刘洁[1]2016年在《结球甘蓝离体遗传转化体系的建立及转FOC1基因植株的获得》文中研究表明甘蓝枯萎病是多年来导致全世界甘蓝质量下降、产量严重受损的一种毁灭性的土传病害[1]。实验室前期与中国农业科学院蔬菜花卉研究所合作,从甘蓝中鉴定了一个甘蓝枯萎病抗性候选基因FOC1,但一直没有能够对这个基因的相关抗性功能进行相应的验证。本文从甘蓝植株的苗龄、不同激素添加浓度组合、Ag NO3浓度等方面研究了它们对再生体系的影响情况,综合数据后建立了甘蓝的高效再生体系。再从筛选剂浓度、农杆菌抑制剂最适浓度和农杆菌菌液浓度和侵染时间长短对甘蓝遗传转化体系的影响,建立了甘蓝遗传转化的体系。为研究甘蓝抗枯萎病基因FOC1在转基因甘蓝中的抗性功能,利用本实验室前期克隆的FOC1基因,以p BI121质粒为植物表达载体,利用Infusion方法构建FOC1基因的正义表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并以表现为高感枯萎病的甘蓝自交系213为植物受体材料,该抗性基因通过农杆菌介导的遗传转化方法成功的被转化,获得了整合FOC1抗性基因的转基因甘蓝植株,并利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。本论文的主要研究结果如下:1.甘蓝外植体高效再生体系和遗传转化体系的建立选择4d苗龄的甘蓝幼苗作为试验所用受体材料;当激素组合浓度为6-BA 3 mg/L+NAA 0.1mg/L时,外植体再生率高达31.4%;本研究的结果显示对于此品种的甘蓝外植体,Ag NO3并没有促进分化的作用。对于甘蓝的转化,因此选用筛选剂浓度为10 mg/L的Kan对抗性芽进行初步的筛选;农杆菌抑菌剂选择了对农杆菌抑制效果好同时对芽生长无影响的特美汀,最适浓度为150 mg/L;农杆菌菌液浓度以OD600为0.5,侵染时间为5min最适合。2.FOC1基因正义表达载体的构建根据实验室前期利用RACE技术获得的FOC1全长序列信息,在目的基因特异的上下游引物的5’端添加与连接载体末端同源的15 bp碱基,以反转录获得的c DNA为模板,利用上述设计的特异引物In-fusion ZY-FOCF/R,扩增FOC1基因的CDS全长。内切酶XbaⅠ和SacⅠ将植物表达载体p BI121双酶切后,利用Infusion方法与目的片段连接后得到重组载体,最后通过热激法将重组载体p BI121-35S-FOC1成功转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10中。3.植物表达载体的遗传转化与转基因苗的鉴定重组载体进行农杆菌转化之后,利用农杆菌作为媒介,将植物表达载体导入到受体甘蓝的植株。农杆菌转入甘蓝受体植株当中后,经过一系列的共培养及筛选过程,最后共获得了40株抗卡那霉素的抗性甘蓝植株,初步大量提取植物的DNA,PCR检测有10株为阳性植株。表明重组载体已成功导入到受体甘蓝植株中。但其究竟与甘蓝植株的基因组是否整合,基因是否能正常表达,是否能翻译出具有功能的蛋白,还需要进一步通过Southern,Northern和Western等手段进一步验证。
