戴晓燕[1]2003年在《玉米中类似于mRNA的非编码基因ZM401 cDNA的克隆及其在玉米花粉发育中的作用》文中提出随着人类及拟南芥基因组全序列的完成，对许多新的编码蛋白基因以及tRNA，rRNA，snRNAs基因的结构及功能给出了注释。但是真核生物基因组中只有一小部分为蛋白编码序列，而绝大部分则是不具有编码蛋白能力的非编码序列。对于大部分的非编码序列，其功能及其在基因组中存在的意义知之甚少。近年来科学家发现一类类似于mRNA，有mRNA的基本特征，但缺乏明显开放阅读框架的基因，它们主要以RNA分子的形式参与许多基本的生命活动，如胚胎发育，染色体失活，转录调控，生长发育及对胁迫的应答。 本研究小组通过差异筛选法，并结合冷噬菌斑筛选，从玉米成熟花粉cDNA文库中克隆到一个玉米花粉特异表达的非编码基因cDNA片段ZM401(663bp)。Northern杂交表明ZM401是一个玉米花粉特异表达的基因。本文采用5’RACE，3’RACE技术及重迭PCR获得了ZM401cDNA的全长(1149bp)。采用生物学软件对ZM401cDNA的全长序列和结构进行分析，该基因缺乏明显的开放阅读框架，序列中最长的可能的开放阅读框架仅编码89个氨基酸，具有poly(A)尾部结构，软件分析表明RNA分子具有稳定的二级结构，符合非编码RNA基因的特点，属于类似于mRNA的非编码基因这一类。RT-PCR分析表明ZM401基因从玉米花粉发育的四分体时期，单核期，双核期，成熟花粉均有表达，Northern Blot杂交结果表明ZM401从四分体时期，单核期，双核期，成熟花粉表达量依次增强，证明ZM401属于玉米花粉发育晚期基因。同时，Northern杂交显示ZM401基因在玉米花粉发育中以两种转录本形式存在。Southern杂交表明ZM401基因在玉米基因组中可能以单拷贝或低拷贝形式存在。 本文将四种分别在35S启动子或ZM13启动子驱动下的正向与反向植物表达载体通过基因枪法导入玉米胚性愈伤，经分子检测共得到27株Southern阳性转基因玉米，其中13株为转入正向表达载体的转基因玉米，14株为转入反向表达载体的转基因玉米。通过对转基因玉米花药形态的观察及花粉活力的测定，表明ZM401以正向方式整合的转基因玉米花药出现退化或皱缩现象，花粉经I_2-KI染色后，明显可见淀粉积累减少，花粉形态异常且大小不一。染黑率在1.2％-18.2％之间。转入反向表达载体的转基因玉米花药未见异常现象，花粉经I_2-KI染色后，花粉形态正常，黑染率在60％以上。通过对转正向表达载体转基因玉米花药的显微结构进行观察，表明由于ZM401的插入，导致出现以下异常现象，a)花粉发育不同步，b)花粉囊发育不同步，c)绒毡层与非转基因玉米相比出现退化延迟现象，d)花粉形态异常。通过对R1代转基因玉米的分子检测表明，ZM401能够稳定遗传，而且能够正常转录。在R1代转基因玉米中，同样可见由于ZM401的表达引起花药退化现象，花粉黑染率较低。结合对ZM401转录情况的分析，表明转基因玉米雄花产生退化，花药产生缺失，花粉形态异常及花粉育性的降低是由于外源ZM401基因的插入及正确转录的结果。从而证明ZM401基因在小孢子发育中具有重要的作用。
马金霞[2]2005年在《非编码基因zm401对玉米小孢子发育的影响》文中研究表明高等植物雄性生殖过程发生在雄蕊内。花粉作为雄配子体,包含了与雌配子体结合完成受精过程所需要的全部遗传信息,在植物的整个生殖周期中发挥着重要作用。发育过程中发生的一系列事件是有时空顺序性的,而且特化细胞类型及其功能的建立及保持需要特定的几组基因的转录活化。植物雄蕊中花药内雄配子体发育的起始与成熟是由一系列基因所控制,在花粉母细胞减数分裂和形成小孢子期与后期形成雄配子过程中均有一系列基因调节。正是由于花粉的这一重要作用,使其成为生物化学和分子生物学领域研究基本规律性问题的首选对象。利用分子生物学手段对植物花粉发育过程中特异表达的基因的功能进行研究,对于我们从分子水平了解植物花粉的发育过程具有重要的意义。 本研究小组通过差异筛选法,并结合冷噬菌斑筛选,从玉米成熟花粉cDNA文库中克隆到一个玉米花粉特异表达的cDNA,采用5’RACE,3’RACE技术及重迭PCR获得了zm401cDNA的全长(1149bp)。Northern杂交表明zm401是一个玉米花粉特异表达的基因。采用生物学软件对zm401cDNA的全长序列和结构进行分析,发现zm401符合非编码RNA基因的特点,属于类似于mRNA的非编码基因这一类。为了进一步验证全长zm401能否编码小肽,本文对其全长cDNA进行了体外翻译。虽然没有翻译出小肽,但是还不能肯定地说全长zm401不编码。全长zm401究竟是以RNA还是小肽的形式起作用,还在进一步的研究中。 本文将全长zm401的抑制表达载体和ZM13启动子驱动下的超表达载体通过基因枪法导入玉米愈伤,经分子检测共得到16株Southern阳性转基因玉米,其中10株为转入抑制表达表达载体的转基因玉米,6株为转入超表达载体的转基因玉米。通过对转基因玉米雄穗表型变化进行分析发现,插入抑制表达载体的转基因玉米的雄穗外稃不张开,花粉不能散出;转超表达载体转基因玉米,雄穗顶端的小穗发育不良,不能长成正常大小,干瘪、枯死。对转基因玉米花药的组织切片显微结构进行观察,发现转抑制表达载体和ZM13启动子驱动的转超表达载体的转基因玉米小孢子空瘪、变形,无内容物,绒毡层与非转基因玉米相比出现退化延迟现象,花粉形态异常。通过对转基因玉米花药形态的观察及花粉活力的测定,表明全长zm401的转基因玉米花药出现退化或皱缩现象,花粉经I_2-KI染色后,明显可见淀粉积累减少,花粉形态异常且大小不一。在T1代转基因玉米中,同样可见花药退化或皱缩现象,花粉黑染率较低。从而证明全长zm401基因在小孢子和花药壁发育中具有重要的作用。为了进一步研究全长zm401的功能,我们将其全长cDNA转入烟草。全长zm401在烟草中异位表达时转基因烟草也表现出发育延迟,绒毡层退化延迟,小孢子减数分裂不同步的现象,表明全长zm401的确在小孢子和绒毡层发育中有重要作用。
