚细胞定位;通过PCR扩增Cgd7_1430全长基因并克隆至PGEX-4T-1载体,用大肠埃希菌BL21(DE3)菌株表达重组蛋白;通过细胞亲和ELISA和流式细胞术确定重组蛋白与HCT-8细胞的黏附特性;通过Pull-down确定重组蛋白的肝素结合特性。结果成功获得抗Cgd7_1430多肽抗体及其重组蛋白质,间接免疫荧光表明该蛋白定位于子孢子表膜,ELISA、流式细胞术表明该重组蛋白能够与HCT-8细胞结合,并呈现剂量依赖性和可饱和性,Pull-down实验表明重组蛋白能够与肝素结合。结论 Cgd7_1430蛋白质是一种子孢子表膜蛋白,能够与HCT-8细胞特异性结合,该蛋白为肝素结合蛋白,可能与宿主细胞表面的硫化肝素受体结合介导虫体的侵入过程。本研究为深入研究隐孢子虫的侵入机制提供依据。(本文来源于《中国病原生物学杂志》期刊2019年03期）
郭志云,荆春霞,黄小英,杨光[6]（2018）在《微小隐孢子虫CyPs家族蛋白的生物信息学分析》一文中研究指出目的探讨微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)Iowa Ⅱ株亲环素(CyPs)家族蛋白与微小隐孢子虫感染、致病、生存及与宿主免疫调控之间的关系。方法利用生物信息学工具,获取微小隐孢子虫Iowa Ⅱ株Cy Ps家族蛋白的序列信息,然后进行结构域预测、重要氨基酸位点的分析、motif搜索、蛋白的理化性质分析、信号肽预测和跨膜区预测,最后对不同物种的CyPs进行多重比对与进化树分析,并结合Blast-P同源比对和文献分析结果进行C.parvum Iowa Ⅱ株CyPs家族蛋白的功能预测。结果搜索到了C.parvum基因组中7个含有cyclophilin superfamily典型结构域的CyPs编码基因,分别是cgd1_870、cgd2_1660、cgd2_4120、cgd5_3350、cgd7_520、cgd8_1560和cgd8_2350。通过功能预测发现,cgd1_870的N端含有信号肽,是一个典型的分泌型肽酰脯氨酸顺反异构酶(PPIase),很有可能是隐孢子虫和宿主相互作用的重要分子基础;cgd2_1660属于Cyclophilin_PPIL3_like亚家族,缺乏环孢菌素A(CsA)结合需要的关键氨基酸残基,无法结合CsA发挥免疫抑制作用;cgd2_4120属于cyclophilin_ABH_like亚家族,且含有CsA_PPIase_1 motif,在隐孢子虫细胞内可以作为CsA的胞内受体发挥着对隐孢子虫的免疫抑制作用;cgd7_520不仅具有CyPs家族的典型功能而且还具有WD40家族蛋白的相关功能,可能在隐孢子虫的生存过程中发挥着重要的作用;cgd8_2350还含有一个RRM结构域,不仅具备亲环素家族典型的PPIase活性,并且能够结合核酸参与基因表达过程的各种RNA加工过程,是一个对基因转录后水平有重要影响的蛋白。结论隐孢子虫基因组中存在7种CyPs的编码基因,其特征与功能均存在异同,其中cgd1_870具有分泌型的信号肽,是一个分泌性蛋白。(本文来源于《热带医学杂志》期刊2018年10期）
陈苗,李慧,唐莉,阚珍珍,李文超[7]（2018）在《微小隐孢子虫分子流行病学》一文中研究指出隐孢子虫是最重要的人畜共患原生动物寄生虫,其引起的人畜共患寄生虫病是导致人类和动物腹泻的主要原因之一,大多数为急性暂时性腹泻,但是,持续感染可能导致慢性病,进而威胁生命,尤其是对营养不良或免疫缺陷的人更为严重。然而,目前尚没有特效药物治疗。随着分子生物学的进展,PCR技术被广泛的用于隐孢子虫的检测,其特异性与灵敏性都比传统的方法较高,改善了传统方法的不足,为临床应用提供重要的参考价值。本文主要对微小隐孢子虫的基因型、基因亚型及诊断检测和预防治疗方面进行综述。(本文来源于《畜牧兽医科技信息》期刊2018年09期）
刘立元,王建永,白云,康茜,任志军[8]（2018）在《保定地区奶牛微小隐孢子虫Cp23基因的原核表达及免疫原性分析》一文中研究指出采用PCR技术扩增了微小隐孢子虫Cp23基因,将Cp23基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达载体pET28a-Cp23。将其转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE结果表明,蛋白相对分子质量为25 000,目的蛋白高效表达,且为包涵体蛋白。Western blot结果表明,表达产物可被微小隐孢子虫阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。本研究为抗微小隐孢子虫疫苗和免疫学诊断方法的研制提供候选抗原。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2018年09期）