王慧芳[2]2004年在《甘蓝组织培养再生、转化及筛选系统的优化研究》文中提出本实验选材为十字花科植物甘蓝,在建立起再生系统后,分别以下胚轴和子叶为试验材料,所用基本培养基为MS 培养基,研究了不同外源激素配比以及不同培养条件对器官分化的影响,选出适合甘蓝生长分化的最佳培养基和培养条件。结果表明:甘蓝下胚轴诱导愈伤组织的最佳培养基为NAA 0.2 mg/L,2,4-D 0.5 mg/L;子叶诱导愈伤组织的最佳培养基为NAA 0.1 mg/L,2,4-D 0.5 mg/L;愈伤组织诱导芽分化的最佳培养基为6-BA 2 mg/L,NAA 0.1 mg/L,附加20 μm AgNO3,可提高分化率;根的诱导用的培养基为1/2 MS + NAA 0.1 mg/L.在转化过程中,进行了几种比较试验,包括卡那霉素的筛选、抗生素浓度的筛选及不同防褐剂、不同菌浓度、共培养天数、农杆菌的不同感染时间对转化苗的影响。结果表明:AgNO3对甘蓝外植体的褐变有一定的防止作用,甘蓝外植体对卡那霉素的敏感阈值为25 mg/L,转化开始阶段不加卡那霉素,但在试验过程中要逐渐提高Km 的浓度.附加的羧苄青霉素在500 mg/L 时能完全抑制农杆菌的生长,但转化苗会逐渐产生抗性,所以在试验过程中也要逐步筛选羧苄青霉素的浓度。最后得到甘蓝抗Km 的优化组合。
邹智[3]2008年在《油菜安全高效转化体系研究》文中提出随着分子生物学和生物技术的飞速发展，转基因技术取得了长足的进步，仅成功应用于植物的转化方法就不下10种，如何高效地获得单拷贝、无选择标记、稳定可育的转基因植株成为植物遗传转化发展的方向。油菜是最早从基因工程中获益的物种之一，自1986年第‘例转基因油菜诞生至今，油菜遗传转化技术发展迅速，其中，农杆菌介导法以易操作、低费用、插入片段明确、拷贝数低等独特优点成为首选。但传统的农杆菌介导法主要依赖受体细胞的脱分化和再分化过程获得转基因植株，存在基因型依赖性强、操作繁琐、影响因素众多、转化效率低、转化周期长、易发生体细胞变异和出现转基因沉默等缺陷，不依赖受体细胞的脱分化再分化过程、不或很少依赖组织培养的整株转化技术的出现为解决这一矛盾提供了契机。鉴于农杆菌介导的共培转化体系转化周期过长、影响因素众多等问题，本研究构建了含GFP和Gus(插有一拟南芥基因内含子)等易于瞬间表达分析的植物表达载体。利用这些载体对影响农杆菌介导油菜遗传转化效率的因素对进行了系统研究，建立了油菜子叶柄和和下胚轴等外植体的高效瞬间表达体系。在此基础上，通过对影响子叶柄和和下胚轴再生、褐化等的冈素进行优化，最终使稳定转化效率提高到5％以上，成功获得了pBILBar—iGUS、pBINPTII—iGUS、pBILBar-GFP、pNapin—fael RNAi(500，800，1500)、pFael一fael RNAi(500，800，1500)等9个载体的转基因植株。考虑到不同物种、同一物种的不同品种或生态型对农杆菌的敏感性不同，本研究从拟南芥中克隆了影响农杆菌转化的植物因子VIPl和H2AI的全基因序列，并进行了生物信息学分析、载体构建和转化实验，以期通过向油菜等植物导入这些植物因子，探讨其在农杆菌转化中的作用和探索提高植物遗传转化效率的新途径。与此同时，通过借鉴拟南芥等物种中成熟的整株转化体系，本研究在油菜上对花粉管通道法、花粉介导法、花序浸染法、花序喷雾法等进行了一系列摸索。其rfl，用花粉管通道法、花粉介导法、花序浸染法成功获得了转基因油菜，转化效率分别为0．43~／0、0．31％、0．19％。此外，考虑到转基因植物的安全性问题，本研究构建了便于标记基因删除的位点特异性载体Cre／loxP系统，并成功获得了含Cre或loxP的转基因烟草、拟南芥和油菜植株。