宋江华[3]2007年在《白菜花粉发育相关基因BcMF11和BcMF12的克隆、表达及其功能验证》文中进行了进一步梳理芸薹属(Brassica)作物分布地区广，品种资源丰富，也是杂种优势利用最为普遍的一类作物，发掘和创建其雄性不育系，用于配制一代杂种，在生产实践中具有重要意义。花粉发育相关基因的分离及其功能分析，为深入探索白菜类等芸薹属作物花粉发育的分子机制提供了实验依据，同时有助于通过反义技术等阻断与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育植株。本研究以白菜(Brassica campestris L．ssp．chinensis Markino，syn．B．rapa ssp．chinensis)花粉转录组的分析中发现的两个基因BcMF11(Brassica campestris male fertility gene 11)和BcMF12(Brassica campestris male fertility gene 12)作为研究对象，采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术扩增分离基因全长，分析其序列特征并预测其蛋白质结构和功能，进而采用Northern杂交和RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)技术分析它们在白菜不同发育阶段的营养组织与生殖组织中的表达状况，然后依据反义遗传学原理，构建组成型启动子CaMV35S(Cauliflower mosaic virus 35S)和白菜绒毡层组织特异型启动子BcA9(Brassica campestris A9)驱动的反义BcMF11和反义BcMF12基因表达载体，通过遗传转化获得转基因植株，从分子、形态和细胞学等方面对转基因植株进行全面检测和分析，明确它们与白菜花粉发育的关系，为全面认识花粉发育的系统性调控，揭示芸薹属作物雄性不育的分子机理奠定基础。研究结果表明：(1)利用RACE技术从白菜野生型可育株中成功克隆到花粉特异的BcMF11(DQ925484)。该基因cDNA序列全长828 bp，多处出现终止密码子，缺乏明显的开放阅读框，但包含poly(A)尾部结构。碱基组成分析发现整个序列中A／T含量较高，达到58.7％。预测的RNA分子二级结构自由能非常低，只有-203.26 kcal·mol~(-1)。BLAST搜索未发现与其相似的基因。推测BcMF11是白菜中首次发现的一个新的类似于mRNA的非编码RNA基因。该基因的上游序列区存在几个与花粉发育密切相关的顺式作用调控元件，预示BcMF11可能与花粉发育相关。Northern杂交与RT-PCR分析表明BcMF11在白菜的花蕾、开放的花及花药中特异表达，同时其转录本表达量随着花粉的发育保持缓慢增加，这说明BcMF11属于在花粉发育过程中持续表达的花粉特异基因。(2)根据白菜非编码RNA基因BcMF11的全长序列设计引物，在芸薹属植物的10个物种中PCR扩增得到BcMF11的同源序列。序列特征分析发现，这些BcMF11同源基因具有非编码RNA的共同特征，说明该非编码RNA基因在芸薹属植物进化过程中核苷酸序列较保守。在序列同源比对的基础上，基于Kimura双参数(2-parameter)距离，构建BcMF11同源基因在芸薹属植物10个物种的NJ(Neighbor-joining)系统树。结果表明，‘黄芽14’南方大白菜与‘油青’菜心聚为一类，与北方大白菜‘小青口’处于不同的分支，推测它与北方大白菜有不同的演化过程；而北方大白菜‘小青口’和‘温州盘菜’芜菁以极高的支持值聚为一类(BCL值为99％)，成为它们亲缘关系很近的证据之一。(3)通过RACE方法从白菜花粉特异cDNA片段BBP1克隆到其全长基在BcMF12(DQ925483)。序列特征分析表明，该基因全长1155 bp，最大开放阅读框894 bp，编码297个氨基酸。对BcMF12编码的蛋白质二级结构预测表明它包含60.61％的螺旋和35.69％的环状结构。跨膜区及疏水结构分析表明该蛋白含有6个保守的疏水跨膜区，经BLAST查询发现它与植物中已报道的几个跨膜蛋白具有较高的相似性，因此BcMF12可能是白菜中一个新的跨膜蛋白。Northern杂交与RT-PCR分析表明BcMF12主要在白菜野生型可育株的中大蕾和大蕾中表达，属于花粉中特异表达的“晚”基因。(4)在正确分离反义BcMF11和反义BcMF12片段的基础上，分别构建了含有组成型启动子CaMV35S和花药绒毡层组织特异型启动子BcA9的反义RNA植物表达载体pBI35S-BcMF11、pBI35S-BcMF12、pBIBcA9-BcMF11和pBIBcA9-BcMF12，并通过“冻融法”将其导入农杆菌，根据已建立的高效白菜类作物遗传转化体系，利用农杆菌介导的方法将反义BcMF11和反义BcMF12表达载体导入菜心(B．campestrtis ssp．chinensis var．parachinensis Tsen et Lee)中，成功获得了61个Kan~R(kanamycin-resistant)转基因菜心芽系及305株菜心抗性植株。(5)对PCR筛选出的反义BcMF11和反义BcMF12转基因菜心阳性植株进行Southern和Northern印迹杂交检测，从整合及转录水平证明反义基因片段已成功转入菜心中，并有效抑制了转基因植株中内源基因的表达。X-Gluc组织化学染色结果也说明反义BcMF11和反义BcMF12片段在转基因菜心植株中进行了转录和表达。(6)对BcMF11反义基因菜心转化植株花器官的形态学观察发现其花丝短小，花药不饱满，而且部分花药颜色褐化，花粉数量极少，甚至无粉。花粉形态扫描电镜观察表明pBI35S-BcMF11和pBIBcA9-BcMF11菜心转基因株大部分花粉表现畸形，畸形率分别为88.59％和91.26％，极显着高于非转基因对照植株花粉的畸形率。采用组织化学方法对花粉发育及其形态的细胞学观察显示，转基因植株在花粉发育后期表现为花药瘪缩变形，花粉囊萎缩，花粉内含物消失，绒毡层细胞退化，花粉表现败育。花粉离体萌发试验结果显示，反义pBI35S-BcMF11和反义pBIBcA9-BcMF11转基因植株的花粉萌发率分别是31.35％和37.24％，均显着低于对照植株花粉的萌发率。由此推测，BcMF11沉默将使花粉形态和内部结构发生明显异常，最终导致花粉败育。(7)对反义BcMF12转基因菜心花器官的形态学观察发现其花药不饱满，颜色发白，花粉数量少。电镜扫描结果表明，反义pBIBcA9-BcMF12和反义pBI35S-BcMF12菜心转基因植株的花粉畸形率相差较大，分别为89.57％和23.42％；相应地，其花粉萌发率分别为38.26％和78.91％，说明BcA9启动子对反义BcMF12在花粉中表达的调控活性较之CaMV35S启动子的调控强。花粉体内萌发试验进一步表明反义BcMF12转基因植株的花粉和柱头的粘附过程不能正常进行，花粉管伸长速度减慢。因此推测BcMF12作为白菜花粉发育晚期特异表达的基因，在花粉萌发和花粉管的伸长过程中发挥重要作用。