汲蕊,梁瑞文,管志玉,李瑞芳,付玉荣[9]（2018）在《氧化苦参碱对微小隐孢子虫感染小鼠肠黏膜Toll样受体的影响》一文中研究指出目的研究氧化苦参碱(OMT)对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染小鼠肠黏膜Toll样受体2 (TLR2)和TLR4的调节作用,探讨OMT治疗隐孢子虫病的分子机制。方法30只雄性健康BALB/c小鼠随机分为感染组、感染后OMT治疗组(简称OMT治疗组)和未感染组,每组10只。感染组和OMT治疗组小鼠经口灌胃微小隐孢子虫卵囊(1×10~5个/只),建立微小隐孢子虫肠道感染小鼠模型,未感染组小鼠正常饮食、饮水。OMT治疗组小鼠建模成功后经口灌胃OMT (50 mg/kg),每日1次,连续2周。采用金胺酚-改良抗酸染色法镜检计数小鼠克粪便卵囊数。治疗2周后剖杀各组小鼠, HE染色镜下观察小鼠肠黏膜的病理改变,测量肠绒毛高度、隐窝深度。抽提小鼠肠黏膜组织总RNA,逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测TLR2和TLR4的mRNA相对表达量。蛋白质印迹(Western blotting)检测小鼠肠黏膜组织中TLR2和TLR4的相对表达量。结果金胺酚-改良抗酸染色镜检结果显示,感染组小鼠克粪便卵囊数自建模成功后逐渐增加,至第7天达到最高,为(179.24±21.12)个/克,感染强度为4级,然后趋于平衡。OMT治疗组小鼠克粪便卵囊数在治疗第5天开始下降,治疗2周后,感染强度趋近于0级。HE染色镜下观察结果显示,感染组小鼠肠绒毛明显萎缩变短、脱落,黏膜下层结构严重水肿,与肌层间形成明显的间隙; OMT治疗组小鼠肠绒毛基本修复,结构趋于完整,排列趋于整齐;未感染组小鼠肠绒毛结构完整。OMT治疗组小鼠肠绒毛高度为(346.1±19.2)μm,高于感染组[(278.0±52.9)μm](P <0.01),与未感染组[(348.1±18.2)μm]差异无统计学意义(P> 0.05);隐窝深度为(155.4±5.3)μm,低于感染组[(173.1±11.1)μm](P <0.05),与未感染组[(149.9±27.4)μm]差异无统计学意义(P> 0.05);绒毛高度/隐窝深度为2.2±0.2,高于感染组(1.6±0.3)(P <0.01),与未感染组(2.4±0.6)差异无统计学意义(P> 0.05)。qRT-PCR结果显示, OMT治疗组小鼠肠黏膜组织中TLR2 mRNA的相对表达量为1.4±0.3,低于感染组(3.0±0.1)(P <0.01),与未感染组(1.0±0.0)差异无统计学意义(P> 0.05); TLR4 mRNA的相对表达量为1.5±0.1,低于感染组(3.1±0.3)(P <0.01),与未感染组(1.0±0.0)差异无统计学意义(P> 0.05)。Western blotting检测结果显示, OMT治疗组小鼠肠黏膜组织中TLR2的相对表达量为0.2±0.0,低于感染组(0.6±0.1)(P <0.01),与未感染组(0.2±0.1)差异无统计学意义(P>0.05); TLR4的相对表达量为0.3±0.1,低于感染组(0.6±0.0)(P <0.01),与未感染组(0.2±0.1)差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 OMT可通过下调微小隐孢子虫感染小鼠肠黏膜组织中TLR2和TLR4的表达,可促进小鼠受损肠黏膜的修复。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2018年05期）
汲蕊,梁瑞文,管志玉,李瑞芳,付玉荣[10]（2018）在《TLR4/NF-κB信号通路在微小隐孢子虫感染中的作用机制》一文中研究指出目的探讨Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信号通路在微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染小鼠致肠黏膜损伤中作用的分子机制。方法 30只4周龄雄性BALB/c小鼠随机分成感染1周组、感染2周组和未感染组,每组10只。感染组每鼠经口灌胃微小隐孢子虫卵囊(1×10~5个/只),未感染组小鼠正常饮食、饮水。感染组小鼠分别于感染后第1周和第2周剖杀,未感染组小鼠于第2周剖杀。取小鼠肠组织,HE染色观察小鼠肠黏膜的病理变化。抽提肠黏膜组织总RNA,逆转录成c DNA,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测TLR4和NF-κB p65的m RNA相对表达量。蛋白质印迹(Western blotting)检测肠黏膜组织中TLR4和NF-κB p65的相对表达量。ELISA检测肠黏膜组织中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平。结果HE染色结果显示,感染组小鼠肠绒毛明显萎缩变短、脱落,黏膜下层水肿,与肌层间形成明显的间隙;未感染组小鼠肠绒毛结构完整。q RT-PCR结果显示,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜组织中TLR4的m RNA相对表达量分别为2.3±0.4、3.5±0.1,均高于未感染组(1.0±0.0)(P<0.05,P<0.01);NF-κB p65的m RNA相对表达量分别为2.6±0.3、3.6±0.2,均高于未感染组(1.1±0.1)(P<0.05,P<0.01)。