郭学兰[4]2009年在《油菜雌蕊原位转基因方法》文中进行了进一步梳理油菜在分类上属芸苔属植物,包括重要的油料作物和蔬菜。传统的芸苔属植物转基因方法是基于组织培养的根癌农杆菌介导法。这类方法存在的主要问题是转化效率低,转化和再生受基因型影响,重复性差,严重限制了芸薹属作物的基因研究和分子育种。目前甘蓝、白菜和甘蓝型油菜叁物种的全基因组测序即将完成,将产生大量的功能基因。开发一种不依赖于基因型的、高效高通量的油菜转基因方法意义重大,既可以为基因研究创建突变群体,又可以为优良性状的转基因育种研究提供方法和技术平台。本研究借鉴花粉管通道法,通过建立和优化油菜的雌蕊原位转化方法,分析甘蓝型油菜的转化时间、外源DNA溶剂和雌蕊处理方式对转化的影响,研究转基因的遗传规律,建立了一套高效可重复的甘蓝型油菜基因转化体系。继而通过比较不同白菜型油菜、甘蓝和甘蓝型油菜品种的花粉管生长规律和转化率,得到表达报告基因的除草剂抗性植株,实现了不同类型和基因型油菜的高效转化,扩展了方法的应用范围。在此基础上,本文通过分析外源GUS基因在转化种子中的表达形式,探讨了雌蕊原位转化法的生物学机理,从理论上分析了这种转基因方法的基因型非依赖性和核遗传规律。研究的结果将对油菜的转基因研究和应用起到良好的推动作用。本研究取得的主要结果如下:1.花粉管生长观察。通过对花粉管进行组织化学染色和光镜观察,比较研究了甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝的花粉管生长规律。发现供试的甘蓝品种及甘蓝型油菜品种的花粉管生长规律基本相同,授粉后12～18h在子房中穿行并开始发生90°左右的转折,然后沿珠柄向珠孔延伸。白菜型油菜花粉粒萌发早, 6～8h后花粉管束密集地穿越花柱进入子房。2.转化方法的初步确定。根据油菜花器官特征、授粉受精过程和预实验结果,初步确定了甘蓝型油菜的雌蕊原位转基因方法的操作程序:选择健壮植株上的主花序和上部第一次分枝,去除已经开放的花和角果,去除长度3mm以下的花蕾;剥开1～3d后即将开放的花蕾,去除花药,露出雌蕊的柱头和花柱。人工授粉后切除雌蕊的一小部分柱头,在新鲜的切面上点滴2～3μl质粒溶液(5μg/μl);角果成熟后收获种子。用此方法,从收获的种子中筛选到12株PCR阳性的转基因幼苗。3.以中双9号为转化对象,研究优化了影响该转基因方法的主要因素。1)探索了最适合的转化时间。授粉后6h进行转化,从转化处理的种子中筛选得到了5株除草剂抗性苗,转化率约为1.8%。随着从授粉到转化操作的时间延长,转化率逐渐升高,授粉后12～18h转化的转化效率最高,达到4%,之后转化率很快降低,从21h的2.7%降到24h的0.3%,而27h后转化的效率率为0。据此确定授粉后12～18h为甘蓝型油菜最佳的转化时间。这一时间与花粉管发生向胚囊转折的时间相吻合。转化效率的计算方法为:抗除草剂的转基因幼苗÷处理的雌蕊数×100.2)探索了最佳的雌蕊/柱头的切除方式。结果发现,当花柱被切除一半时,结实率居中,但转化率最高(3.8%);切柱头的一半时结实率最高,转化率仅1.8%;花柱全部切除时结实率最低,转化率也只有0.9%。因此,平衡结实率和转化率,确定花柱切除一半为最佳切除方式。3)探索了最佳的外源DNA溶剂种类。实验以植物表达载体pGreen0229为bar基因供体,分别以0.1×SSC+10mMCaCl2、0.1×SSC、0.5×SSC和1×SSC为溶剂。结果发现,以0.1×SSC+10mMCaCl2为溶剂结实率最高(每角果13.9粒),但转化率仅0.4%;而以0.1×SSC为溶剂结实率最低(每角果11.2粒),转化率最高,为5.4%。平衡结实率和转化率,确定以0.1×SSC为载体溶剂最佳。4.抗除草剂转基因植株的分子验证。分别用PCR和Southern杂交的方法验证抗除草剂植株,并用Southern杂交方法检测外源基因插入的拷贝数。结果表明,每株被测转基因油菜都能扩增到与质粒对照相同的预期条带,而非转基因阴性对照则没有扩增产物。Southern分析显示,转化植株的基因组DNA中均有bar基因插入。5.转基因的遗传和表达。