王贺[4]2017年在《玉米胞质类受体蛋白激酶基因ZmSTK2_USP的功能研究》文中进行了进一步梳理花粉发育与花粉管伸长是玉米有性生殖过程中的重要事件,直接影响到玉米产量的高低和质量的好坏。花粉发育与花粉管伸长过程的分子机制极其复杂,除包括一系列器官分化和一系列严格控制的细胞生理生化变化外,还涉及大批基因的表达与调控。本研究发现一种新型的花粉发育相关胞质类受体蛋白激酶基因ZmSTK2_USP,具有调控玉米花粉的发育和花粉管伸长的生物学功能。研究取得的主要内容如下:(1)生物信息学分析表明,玉米ZmSTK2_USP基因的编码蛋白N-末端具有普通胁迫蛋白A(UspA)受体结构域,C-末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)结构域;属于RLCK-IⅨb 亚家族。其启动子(proZmSTK2_USP)除含有 TATA-box、CAAT-box、G-box和GATA-box启动子典型元件外,还具有花粉特异性启动子元件GTGA和AGAAA。(2)花粉活力研究表明,突变体zmstk2_usp的花粉生活力下降43.30%,萌发率下降45.08%,以致单穗结实率下降约60.00%,且差异均达到极显着水平。(3)本研究成功克隆到ZmSTK2_USP基因,Northern blot检测分析表明,ZmSTK2_USP基因仅在成熟的花粉中特异性表达,且在其它组织(器官)中均未检测到。荧光定量PCR检测分析发现,ZmSTK2_USP基因在玉米花粉发育中期开始表达,且在成熟花粉中特异性表达。(4)本研究成功构建2个表达载体ZmSTK2_USP-GUS和ZmSTK2_USP-GFP,利用农杆菌介导的玉米萌动胚转化的方法获得玉米转基因植株。GUS组织化学染色检测结果表明,玉米转基因植株ZmSTK2_USP-GUS的幼小雄花、成熟雄花、成熟花药以及花粉ESP时期均未检测到GUS活性,但在花粉MSP时期、成熟期直至花粉管伸长均检测到GUS活性;采用农杆菌介导洋葱和烟草进行亚细胞定位分析,观察到ZmSTK2_USP-GFP融合蛋白在洋葱表皮和烟草叶片中瞬时表达都被定位在细胞质中,说明ZmSTK2_USP基因编码的蛋白属于胞质蛋白,这也为生物信息学分析中猜测ZmSTK2_USP属于胞质类受体蛋白激酶提供了依据。(5)本研究成功克隆到ZmSTK2_USP基因的启动子(proZmSTK2_USP),并成功构建表达载体proZmSTK2_USP-GUS,利用农杆菌介导的玉米萌动胚转化的方法获得玉米转基因植株,GUS组织化学染色检测发现,proZmSTK2_USP在成熟花粉和花粉萌发过程中调控基因表达,是一个花粉特异性启动子,这也验证了生物信息学分析的结果。(6)本研究还成功克隆到ZmSTK2__USP的激酶域(ZmSTK2__USP-KD),并构建带有His标签的表达载体pET30a-His-ZmSTK2_USP-KD,转化表达菌株BL21(E.coli)进行体外原核表达;目的融合蛋白为包涵体蛋白,最适诱导条件为IPTG浓度0.5mM、诱导温度37℃和诱导时间5hr,沉淀菌体需8M尿素溶液溶解处理。采用32P放射性同位素成像法及其激酶通用抗体的检测,鉴定出ZmSTK2_USP的激酶域能够发生自磷酸化,也可以催化组蛋白H1磷酸化,与此同时ZmSTK2_USP具有Ser/Thr蛋白激酶活性,不具有Tyr蛋白激酶活性,从而说明ZmSTK2_USP是一种非双底物特异性激酶。
黄鹂[5]2007年在《白菜叁种雄性不育系与保持系花蕾转录组差异分析及叁个花粉发育相关基因功能鉴定》文中研究指明利用植物雄性不育特性来选育雄性不育系是作物杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的重要手段。十字花科作物是杂种优势利用最为普遍的一类作物，雄性不育系(简称不育系)是其生产一代杂种的理想系统。但植物雄性不育产生的机理极其复杂，至今尚未完全解开。花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，弄清花粉发育的全过程和分子机理是研究雄性不育的基础和关键所在。花粉发育涉及众多基因的表达调控，从转录组入手分析花粉发育突变体是获得花粉基因动态表达的途径之一，并可获得较大数目的花粉发育相关基因，有助于在整体水平上理解花粉发育的特征和花粉发育的分子调控机制。本文在获得共享同一保持系(核不育两用系的可育株系)的白菜(Brassica campestris L．ssp．chinensis Makino，syn．B．rapa ssp．chinensis)‘矮脚黄’核不育(‘Aijiaohuang’genic male sterility，ajhGMS)两用系‘Bcajh97-01A／B’、‘Polima’核质互作不育(polima genic-cytoplasmic male sterility，polG-CMS)系‘Bcpol97-05A’以及'Ogura'细胞质不育(Ogura cytoplasmic male sterility，oguCMS)系‘Bcogu97-06A’材料体系的基础上，采用扩增互补脱氧核糖核酸片断长度多态性(complementary deoxyribonucleic acid amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP)及拟南芥基因芯片分析其花蕾转录组差异，对花粉基因表达谱进行系统分析，研究不同雄性不育遗传模式的基因突变导致下游系列基因表达变化的异同，为建立不同雄性不育遗传模式植物花粉基因表达谱的基本框架奠定基础，并鉴定出一批白菜花粉发育相关基因。进而采用反义RNA或RNA干涉(RNAinterference，RNAi)技术，对细胞壁合成与调控相关的两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)基因BcMF2(Brassica campestris male fertility 2)和BcMF9(Brassica campestris male fertility 9)，以及一个未知功能的新基因BcMF10(Brassica campestris male fertility 10)进行功能验证，从形态学、分子生物学、细胞学等方面入手鉴别叁个基因在白菜花粉发育过程中的作用机制。同时，从基因结构、表达特点、作用方式等方面，比较了白菜花粉表达的PG基因家族成员BcMF2、BcMF9和BcMF6(Brassica campestris male fertility 6)的异同。取得的主要结果如下：(1)形态和细胞学观察发现‘Bcajh97-01A’为雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc，对应基因MMC可能编码特异作用于雄性减数分裂的蛋白质。形态和细胞学观察发现，ajhGMS两用系不育株系‘Bcajh97-01A’与可育株系'Bcajh97-01B'的差异仅表现在花粉花药发育上，‘Bcajh97-01A’小孢子在减数分裂末期的胞质分裂中出现异常，不能形成胞间壁而导致四分体形成及后续的花粉发育各过程受阻，最终引起花粉败育。遗传学分析表明该不育性状由单基因位点控制，因此，‘Bcajh97-01A’实际上是一个受单基因位点控制的雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc(male meiotic cytokinesis)，其对应基因MMC可能编码一个特异与雄性减数分裂核分裂完成后的胞质分裂相关的蛋白质。