真菌免疫调节蛋白超表达载体的构建及金针菇遗传转化

真菌免疫调节蛋白超表达载体的构建及金针菇遗传转化

论文摘要

真菌免疫调节蛋白(FIPs)是一种提取于高等真菌的小分子蛋白质,其具有与免疫球蛋白重链区相似的结构且生物学活性与植物凝集素相似。已发现的多种真菌免疫调节蛋白均具有凝集血细胞、抗肿瘤、抗过敏、促淋巴细胞增殖等生物学活性,使其具有良好的临床应用前景。目前FIP的功能研究主要集中在对人体和动物的生物学作用,而其对真菌本身的生物学功能尚不清楚。本研究以金针菇为研究对象,构建FIP-fve和LZ-8超表达载体,通过农杆菌介导法转入金针菇,得到阳性转化子;将FIP-fve基因超表达、FIP-fve基因沉默和野生型金针菇进行栽培,对比和分析表型变化,提取蛋白并进行蛋白质检测分析,为研究FIP-fve对金针菇本体的生物学功能奠定基础。首先,本论文克隆了FIP-fve基因和LZ-8基因,并构建相应的表达载体,其中构建了两种FIP-fve超表达载体,一种是pCAMBIA1301-FIP-fve,是在pCAMBIA1301载体的35S启动子后连入目的基因FIP-fve,另一种是pCAMBIA1301-GPD-FIP-fve,是将金针菇内源启动子GPD基因同FIP-fve基因插入pCAMBIA1301多克隆位点,随后构建LZ-8基因超表达载体pCAMBIA1303-GPD-LZ-8,同样将GPD启动子基因和LZ-8基因插入多克隆位点。其次,选用农杆菌介导转化的方法,建立并完善超表达载体的金针菇遗传转化体系,侵染材料为1 cm2的金针菇菌丝块,侵染条件为农杆菌菌液浓度OD600为0.5,农杆菌菌液中加入AS至终浓度为200μmol·L-1,侵染时间为30 min。25℃下,在含有200μmol·L-1AS的共培养基中培养3天,用含有9μg·mL-11 Hyg的YPG培养基进行筛选,最终获得了FIP-fve超表达的金针菇转化子,其中,pCAMBIA1301-FIP-fve转金针菇的农杆菌转化效率为17.5%,pCAMBIA1301-GPD-FIP-fve转金针菇的转化效率为22.5%,而pCAMBIA1303-GPD-LZ-8转金针菇的转化效率为10%。最后,将筛选出的FIP-fve基因超表达的金针菇进行菌丝培养,同FIP-fve基因沉默金针菇和野生型金针菇共同进行实验室内栽培,至子实体成熟,观察金针菇表型变化,并提取蛋白进行蛋白质检测分析。野生型金针菇中菇原基数为46,pCAMBIA1301-GPD-FIP-fve转金针菇的三株FIP-fve超表达金针菇的菇原基数分别为69,55和71;pCAMBIA1301-FIP-fve转金针菇的三株FIP-fve超表达金针菇的菇原基数分别为92,116和51。采用Bradford法测试金针菇子实体总蛋白含量,结果表明FIP-fve基因超表达的金针菇蛋白浓度与野生型金针菇蛋白浓度相近,而FIP-fve基因沉默的金针菇总蛋白浓度相对较低。另外,通过SDS-PAGE分析目的蛋白质FIP-fve的含量,结果表明野生型金针菇中FIP-fve的含量为0.73 mg·g-1,pCAMBIA1301-GPD-FIP-fve转金针菇的三株FIP-fve超表达金针菇的FIP-fve含量分别为0.75 mg·g-1,0.76 mg·g-1和0.75 mg·g-1;pCAMBIA1301-FIP-fve转金针菇的三株FIP-fve超表达金针菇的FIP-fve含量分别为0.80 mg·g-1,0.71 mg·g-1和0.76 mg·g-1;FIP-fve基因沉默的金针菇中FIP-fve含量为0.71 mg·g-1和0.69 mg·g-1,进一步进行Western Blot检测,结果表明,FIP-fve超表达的金针菇中FIP-fve表达量升高,FIP-fve基因沉默的金针菇中FIP-fve表达量下降。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 食药用真菌简述
  •   1.2 真菌免疫调节蛋白研究进展
  •     1.2.1 FIPs家族的生物学结构特征
  •     1.2.2 FIPs的生物学活性
  •   1.3 金针菇成分的研究进展
  •     1.3.1 金针菇的营养成分
  •     1.3.2 金针菇的化学成分
  •   1.4 FIP-fve的生物学活性
  •   1.5 食用菌遗传转化方法
  •   1.6 金针菇遗传转化研究进展
  •   1.7 本论文研究目的
  • 第二章 真菌免疫调节蛋白超表达载体的构建及金针菇遗传转化
  •   2.1 试验材料与方法
  •     2.1.1 菌种与质粒
  •     2.1.2 试剂
  •     2.1.3 培养基
  •     2.1.4 仪器
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 引物合成
  •     2.2.2 目的基因获取
  •     2.2.3 pCAMBIA1301-FIP-fve表达载体构建
  •     2.2.4 pCAMBIA1301-GPD-FIP-fve表达载体构建
  •     2.2.5 pCAMBIA1303-GPD-LZ-8 表达载体构建
  •     2.2.6 农杆菌介导金针菇遗传转化
  •     2.2.7 菌株检测鉴定
  •     2.2.8 金针菇阳性转化子栽培
  •     2.2.9 蛋白表达分析
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 重组载体pCAMBIA1301-FIP-fve的构建
  •     2.3.2 重组载体pCAMBIA1301-GPD-FIP-fve的构建
  •     2.3.3 重组载体pCAMBIA1303-GPD-LZ-8 的构建
  •     2.3.4 农杆菌LBA4404 转化子鉴定
  •     2.3.5 金针菇阳性转化子鉴定
  •     2.3.6 子实体表型观察
  •     2.3.7 蛋白浓度测定
  •     2.3.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
  •     2.3.9 Western Blot分析
  • 第三章 讨论与结论
  •   3.1 讨论
  •   3.2 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录:英文缩写词
  • 攻读学位期间发表的学术文章
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张昕