对转基因油菜7个株系自交后代T2、T3进行调查,发现外源基因bar T2代多数株系表现为一对基因的3:1分离,回交后代按1:1分离,与Southern杂交结果一致。T3代可以稳定遗传。正反交结果显示:除草剂抗性表型在供试株系杂种中主要按1:1的比例分离,表明雌蕊原位转化获得的转基因油菜没有细胞质遗传特点。通过构建植物表达载体pGrGUS用于转基因表达的研究发现,甘蓝和甘蓝型油菜转化植株均能够正确表达外源基因GUS。分析转化后的幼嫩种子发现,GUS在种子胚和部分种子的胚乳中均有表达。由于胚和胚乳分别由受精卵和极核细胞发育而来,因此推测受精卵和极核都可能是转化受体,而受精卵更容易被转化。6.雌蕊原位转化法具有物种和品种基因型的非依赖性。依据花粉管生长的特点,将白菜的转化时间调整到授粉后6h,甘蓝及甘蓝型油菜品种的转化时间调整到授粉后15～18h。经除草剂筛选、PCR和Southern鉴定后验证转基因植株。结果表明以中双9号为模式建立起来的雌蕊原位转化体系可适用于2个白菜、2个甘蓝及6个甘蓝型油菜供试品种的基因转化。快生油菜转化率为16.3%,黄籽沙逊转化率为10.3%,绿宝芥蓝为2.7%,甘蓝型油菜品系583为3.1%。7.雌蕊原位转化法创造的突变体。目前从已筛选到的转基因油菜植株及其后代中,发现具有重要农艺性状突变的变异材料,突变包括种子颜色、脂肪酸组成、雄性不育。其中转基因雄性不育突变体油菜05-84,经PCR验证、除草剂涂抹和育性观察,其不育性状与外源bar基因共分离,因此其不育性可能由转基因插入引起。其它突变还包括多个油脂成份改变的突变体、黄籽和叶毛增多等突变体。这些突变体经自交繁殖获得了T2和T3代,突变性状稳定遗传。研究表明本文的转化方法可用于创建突变材料和新种质。
赵恒[5]2018年在《甘蓝型油菜CRISPR/Cas9编辑体系的构建及其对BnSVP的编辑效果》文中指出油菜,属十字花科芸薹属一年生或越年生草本植物,有白菜型油菜(Brassica rapa L.,AA,2n=20)、芥菜型油菜(Brassica juncea L.,AABB,2n=36)和甘蓝型油菜(Brassica napus L.,AACC,2n=38)3个栽培类型,是我国四大油料作物之一,也是世界第叁大经济作物。甘蓝型油菜因其抗病虫性好、产量高等特点已成为我国各大油菜主产区的主要栽培类型。CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现对基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能的改变或丧失,为探讨特定基因的生物学功能提供了新的技术和手段。本研究以甘蓝型油菜品种中双11号为研究材料,探讨了影响其子叶柄和下胚轴再生的诸多因素,构建了多个靶向SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)同源基因(BnSVP)的CRISPR/Cas9植物表达载体,并利用原生质体瞬时表达系统对其编辑效率进行了检测和评估,获得的主要结果如下:1.为获得中双11号的高效再生体系,本研究分别对影响子叶柄和下胚轴外植体愈伤诱导和分化的碳源、AgNO_3、激素组合及浓度、愈伤诱导时间等因子进行了探讨。结果表明,5日龄的下胚轴以葡萄糖为碳源,置MS+1.0 mg/L 2,4-D培养基诱导培养7天后,转分化培养基MS+3.0 mg/L 6-BA+2.5 mg/LAgNO_3培养,可获得较高的芽再生频率为55%;5日龄的子叶柄以葡萄糖为碳源,置MS+l.5 mg/L2,4-D培养基诱导培养7天后,转分化培养基MS+4.0 mg/L 6-BA+2.5 mg/L AgNO_3培养,可获得较高的芽再生频率达70%。