(2)利用cDNA-AFLP技术结合拟南芥基因芯片分析白菜不同不育系之间及与其共同保持系之间的花蕾转录组差异，发现不同遗传模式不育系花蕾基因表达有相似之处，但不尽相同。利用cDNA-AFLP技术及拟南芥ATH1基因芯片，对白菜ojhGMS‘Bcajh97-01A’、polG-CMS‘Bcpol97-05A’和oguCMS‘Bcogu97-06A’，以及它们共同的保持系‘Bcajh97-01B’进行了花蕾转录组比较分析，发现不同的不育基因作用下均引起花蕾正常转录组的巨大变化，不育基因下游众多基因的表达受到抑制，也有相当一部分的基因被激活或表达上升，但作用的不育基因不同，引起的下游基因表达变化也不尽相同。与同一保持系‘Bcajh97-01B’相比，检测到在‘Bcajh97-01A’花蕾中上调表达基因93个、下调表达基因158个；在‘Bcpol97-05A’花蕾中上调表达基因174个、下调表达基因212个；在‘Bcogu97-06A’花蕾中上调表达基因196个、下调表达基因242个。其中。在叁种不育系中共同下调表达的基因有37个，上调表达的24个；‘Bcajh97-01A’和‘Bcpol97-05A’共同下调和共同下调表达的基因各5个；‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下调表达基因为70个，共同上调表达基因9个；‘Bcpol97-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下调表达基因7O个，共同上调表达的基因45个。(3)通过差异表达基因功能分类，发现许多花粉花药发育相关基因功能未知，白菜不同不育系与保持系的花蕾转录组差异分析扩充了植物花粉表达或特异表达基因的数目。对在叁种不育系与其共同保持系花蕾转录组中检测到的差异表达基因进行功能分类，发现约50％的基因功能未知。基于叁种不育系和保持系花蕾的差别仅表现在花药发育和花粉形成上，在不育系和保持系花蕾中差异表达的基因最可能与花粉花药发育相关。我们发现的这些差异表达基因在一定程度上扩充了植物花粉花药表达和特异表达基因的数目。(4)基于基因功能分类对不同不育系与保持系花蕾基因表达差异进行的分析表明，不同遗传模式花粉花药转录组尽管具有相似的模块，但具有不同的组成特征。对差异表达基因进行功能分类发现，不育系与保持系差异表达的叁组基因可分为大致相同的功能类别，但每一功能类别在每组差异基因中所占的比例不尽相同。在叁种不育系花蕾中下调均较多的已知功能的基因与转运通道、蛋白质代谢、电子传递和能量途径、防卫和胁迫反应相关，上调均较多的基因与转运通道、转录调控和普通新陈代谢相关。除此之外，‘Bcajh97-01A’与‘Bcogu97-06A’在花粉花药基因表达上具有更大的共性，在两者花蕾中均下调表达的基因中，细胞壁合成与调控基因排在第一位，细胞骨架蛋白及信号转导相关基因也占了较大的比例，而转录相关基因的比例较小；两者下调表达的基因中，蛋白质代谢相关基因均比较多。‘Bcajh97-01A’与‘Bcogu97-06A’的花蕾转录组的组成特征与拟南芥花粉转录组特征较一致。相比之下，‘Bcpol97-05A’花蕾转录组的组成成分与其他两种不育系有较大的差别。突出表现在细胞壁合成与调控基因、细胞骨架蛋白基因以及信号转导相关基因在不育系花蕾中占较大的比例，而保持系与其相比，这叁种类别基因的表达并不占优势，反而更少。由此可见，不同遗传模式花粉花药转录组尽管具有相似的模块，但组成特征各异。(5)时空表达模式分析发现叁种不育系与其共同保持系花蕾差异表达的基因具不同的表达动态。对27条在叁种不育系和保持系花蕾中差异表达的片段进行了时空表达模式分析，发现大多数差异片段所代表的基因表达在小孢子有丝分裂前后开始被检测到，在花粉成熟过程中继续积累，但在不同组织和发育阶段中的表达水平不尽相同。此外也有在花粉发育早期就检测到表达的基因。我们的研究结果证实了花粉花药发育中的基因表达调控是极其复杂的。在花粉花药发育的不同时期表达或不表达，以及表达水平有序地发生变化都是与花粉花药正常发育、实现其功能所需相对应的。我们的研究为明确白菜花粉花药发育不同时期的基因群作出了有益的探索。(6)表达和功能分析发现BcMF2可能是一个与花粉内壁发育相关的新PG基因。对本实验室前期从‘Bcajh97-01B’花蕾中分离得到的PG基因BcMF2进行时空表达模式分析，发现其转录本最早在四分体时期的花蕾中开始出现，随后在单核花粉粒时期的花蕾中表达量达到最高，之后，随着花粉发育的进行表达量逐渐降低直至花粉成熟，表明其属于花粉表达“早期”基因。利用反义RNA技术研究BcMF2的功能，发现BcMF2表达受抑制的转基因植株花粉体外正常萌发率大幅度降低。约80％的花粉管生长到一定程度后顶端膨大形成泡状结构，花粉管能穿过柱头组织，但在花柱道中的生长停止。进一步观察显示转基因植株花粉畸形，萌发沟的数目及分布不规则，萌发沟在形成过程中位置和数目紊乱，花粉粒内壁异常增厚。推测BcMF2表达受抑制影响了花粉内壁中果胶的动态代谢平衡而导致萌发沟及花粉粒内壁发育的异常。BcMF2与已知的在花粉发育早期起作用的PG基因没有序列及表达特点的相似性，因此它可能是一个新的在花粉发育早期表达的PG基因。(7)表达和功能分析发现分离获得的另一个白菜PG基因BcMF9可能参与花粉内壁和外壁的发育。分离获得在可育株‘Bcajh97-01B’花蕾中特异表达的差异片段BBS13／BPO023的全长序列BcMF9，发现该基因具有典型的PG基因结构特征。分子进化分析表明其属于花粉表达或特异表达的PG基因类群。时空表达模式分析显示BcMF9属于花粉表达“晚期”基因，因其表达最早出现在四分小孢子中，在单核小孢子中开始增强，然后一直持续较高水平的表达直到花粉成熟。BcMF9的转录本亦在绒毡层中出现，从四分体时期开始直到绒毡层降解退化，一直在绒毡层细胞中维持很强的表达信号。转反义BcMF9的植株花粉离体正常萌发率明显降低，约81％的花粉萌发时花粉管爆裂。花粉管能穿过柱头组织，但不久便停止生长。扫描电镜和透射电镜观察显示，BcMF9表达受抑制产生外壁网纹浅的畸形花粉，花粉粒萌发沟处内壁增厚异常，萌发沟的位置和数目紊乱，花粉发育晚期外壁的覆盖层和基粒棒部分脱落，含油层外溢，说明BcMF9可能参与花粉壁的发育。此外，发现转反义BcMF9植株花药绒毡层降解速度加快，绒毡层发育发生异常前的小孢子发育正常，而异常后的花粉外壁发育受影响。推测BcMF9表达受抑制可能破坏了绒毡层细胞的程序性死亡过程，启动了另一个死亡途径，加速了绒毡层的解体。绒毡层正常程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)的破坏，导致其向花粉外壁输送物质过程的改变，从而影响了花粉壁的正常发育。