Western blotting结果显示,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜组织中TLR4的相对表达量分别为0.4±0.0、0.6±0.0,均高于未感染组(0.2±0.0)(P<0.05,P<0.01);NF-κB p65的表达量分别为0.6±0.0、0.8±0.1,均高于未感染组(0.4±0.0)(P<0.05,P<0.01)。ELISA检测结果显示,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜组织中IL-1β的表达量分别为33.3±2.2、46.1±2.5,均高于未感染组(22.3±5.0)(P<0.01);TNF-α的表达量分别为45.7±2.0、55.4±3.6,均高于未感染组(25.7±9.3)差异有统计学意义(P<0.01)。结论微小隐孢子虫感染小鼠后,通过激活TLR4/NF-κB信号通路,可上调TLR4和NF-κB p65的表达,促进IL-1β和TNF-α的释放,诱发肠黏膜炎症反应。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2018年04期）
微小隐孢子虫论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
隐孢子虫属于水源性顶复门寄生虫,是一种重要的胞内寄生虫。目前硝唑尼特是FDA唯一批准的治疗隐孢子虫病的药物,但对免疫缺陷病人无效。因此,阐明微小隐孢子虫对宿主细胞黏附与入侵的机制对防控微小隐孢子虫至关重要。整合素是一种跨膜蛋白,可以促进细胞与细胞外基质(ECM)的黏附,激活信号传导途径,介导细胞信号(如细胞周期)的调节,细胞内骨架的组装,以及新受体向细胞膜的运动。目前,整合素样蛋白已经在很多寄生虫如疟原虫和弓形虫中发现,其通过与宿主细胞表面的硫化肝素分子相互作用介导虫体对宿主细胞的黏附。相关研究表明,肝素以及硫化肝素可以有效抑制微小隐孢子虫子孢子与宿主细胞的黏附。但目前对微小隐孢子虫的含整合素结构域蛋白的研究还没有报道。在本实验中,选取微小隐孢子虫含整合素α结构域的蛋白质为研究对象,对其进行亚细胞定位和相关黏附功能的研究。首先,利用生物信息学的方法对微小隐孢子虫的整合素样蛋白质(CpITGA)的序列进行分析。然后对CpITGA进行原核表达并纯化重组蛋白质。利用HIS标签重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,随后用Western blot对天然虫体蛋白进行验证,并检测多克隆抗体的特异性。通过间接免疫荧光的方法对CpITGA进行亚细胞定位。分别提取微小隐孢子虫卵囊、子孢子及虫体入侵细胞不同时期的总RNA,用荧光定量PCR的方法对CpITGA基因的转录水平进行分析。为了研究该蛋白是否在虫体入侵宿主细胞的过程中起到作用,利用GST标签重组蛋白质通过细胞ELISA、间接免疫荧光以及流式细胞术分析GST-CpITGA与宿主细胞的结合情况。通过重组GST-CpITGA蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制重组蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制重组蛋白与HCT-8细胞结合试验以及用肝素酶将HCT-8细胞表面硫化肝素移除后,重组蛋白质与宿主细胞的结合试验,验证硫化肝素作为GST-CpITGA结合HCT-8细胞的受体。最后,通过荧光定量PCR的方法评价抗CpITGA-HIS多克隆抗体阻断虫体入侵HCT-8细胞的效果。生物信息学分析表明,微小隐孢子虫整合素样蛋白(CpITGA)含有4个整合素样结构域,一个N端信号肽,一个C端跨膜区,一个短的胞质尾区以及3个糖胺聚糖结合基序。以Cp18S作为内参进行荧光定量PCR,结果表明CpITGA基因在虫体各个时期均有转录,在虫体入侵HCT-8细胞12 h时转录水平最高。Western blot结果表明抗CpITGA多克隆抗体能够特异性识别大小为120 kDa的虫体天然蛋白。间接免疫荧光实验表明CpITGA定位在微小隐孢子虫子孢子和裂殖子的表膜。根据整合素α结构域以及糖胺聚糖结合基序所在的位置原核表达并纯化出可溶性重组蛋白质GST-CpITGA,利用细胞ELISA,间接免疫荧光以及流式细胞术分析重组蛋白质与宿主细胞的结合情况,结果显示GST-CpITGA能够与宿主细胞结合,其结合呈剂量依赖性和可饱和性。进一步研究发现,GST-CpITGA能够与肝素磁珠结合,并且这种结合可以被肝素钠盐所抑制,而硫酸软骨素没有抑制效果,表明GST-CpITGA与肝素磁珠的结合是特异的,同时,肝素钠盐可以抑制重组蛋白与HCT-8细胞的结合,并且当用肝素酶移除宿主细胞表面的硫化肝素时,重组蛋白与宿主细胞的结合能力明显下降。最后,抗体体外抑虫结果表明,抗CpITGA抗体能够显着抑制微小隐孢子虫入侵宿主细胞,其抑制效果呈剂量依赖性,当抗体浓度为100μg/mL时,抑制率达到55%。综上所述,CpITGA通过与宿主细胞表面硫化肝素的结合参与了微小隐孢子虫的黏附过程,有望成为防治微小隐孢子虫病的靶标及疫苗候选抗原。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
微小隐孢子虫论文参考文献
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