2.通过对中双11号基因组序列进行同源搜索,共获得了4个BnSVP同源基因序列。在序列比对结果的基础上,应用CRISPR-P 2.0软件设计了12条特异sgRNA种子序列,并以pYLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以AtU3b或AtU3d为sgRNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sgRNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。3.以中双11号7日龄子叶原生质体为受体材料,选取了其中2个同时靶向4个BnSVP基因的双靶点CRISPR/Cas9编辑载体进行了转染和瞬时表达分析。采用巢式PCR技术,获得了位于A4、A9和C4上BnSVP的扩增产物。测序结果表明,BnSVP.A4在T3靶点PAM上游第4位碱基出现了转换(A→G),导致了一个天冬氨酸(D)向甘氨酸(G)的转变,其编辑效率约为33.33%。
王贺一[6]2007年在《农杆菌介导白芥防御素基因转入甘蓝型油菜的研究》文中研究说明油菜(Brassica napus L．)属于十字花科芸苔属，是世界四大油料作物之一，在全球产量中处于第叁位，仅次于大豆和棕榈油。近年来，真菌等病害造成了油菜产量和品质的大幅下降，而消除病害所需要的农药投入巨大，同时造成了严重的环境污染。如能通过对油菜进行转基因改良，使其自身具有良好的抗病害能力，将具有重要的经济价值和环保意义。植物防御素(Rlant defensins)是一种存在于多种植物中的小分子(45-54氨基酸)碱性多肽。其保守的含有8个Cys，而形成4个二硫键。因其与动物防御素同源而得名。植物防御素具有广谱高效的抗微生物活性，能有效的杀灭G+、G-、某些真菌、螺旋体、被膜病毒等微生物，而对植物细胞没有伤害，是植物先天性非特异性免疫的重要组成部分。2005年罗勤等从十字花科植物白芥种子中成功地克隆了编码植物防御素的基因，在原核表达载体GTK中对白芥防御素基因进行了融合表达，并通过花序浸染法转入拟南芥中进行表达，以研究防御素基因功能。本研究以甘蓝型优质高产杂交油菜新品种“蜀杂九号”恢复系材料84100-18(Brassica napus L．)为实验材料，以下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌EHA-105的介导，将其携带的白芥防御素基因(Sad)转入油菜中，经共培养、抗生素筛选、生根获得了高抗性转化植株。对所获得的转化植株进行了PCR检测结果表明，外源的Sad基因已经整合入油菜基因组中。论文还对影响农杆菌介导法转化效率的主要因素进行了分析讨论。主要实验结果如下：1．通过对比观察外植体的诱导及分化情况，建立并优化了油菜植株的再生体系。试验表明：下胚轴的分化频率高于子叶且离生长点0.5-1cm的下胚轴切段最高；菌液稀释至OD_(600)0.5，浸泡时间1min，共培养2d；农杆菌再悬浮液与共培养基中加入20mg／L乙酰丁香酮可提高转化频率；AgNO_3可提高下胚轴芽的分化率；MS+2mg／L6-BA+1mg╱L 2，4-D时芽的分化率最高；卡那霉素起始选择浓度为10mg／L。2．用含有Sad基因的植物表达载体pBI121-Sad的根癌农杆菌转化油菜，对各项转化条件进行优化，确定了农杆菌EHA105转化油菜外植体的最佳条件。