但由于BcMF9编码的蛋白在其N端有一段信号肽序列，而它的表达首先出现在四分体时期的绒毡层和小孢子中，且在绒毡层中的表达信号要比在小孢子中强。因此推测其功能发挥还有另一个可能：BcMF9在绒毡层表达，表达产物分泌到花粉囊腔，进而在花粉壁的发育中直接起作用。(8)比较分析发现PG基因家族成员BcMF2、BcMF6和BcMF9在花粉发育中可能扮演各自不同的角色。从基因序列特征、表达模式特点、基因进化关系及生物学功能等方面比较叁个花粉发育相关的PG基因BcMF2、BcMF6和BcMF9的异同，发现尽管3个PG基因的表达所出现的发育阶段一致，但叁者在各个发育阶段的表达量及表达变化的趋势各不相同。叁者在十字花科物种中的进化特点也不完全一致。3个PG基因的表达受抑制引发了类似的结果，但并不尽相同，说明它们在花粉发育中所起的作用及作用模式可能各异。(9)分离获得在‘Bcajh97-01B’和‘Bcpol97-05A’花蕾中高水平表达的基因BcMF10，序列特征分析提示其可能与信号转导途径相关，RNAi研究发现BcMF10表达受抑制导致花粉萌发异常。分离获得在‘Bcajh97-01B’和‘Bcpol97-05A’花蕾中高水平表达，但在‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’花蕾中沉默的基因片段BBS31／BPO079的全长序列BcMF10。利用生物信息学分析发现预测的BcMF10氨基酸序列中具有可能与细胞增殖、分化和PCD相关的蛋白激酶C磷酸化位点，参与调控信号转导相关的蛋白激酶的酪氨酸磷酸化位点，及其它与细胞内信号转导、蛋白定位以及黏附等过程有关的位点。推测BcMF10编码的蛋白可能在花粉发育过程的信号转导中发挥重要作用。利用RT-PCR(reverse transcriptase PCR，反转录PCR)和原位杂交分析了BcMF10的时空表达特点，发现其转录本最早出现在‘Bcajh97-01B’花药发育早期的花粉母细胞和绒毡层细胞中，随后在减数分裂时期的小孢子和绒毡层中表达量进一步提高，之后随着发育的进行，表达量逐渐降低，但表达部位没有改变，在花粉成熟期消失，属于花粉表达“早期”基因。通过构建含BcA9绒毡层特异启动子的BcMF10 RNAi表达载体，利用转基因阻断内源BcMF10的表达，发现75％左右的转基因植株花粉不能正常萌发，约15.6％的花粉能长出花粉管，但花粉管长到一定长度时顶端爆裂，正常萌发率只有10.5％，说明BcMF10表达受抑制影响了花粉的正常萌发。但与通常发现的花粉管一伸出萌发孔即发生爆裂的现象不同，BcMF10表达受抑制植株花粉管能长到一定长度，然后将内容物从顶端喷出，花粉管生长停止，推测BcMF10也可能与花粉壁的发育相关。根据BcMF10预测蛋白质的结构特征及其在早期绒毡层细胞和小孢子中共表达的特点，可以认为其可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程。
张琳碧[6]2007年在《太空诱变玉米核不育突变体的AFLP及生化特性分析》文中指出花粉及花药发育是植物发育生物学的一个重要研究领域。在高等植物的小孢子发生发育及花粉成熟过程中，涉及到大量基因的协同表达，其中某个基因的结构或表达发生变异，都将导致雄性不育。很多高等植物中都存在着雄性不育现象，对雄性不育突变体的研究，不仅有助于了解植物的生殖规律，更重要的是它具有潜在的农业应用价值，如雄性不育的利用。1996年，四川农业大学玉米研究所通过太空诱变处理川单9号种子获得了一份雄性不育突变体，经研究表明，该雄性不育突变体由一对隐性基因控制。可育株自交后代群体可育植株与不育植株分离比例为3：1，姊妹交群体可育植株与不育植株分离比例为1：1。对该材料的细胞学观察、基因定位方面的工作已经开展，但是基因组对比分析、mRNA差异表达和生理生化方面的工作还是空白。本研究以该突变体的姊妹交六代分离群体为材料，从基因组DNA、转录的CDNA和生理生化叁个方面对可育和不育植株的花药进行了分析，得到的主要结果如下：1．以可育和不育植株的DNA混合池为模板，选用56对EcoRⅠ／MseⅠ引物组合进行基因组对比分析，筛选出4对有差异的引物组合，分离得到3条不育植株所特有的差异条带Zmd1-302、Zmd2-287、Zmd3-246和1条可育植株所特有的差异条带Zmd4-227，并将差异条带在ZMGDB数据库中进行同源性分析。Zmd1-302去掉接头后长度为278bp，它与1条来源于玉米第3染色体上3.04位点的克隆(AC187265)同源性为98％，与1条来源于玉米雄配子cDNA文库中的EST序列(gi33771201)同源性为89％；Zmd2-287去掉接头后长度为258bp，与1条来源于玉米第2条染色体上的克隆(AC191267)的同源性为97％；Zmd3-246去掉接头后长度为222bp，与1条来源于玉米第10条染色体上的克隆(AC1877992)的同源性为99％。2．根据ZMGDB数据库中的克隆AC187265和AC191267的碱基信息对差异条带Zmd1-302和Zmd3-287的侧翼序列进行延伸，对不育来源的3条差异条带共设计了4对特异引物进行SCAR转化，但这4对引物在8株不育单株和8株可育单株中都能扩增得到与目的片段长度相同的条带，即扩增产物不能特异地区分可育植株和不育植株，AFLP标记不能成功转化为SCAR标记。3．选用16对EcoRⅠ／MseⅠ引物组合对可育和不育植株的花药进行差异表达分析，共回收得到9条差异片段，分别命名为Z1～Z9。同源序列比对发现，Z2序列与1条Zea mays putative zinc finger序列(gi46981881)同源性为88％；Z3与查尔酮合成酶(chalcone synthase)有一定的同源性，相似性为54％；Z4序列与推断的水稻脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)同源性为76％；Z5与推断的水稻蛋白激酶AFC3、PK12同源性较高为91％；Z8与推断的水稻甘氨酸脱羧酶的H蛋白(glycine decarboxylase，H-protein)同源性为78％。再结合半定量RT-PCR的方法，分析了Z3、Z5和Z8这3条差异条带在可育和不育植株的花药发育中的表达情况。研究发现，Z3只在可育雄穗刚抽出时表达；Z5除在可育早期不表达外，在可育的其它时期都表达，且在不育雄穗完全抽出时也表达；而另一条可育特异条带Z8则是一个上调表达的基因，在雄穗抽出2～3cm时起始表达，雄穗完全抽出时表达量达到最大。4．对可育和不育4个发育时期的花药的可溶性糖、淀粉、蛋白质和游离脯氨酸的含量分析时发现，不同发育时期可育花药中的可溶性糖、淀粉、蛋白质和游离脯氨酸的含量均高于对应时期的不育花药中的含量。其中，可育花药和不育花药的游离脯氨酸含量差异最明显，在雄穗刚开始孕穗不久其含量已有较大差异。