    导师: 林景卫

    关键词: 真菌免疫调节蛋白,遗传转化,金针菇,超表达

    来源: 沈阳农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 沈阳农业大学

    分类号: Q943.2;S646.15

    DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000179

    总页数: 67

    文件大小: 2383K

    下载量: 83

    相关论文文献

    • [1].中药免疫调节在医学上的研究应用[J]. 信息化建设 2015(09)
    • [2].“免疫调节”专题的高效复习备考策略[J]. 教学考试 2020(15)
    • [3].“免疫调节”教学设计[J]. 中学生物教学 2020(06)
    • [4].高中生物“免疫调节”疑难点分析[J]. 中学教学参考 2020(32)
    • [5].问题串辅助生物概念图的构建——以“免疫调节”一节为例[J]. 中学生物教学 2016(21)
    • [6].一轮复习之《免疫调节》的教学设计[J]. 中学教学参考 2017(08)
    • [7].以“免疫调节”为例谈高中生物学教学中生命观念培养[J]. 考试周刊 2017(45)
    • [8].中医药对类风湿性关节炎免疫调节的研究进展[J]. 健康之路 2017(08)
    • [9].“翻转课堂”在高中生物教学中的应用——以《免疫调节》一课为例[J]. 中学教学参考 2017(23)
    • [10].盘点2014高考对免疫调节相关知识的多角度考查[J]. 考试(高中理科) 2014(Z2)
    • [11].重组云芝免疫调节蛋白的提取及免疫活性的初步研究[J]. 农业与技术 2015(17)
    • [12].用图示法突破“免疫调节”教学设计的疑难[J]. 中学生物教学 2013(03)
    • [13].免疫调节疑难问题解析[J]. 中学生物教学 2014(11)
    • [14].大型真菌免疫调节蛋白的研究进展[J]. 生物技术通报 2012(05)
    • [15].特发性血小板减少性紫癜89例治疗体会[J]. 职业与健康 2008(02)
    • [16].基于概念模型构建的“免疫调节”一节的教学设计[J]. 中学生物学 2020(05)
    • [17].免疫调节教学疑难解析[J]. 新课程(下) 2019(03)
    • [18].基于生物核心素养下的《免疫调节》教材二次开发——以海军航空实验班教学为例[J]. 新课程(下) 2018(09)
    • [19].“免疫调节”考向解读与分析[J]. 中学生理科应试 2015(12)
    • [20].蠕虫免疫调节分子的抗炎作用与机制[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012(06)
    • [21].中医药免疫调节的研究概况[J]. 世界最新医学信息文摘 2019(66)
    • [22].“免疫调节”教学设计[J]. 中学生物教学 2019(02)
    • [23].免疫调节考点聚焦[J]. 教学考试 2017(51)
    • [24].关于高中生物“免疫调节”教学的几点思考[J]. 新课程(中) 2015(06)
    • [25].免疫调节的有效复习[J]. 青苹果 2015(03)
    • [26].免疫调节教学设计[J]. 中学生数理化(学研版) 2013(10)
    • [27].黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析[J]. 上海交通大学学报(农业科学版) 2012(01)
    • [28].中药免疫调节方冬虫夏草中腺苷含量测定方法的探讨[J]. 中国医药导刊 2011(10)
    • [29].进展期胃癌术前术后免疫调节性T细胞和自然杀伤细胞影响的临床分析[J]. 中外医疗 2020(05)
    • [30].高三生物复习的六“点”突破——以“免疫调节”一节为例[J]. 中学生物学 2014(03)

    标签:;  ;  ;  ;  

    真菌免疫调节蛋白超表达载体的构建及金针菇遗传转化
    下载Doc文档

    猜你喜欢