确定用植株再生的最佳培养基分别为：Ⅰ无菌苗培养基：MS基本培养基Ⅱ预共培养基：MS+2mg╱L6-BA+1mg╱L 2，4-D+2.5mg／LAgNO_3+19.62mg／LAsⅢ筛选培养基：MS+2mg／L 6-BA+2.5m╱LAgNO_3+500mg╱L Carb+10mg／L KanⅣ生根快繁培养基：1／2MS+0.15mg／LNAA+250mg╱LCefⅤ摇菌培养基：LB+40mg╱LRif+20mg╱LStr+50mg／LkanⅥ重悬培养基：MS+19.62mg╱L As3．转化后经卡那霉素筛选获得了油菜抗性苗，通过PCR验证，初步证明得到了含外源Sad基因的转基因植株。
杨广东[7]2002年在《基因工程改良几种重要蔬菜的抗虫性》文中认为大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)、甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)和辣椒(Capsicum annuum L.)是我国重要的叁种蔬菜。目前，人们对无公害蔬菜的要求愈来愈强烈，在蔬菜生产中少有或不用化学药剂已成为世界农业关注的焦点。但是近年来菜青虫、小菜蛾、蚜虫等对十字花科蔬菜以及茄二十八星瓢虫、烟青虫、棉铃虫等对茄科蔬菜的危害有愈演愈烈的趋势，这使得生产中所施用化学杀虫剂的种类和数量也不断增加。化学杀虫剂不但杀死了害虫，同时也杀死了有益昆虫，破坏了自然生态平衡，其在自然界中的残留以及在食物链中的积累造成了严重的环境污染。由于在已有的种质资源中找不到可利用的抗虫材料，使得这几种蔬菜的常规抗虫育种受到了限制。利用基因工程技术手段培育抗虫蔬菜新品种是农业发展的一个重要方向，与传统的害虫防治相比，基因工程不仅具有选择性强、使用安全、投资少和见效快的优点，而且对于植物的保护具有连续性、全面性。 高效稳定的遗传转化体系的建立是获得转基因大白菜、甘蓝和辣椒的前提条件。实验研究了不同激素种类和添加物、不同基因型、不同苗龄和不同类型的外植体、预培与否、工程菌液浓度、侵染时间、共培养基pH值和共培养基中去掉微量元素Co~(2+)以及卡那霉素和头孢霉素浓度、添加乙酰丁香酮与否和添加时间等对大白菜、甘蓝和辣椒转化频率的影响，并对各影响因子进行了优化，初步建立了一套大白菜、甘蓝和辣椒高效稳定的遗传转化体系，使大白菜带柄子叶最高转化频率可达5.74％，甘蓝带柄子叶和下胚轴转化频率可达到3.17％和5.21％，辣椒的转化频率最高为16.5％。 利用根癌农杆菌法将Bt基因、修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)、雪花莲外源凝集素基因(gna)等单价抗虫基因以及Bt-cpti融合蛋白基因和Bt-cpti-gna叁价抗虫基因导入了大白菜，甘蓝和辣椒中，同时经基因枪轰击将Bt-cpti融合蛋白基因导入大白菜和甘蓝茎尖，并获得了卡那霉素抗性植株。再生植株分别经PCR、PCR-Southern、Southernblotting杂交证实，外源抗虫基因已经整合到大白菜、甘蓝和辣椒的基因组染色体中；Northern blotting杂交证实，外源基因(Bt、sck和gna)在转基因植株体内已正常进行了转录；胰蛋白酶抑制剂活性和凝集素凝血活性分析也表明sck基因和gna基因在植株体内已正常表达，并具有一定的生物活性。研究发现，大白菜，甘蓝和辣椒转sck基因、Bt基因和gna基因的部分植株中检测不到外源目的基因的转录产物或转录产物强弱差别很大；胰蛋白酶抑制剂和凝集素凝血活性分析证明转sck基因大白菜、甘蓝和辣椒的不同植株，其CpTI相对表达量存在较大差异，部分植株的表达量与对照相似甚至还低于对照；转gna基因的部分大白菜和辣椒植株没有凝血活性或仅有很弱的凝血活性，这表明这些基因在转基因植株体内发生了基因失活现象，转录前失活和转录后失活都有发生。