李祥[7]2003年在《利用HSP70基因人工创造植物雄性不育系的研究》文中指出HSP70是一种分子伴侣，主要功能是参与细胞有关蛋白新生肽的折迭、亚基组装、细胞内运输、蛋白质降解及DNA损伤的修复，对线粒体结构和功能发挥重要作用，已有研究证明HSP70与动植物的发育有密切的关系，本研究将HSP70正、反义cDNA构建成表达载体，并运用基因枪和农杆菌介导法将HSP70正、反义cDNA导入烟草，试通过HSP70反义cDNA抑制hsp70基因的表达从而创造雄性不育株，以证明HSP70反义cDNA能创造雄性不育系。实验结果如下： 1．雄性不育表达载体的构建 人工合成HSP70正、反义cDNA，分别定向插入到pUC18、pUC19中，得到pSC和pAC。然后经过平板筛选和酶切分析证明HSP70正、反义cDNA插入到pUC18、pUC19。分别将从pSC、pAC回收纯化的HSP70正、反义cDNA与绒毡层特异表达启动子TA29及NOS终止子定向连接，然后插入到pUC18、pUC19中，构建成花药特异表达的TA29-HSP70 sense cDNA-NOS和TA29-HSP70antisense cDNA-NOS，分别称作650和651质粒。为了更好地对转化子进行筛选和检测，用HindⅢ和EcoR Ⅰ分别对650、651及3301质粒(含GUS报告基因和bar筛选标记基因)进行酶切，将从650和651回收纯化的目的片段与3301质粒进行连接，再对重组子进行平板筛选和酶切分析确定TA29-HSP70 sense cDNA-NOS和TA29-HSP70 antisense cDNA-NOS插入到3301质粒中，构建成3301+650和3301+651表达载体。 2．获得转基因雄性不育烟草 为了证实HSP70反义cDNA能创造雄性不育，我们将3301+650和3301+651质粒用基因枪和农杆菌介导法转化烟草无菌发芽的叶片，共207片(基因枪109片，农杆菌98片)。在含basta0.4mg／L的筛选培养基上进行筛选，得到抗性叶片181片(基因枪93片，农杆菌88片)。待抗性叶片分化出芽时，取幼嫩的叶片进行GUS染色检测，在195株抗性芽中，有79.5％的抗性芽GUS呈阳 性。 3．转基因植株的分子检测和田间生物学观察 将抗性芽长成植株后移栽到大田共得到30株转化植株。PCR和点杂交分析 表明，HSP70正、反义。DNA己经整合到烟草的基因组中。在进行田间生物学 性状观察时，30株转基因植株中有12株表现出完全不育，9株高度不育，3株 部分不育和6株可育；不育植株在雄蕊、株高和果实重量等方面都存在明显的差 异。石蜡切片分析表明，转基因不育植株的花粉囊的发育和结构与对照的可育植 株之间没有任何差异，只是花粉囊中的花粉在不育株中是不育的，而可育株是可 育的。由于线粒体和热激蛋白在植物的发育过程中起着重要的作用，为进一步分 析其不育机理，我们对花粉线粒体进行了常温和热激处理，提取其蛋白进行测定 和方差分析，结果表明：不育植株与对照的线粒体蛋白含量的差异在常温和热激 条件下均达到极显着水平o＜0．01，n＝10）；而不育植株在常温和热激条件下线 粒体蛋白含量差异不显着，说明转化株中hsp70基因的表达受到抑制，从而进一 步扰乱了线粒体的功能，最终导致转化株雄性不育，表明HSP70反义cDNA能 够通过抑制hsp70基因的表达导致植物雄性不育。
史胜利[8]2010年在《萝卜雄性不育系的细胞结构与基因表达特性研究》文中研究说明萝卜是世界上广泛种植的重要蔬菜作物。自1968年发现Ogura萝卜雄性不育系以来,科研人员在寻找新的不育系品种并对其相应的花粉败育机理研究方面做了大量的工作。一方面,利用萝卜细胞质雄性不育系进行的杂交育种,既可以明显提高萝卜的产量和抗病等抗逆性,又可以通过各种方法把不育基因导入到芸薹属的重要经济植物中,培育出新的雄性不育系品种；另一方面,细胞质雄性不育系是研究细胞质遗传、核质互作和花粉发育的极好材料。目前,对萝卜雄性不育系花药发育中小孢子和绒毡层细胞结构和亚细胞结构变化的研究还较少。对不育系小孢子的败育时间和败育方式的细胞学研究,是对不育系进行分类的重要依据,也是分析其花粉败育机理的重要基础；对比分析可育系和不育系花药发育过程中基因的表达调控,有助于加深对细胞质雄性不育花粉败育机理的认识。本研究以萝卜可育系805B、DH303B和雄性不育系805A、DH303A为材料,研究了萝卜花药发育过程中绒毡层和花粉细胞结构及亚细胞结构的变化,并对不育系805A的花药发育过程中多糖类物质在花药组织中的代谢和运输进行了观察。本研究还利用cDAN-AFLP技术研究了不育系805A和可育系805B的花药发育过程中基因转录表达的差异,克隆了在花药发育过程中差异表达的基因,并对其进行了序列相似性比较分析,推测其功能及其在花粉败育中可能发挥的作用。主要研究结果如下：在萝卜雄性不育系805A的花药发育过程中,花药中4个药室的败育分为两类：第1类药室只有1个,其败育发生在花粉母细胞时期,到减数分裂前,整个药室完全败育。花药败育时绒毡层和小孢子的结构变化特征为：花粉母细胞早期,出现细胞质收缩和质壁分离现象,绒毡层细胞内出现较大的液泡；在花粉母细胞晚期或减数分裂前,花粉细胞内含物基本消失,绒毡层细胞内部的结构完全解体；单核小孢子早期,绒毡层完全消失,药室内只剩余少部分团状物聚集在药室的中央部位,其中包含有细胞质收缩小孢子。随后,此药室内的小孢子完全消失。第2类药室有3个,其绒毡层的异常始于花粉母细胞时期,到单核花粉末期或双核花粉早期绒毡层完全解体,而花粉败育始于四分体晚期,到保持系的双核花粉时期,花粉完全消失。此时,整个花药只剩下没有开裂的4个空药室。花药败育时的结构变化特征为：花粉母细胞时期,花粉母细胞发育正常,绒毡层细胞中出现较大的液泡；四分体和单核居中期,小孢子细胞中出现较大的液泡,同时一部分小孢子内含物完全消失,绒毡层异常肥大；液泡化小孢子时期和双核花粉早期,绒毡层完全解体,小孢子内含物完全消失,花粉完全败育。不育系805A花药发育过程中糖类的代谢及运输特征为：花粉母细胞时期,糖类在药室壁和维管束周围的薄壁组织中大量积累,形成很多的淀粉粒；单核居中期,在保持系花药中,这些淀粉粒逐渐减少,但在不育系中,这些淀粉粒仍然大量存在；液泡化小孢子时期,保持系中的淀粉粒完全消失,但不育系中仍存在少量淀粉粒,此时药室壁的内层细胞染色很深。在不育系DH303A花药发育的四分体时期,一些小孢子出现了质壁分离现象,且所有小孢子聚集在药室中央。此时,绒毡层厚薄均匀,结构正常。单核居中期,一部分小孢子的细胞质就已经解体,细胞内含物消失,此时绒毡层厚薄均匀,细胞结构正常,细胞质浓稠。液泡化小孢子时期,越来越多的小孢子的细胞质解体,花粉被严重膨大、液泡化的绒毡层挤压在药室中央、随后绒毡层解体,小孢子败育。最终,花药的4个药室壁没有开裂,内部结构全部消失。分别以保持系和不育系花药发育过程中叁个阶段的cDNA作为模板,利用128对E+2／M+3引物进行选择性扩增,对可育系805B和不育系805A在花药发育中的基因差异表达进行研究,总共发现了2556个TDF (transcript-derived fragment),发现在可育系和不育系花药发育的叁个阶段中基因表达有明显差异,这说明不育系基因表达在花药发育早期就已经出现明显的异常,暗示不育突变干扰了与花药发育早期相关的基因的表达调控。在所有的TDF中,检测到11种重要的差异表达类型。这些基因差异表达反映了保持系和不育系在花药发育过程中基因的异常表达,说明许多重要基因表达发生改变造成相关的生理功能紊乱,导致不育系花药发育异常和花粉败育。我们克隆测序分析了223差异表达的cDNA片段。基于同源序列的候选基因法,通过检索GenBank和TAIR数据库获得与216个TDF相关的基因信息。分析结果后,发现35个TDF的功能与转录有关,占总测序TDF的16.2%；22个TDF的功能与细胞内的信号传导有关,占总测序TDF的10.2%；占6.9%,15个TDF的功能与DNA合成、细胞生长和分裂有关；另有15个TDF、占6.9%的TDF与细胞的新陈代谢有关；13个,占6%的TDF与细胞的生物合成有关。此外,发现23个未进行功能分类的TDF,占总测序TDF的10.6%；41个无法未知功能的TDF,占总测序TDF的18.9%；与转录和信号传导相关的基因的异常表达暗示了花药的发育和分化受到影响,部分解释了不育系805A花粉败育特征。本研究分析了一些花药发育过程中差异表达的基因,并讨论了这些基因在花药败育中可能发挥的作用。
杨寅桂[9]2007年在《黄瓜耐热性及热胁迫响应基因研究》文中认为高温是作物生长过程中经常遇到的逆境胁迫，其造成的热害已成为黄瓜(Cucumis sativus L．)夏季栽培与保护地栽培的主要限制因子。如何提高黄瓜耐热性是目前黄瓜育种研究的重要内容之一。正确理解黄瓜的耐热机制则是耐热育种的基础。本文从生理指标和分子生物学等方面对黄瓜耐热性进行了研究，以期更加深刻地理解黄瓜耐热机制，为黄瓜耐热育种打下基础。主要作了以下研究：1黄瓜热害症状研究及耐热材料筛选以耐热品种‘Poinsett 97’和热敏品种‘Boothbyls Blonde’为试验材料，采用42℃高温处理黄瓜幼苗24h，观察子叶、幼叶、心叶、下胚轴及整株幼苗的热害症状，并记载热处理后不同时间的热害症状变化。提出了明确的黄瓜幼苗热害症状的分级标准，对于田间热害的诊断及黄瓜耐热性的鉴定与评价具有良好的实用价值。将不同类型黄瓜品种的种子置于28℃、38℃和42℃温度下进行发芽试验，比较种子的发芽能力。结果表明：不同类型的黄瓜品种在不同的温度下发芽能力存在明显差异，其中西双版纳黄瓜、‘Poinsett 97’、‘北京截头’种子发芽耐热能力明显强于‘HH1-8-57’和‘二早子’。以所收集的不同生态型的黄瓜品种为试验材料，经田间自然高温幼苗期与成株期耐热性筛选，结合人工高温幼苗耐热性比较。结果获得耐热黄瓜品种材料5个，热敏黄瓜品种材料2个。丰富了黄瓜耐热性与热害研究的材料，有助于解决黄瓜生产中的热害问题。2黄瓜耐热生理指标研究以黄瓜耐热品种‘Poinsett 97’、热敏品种‘Boothbyls Blonde’和它们杂交的F_1为实验材料，研究黄瓜幼苗在28℃和38℃下，叶片中保护性酶类活性和膜透性的变化。结果表明：在38℃热胁迫下，耐热品种的相对电导率、MDA含量提高量明显低于热敏品种，而其保护酶SOD、POD活性和PRO含量的提高明显高于热敏品种，CAT活性的降低量明显低于热敏品种。在热胁迫下，F_1的POD活性表现正向杂种优势，其余均为负向优势。3黄瓜热胁迫响应基因分离和分子标记筛选为了快速高效地提取黄瓜幼叶总RNA，满足于cDNA-AFLP实验的要求。对Trizol试剂提取总RNA的方法进行了改进，所提RNA经琼脂糖电泳检测，其28S、18S、5S叁条带清晰，完整性好，每0.1g幼叶可获得RNA100～150μg，产率高。经反转录、双链cDNA合成和cDNA-AFLP检测，证实提取的RNA完全能达到cDNA-AFLP对RNA的要求。以耐热品种‘西双版纳黄瓜’和热敏品种‘二早子’为供试材料，对幼苗进行38℃热激处理2h。采用cDNA-AFLP技术比较热激前后基因表达差异，分离黄瓜热激响应基因。利用RT-PCR技术检测所分离基因的表达。从‘二早子’中分离到chrr182(cucumber heat response related)特异片段，经比对发现该片段与转录修复偶联因子(transcription repair coupling factor-TRCF)同源。该基因在38℃下被诱导增强表达。表明黄瓜幼苗耐热性或热伤害的发生可能与TRCF基因的响应有关。用耐热自交系‘Poinsett 97’和热敏自交系‘Boothbyls Blonde’经杂交和自交构建F_2分离群体，利用分离群体分组分析方法先找到与耐热性状相关的侯选SSR标记，然后在群体中进行验证。筛选到CMCT505的SSR标记与黄瓜耐热性状相关，Mapmaker分析发现该标记的连锁距离为：19.3cM。本研究筛选到与黄瓜耐热相关的SSR分子标记1个，为黄瓜耐热品种选育奠定了基础。4黄瓜CSHSP70基因克隆、表达及其内含子结构分析以耐热品种‘西双版纳黄瓜’和热敏品种‘二早子’为供试材料，用25℃、38℃和42℃处理幼苗2h。根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计特异引物，采用RT-PCR技术检测黄瓜CSHSP70基因的表达。在25℃下，耐热品种‘西双版纳黄瓜’和热敏品种‘二早子’CSHSP70基因表达量难以检测到；在高温热胁迫下，该基因能明显增强表达，但两类品种CSHSP70基因的表达存在差异，其中热敏品种‘二早子’在38℃下增强表达明显，而耐热品种‘西双版纳黄瓜’则在42℃下才明显增强表达。黄瓜CSHSP70基因在热胁迫下增强表达，这有助于理解黄瓜热害与耐热性的分子机理。内含子广泛存在于真核生物基因组非编码蛋白的DNA序列中，能够有效地调控基因表达。为了探明黄瓜CSHSP70基因的内含子数目及其结构特点。根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计引物，应用PCR技术从gDNA中克隆CSHSP70基因，采用RT-PCR技术验证内含子的存在。经测序与拼接，得到长度为4056bp的黄瓜CSHSP70基因，它包含7个内含子。经分析发现这些内含子富含A·T，具有类似启动子和HSE核心结构的序列存在。对黄瓜、甜瓜和丝瓜CSHSP70基因部分序列的比较分析表明，该基因在这3个葫芦科作物中具有很强的保守性。该基因内含子存在一些特殊结构，可能对其表达具有重要调控作用。
肖辉海[10]2005年在《水稻隐性长穗颈（eui）基因表达的基础生物学研究》文中研究表明隐性长穗颈(elongated-uppermost-internode，简称eui)性状是解决不育系包颈现象的重要要遗传资源。有关温敏雄性核不育水稻中eui基因的遗传规律等方面已有深入研究，但环境因素对eui基因表达的影响、穗颈节间伸长的细胞学机制、eui基因的特异性cDNA片段的克隆等方面的研究还未见报道。本文以培矮64S为对照，研究温度对隐性长穗颈温敏雄性核不育水稻eui基因表达的影响，eui基因促进穗颈节间伸长的细胞学机制，以及利用SSH技术分离隐性长穗颈温敏雄性核不育水稻长选3S穗颈节间特异表达的cDNA片段。主要研究结果如下：(1)自然条件下长选3S茎秆高度比培矮64S的高24.3cm，主要是由倒一节间(即穗颈节间)的伸长所致，长选3S的倒一节间比培矮64S的长16.6cm，增加的长度占长选3S倒一节间长度的47.3％。倒二节间和倒叁节间也有一定的伸长，倒四节间与对照基本一致。穗颈伸出剑叶鞘的长度由倒一节间长度和剑叶鞘长度决定，长选3S剑叶叶鞘与培矮64S相比增长2.8cm，表明隐性长穗颈基因对叶鞘伸长有一定的促进作用，但这种促进作用远小于对穗颈节间伸长的促进作用，使隐性长穗颈不育系长选3S的包颈程度比培矮64S的大大降低或不包颈。(2)长选3S穗颈伸出叶鞘的长度与始花当天的日均温度无关，而与始花前20-9 d自然条件下的日均温度呈负相关，其中以始花前17-12d(花粉母细胞形成至减数分裂期)日均温度负相关性最显着。始花前不同时段24℃处理的结果表明：与对照相比，包穗现象有不同程度的减轻，有5个处理使穗全部伸出剑叶叶鞘，其中以始花前17-12 d(即花粉母细胞形成至减数分裂期)温度处理伸颈伸出长度最大，人工温度处理的结果与自然条件下温度与穗颈伸出度的相关性分析一致，因此，始花前17-12 d(即花粉母细胞形成至减数分裂期)是隐性长穗颈eui基因表达对温度最敏感的时期。在eui基因表达对温度最敏感的时期进行28℃、26℃、24℃、22℃四种人工温度处理，28℃条件下eui基因表达受抑制，有30％的颖花被包在剑叶叶鞘中；26℃-22℃条件下eui基因表达，且穗颈伸出剑叶鞘的长度随温度的降低而增加。(3)在幼穗分化的第Ⅵ期，长选3S和培矮64S之间穗颈节间长度相差不大，从第Ⅶ期开始，长选3S穗颈节间伸长的速度比培矮64S的快。而从第Ⅷ期至始花当天，长选3S穗颈节间伸长的速度显着快于培矮64S的，这一时段长选3S穗颈节间日均伸长的速度是培矮64S的2.2倍，穗颈节间伸长的长度是培矮64S的2.5倍。始花后两者穗颈节间伸长速度逐渐减慢，最后停止伸长。不同发育时期穗颈节间的细胞平均长度和细胞个数也呈现相似的变化规律，即长选3S穗颈节间薄壁细胞个数和长度在Ⅵ期时与培矮64S并无很大差异，随着幼穗的不断发育，细胞长度和细胞个数的差异越来越大，到定长时差异达到最大。长选3S穗颈节间薄壁细胞个数的增加从Ⅶ期到Ⅷ期至始花当天是呈直线式上升趋势，而到了始花之后细胞个数增加速度减慢；薄壁细胞的长度在Ⅶ期至始花当天也显着的增加，但从始花到定长这一阶段细胞长度呈缓慢增长的趋势。人工温度(24℃)条件下长选3S穗颈节间伸长的动态变化、穗颈节间的细胞平均长度及细胞个数的变化规律等与自然条件下所得的结果基本一致。综上所述，长选3S穗颈节间的伸长主要是由幼穗分化前期细胞分裂和细胞伸长共同作用的结果。(4)自然条件下长选3S定长穗颈节间的长度比对照培矮64S的长18.0 cm，其纵列外层和内层薄壁细胞个数分别比培矮64S的多1 248个和580个；外层和内层薄壁细胞的平均长度分别比培矮64S的长23.3μm和38.3μm，尤其是中部区段细胞的平均长度差值最大，长选3S穗颈节间中部区段外层和内层薄壁细胞的平均长度分别比对照的长24.8μm和48.7μm。说明隐性长穗颈温敏核不育水稻穗颈节间伸长是细胞数目增多和细胞长度增加双重作用所致，其后者作用更显着。在不同温度处理后，长选3S穗颈节间最内和最外层薄壁细胞个数和细胞平均长度随处理温度升高逐渐减少；与22℃处理的材料比较，28℃处理的材料穗颈节间短11.79 cm，其纵列最外和最内层薄壁细胞数目分别少771个和292个，细胞平均长度分别短13.9μm和24.6μm。表明eui基因促进细胞分裂和细胞伸长的作用随处理温度的升高逐渐减弱。(5)以培矮64S为对照群体，长选3S为目标群体，进行抑制差减杂交。用经过PA cDNA差减的CX cDNA构建一个差减文库。该文库包含约130个独立的重组克隆，插入片段平均大小为185 bp左右。(6)采用差减前的培矮64S cDNA和长选3S cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针，对随机挑取的96个重组克隆进行差示筛选，结果筛选出与差减前的长选3ScDNA探针和正向差减的cDNA探针都有杂交信号的特异表达克隆4个，只与正向差减的cDNA探针有杂交信号的特异表达克隆16个，共计20个，从20个候选阳性克隆中随机挑取8个进行Northern杂交，证实其中1个候选阳性克隆为长选3S穗颈节间特异表达的cDNA片段。但该基因是否为水稻中的高秆隐性基因(即eui基因)以及它在隐性长穗颈不育水稻穗颈节间伸长过程中的作用，还有待于在获得该cDNA片段的全长、进行更有效地同源性比较和对其进行功能研究后才能确定。综上所述，eui基因具有显着地促进穗颈节间内层薄壁细胞伸长的作用；该基因的表达与育性敏感期(即花粉母细胞形期至减数分裂期)的日均温度呈极显着的负相关，在此时期内如果日均温度在24℃-26℃之间，则能同时满足不育基因和eui基因的充分表达。因此，隐性长穗颈不育水稻在大田生产应用时要注意选择适宜的时间段和地域，既保证隐性长穗颈eui基因能够充分表达，又确保其育性不发生波动；在隐性长穗颈eui基因感温的敏感时期若遇到持续高温天气，在抽穗时则可通过适当喷施赤霉素以确保穗颈节伸出。有关eui基因全序列的获得和其功能确定还需要作大量的研究工作。
参考文献：
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[5]. 白菜叁种雄性不育系与保持系花蕾转录组差异分析及叁个花粉发育相关基因功能鉴定[D]. 黄鹂. 浙江大学. 2007
[6]. 太空诱变玉米核不育突变体的AFLP及生化特性分析[D]. 张琳碧. 四川农业大学. 2007
[7]. 利用HSP70基因人工创造植物雄性不育系的研究[D]. 李祥. 湖南农业大学. 2003
[8]. 萝卜雄性不育系的细胞结构与基因表达特性研究[D]. 史胜利. 武汉大学. 2010
[9]. 黄瓜耐热性及热胁迫响应基因研究[D]. 杨寅桂. 南京农业大学. 2007
[10]. 水稻隐性长穗颈（eui）基因表达的基础生物学研究[D]. 肖辉海. 湖南农业大学. 2005
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