大白菜和甘蓝转基因植株与非转化对照相比，除自交结实率低外，其他性状如花期、株型、种子千粒重等没有差异，而且自交结实率低的原因是由组培因素造成；辣椒转基 博士论文 摘要 因植株与对照在农艺性状方面没有差异。公 菜青虫和棉铃虫室内喂饲转Sob基因、Bt基因、Bt－Cpri融合蛋白基因和B仰ri侧 叁价基因的大白菜、甘蓝和辣椒植株叶片的结果表明，转基因植株具有一定程度的抗性， 室外自然抗虫性观察也证实部分转基因植株具有较高的抗虫性。室内和室外蚜虫抗性实 验证明转聊基因和BtCp打哪口叁价基因的大白菜、甘蓝和辣椒植株具有一定的抗蚜性， 大白菜最高抑制蚜虫率在 32．6％，甘蓝最高为 39．5％。研究发现，不同基因转化而来的 转基因植株之间以及同一基因转化而来的转基因植株之间抗虫性差异很大，大白菜和甘 蓝转＊仁…融合蛋白基因和m基因的再生植株抗虫性高于转SCk基因的植株，转 Bt－Cp打o叁价基因的辣椒植株在所有转基因植株中抗虫性最好。抗虫性分析证实，转 SCk基因的大白菜、甘蓝和辣椒植株的抗菜青虫能力与其体内CpTI含量存在着一定的相 关关系。在质粒pC肚SBCK－OMGNA中由叁个重复的章鱼碱合成酶基因＊CS）上游增强 序列及甘露碱合成酶基因（MAS）启动子组成的高效复合OM启动子驱动下的聊基因 比在质粒pBinGNA中由 CaMV 355启动子驱动的岁叨基因更高效地表达，这在转 Bt－Cpn侧叁价抗虫基因的大白菜或甘蓝植株中有部分植株的抗蚜性极明显高出转卵”基因植株得到体现。 以“GPllS刀7”和“ZB七－04”二个转Sob基因大白菜飞代株系为实验材料，研究 了新霉素磷酸转移酶基因（叩＊）和修饰的虹豆胰蛋白酶抑制剂基因bCk）在L代的 遗传规律及表达特性。结果表明：转SCk基因大白菜TI代植株经卡那霉素室内种子筛选、 室内叶片筛选以及室外叶片筛选等均证实叩ill基因可以稳定遗传和表达，其中 “GPll．S．07”株系中卡那霉素抗感比为4．26－
崔磊[8]2009年在《Bt cry1Ia8抗虫基因对结球甘蓝的转化及其表达》文中指出近年来随着结球甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata L.)的大面积种植,虫害日趋严重,其中以鳞翅目的菜青虫(Pieris rapae)和小菜蛾(Plutella xylostella)等为主。常用的化学防治措施不仅污染环境,且害虫容易产生抗药性,因此,选育和应用抗虫品种,既经济有效又安全环保,是害虫防治最理想的方法。cry1Ia8杀虫晶体蛋白基因是由中国农业科学院植物保护研究所从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的野生菌株Btc008中克隆得到的一种具有较高杀虫活性的晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICPs)。它是一类特殊的cry1类基因,与生产中常用的cry1类基因没有同源性。cry1Ia8基因经过密码子优化后,人工合成了新的序列,并将其转入大肠杆菌,体外原核表达的生物活性测定结果表明:Cry1Ia8蛋白有较强的杀虫活性和相对较广的杀虫谱,对玉米螟、小菜蛾等具有高毒力,但与Cry1A类蛋白没有交互抗性。本文以甘蓝自交系材料CA21-3和CB24-5进行再生体系的优化:5 d苗龄的外植体再生频率最高;比较理想的外植体为21-3的下胚轴和24-5的具柄子叶;激素浓度为6-BA 2 mg/L和NAA 0.1 mg/L时不定芽的再生频率较高;在培养基中添加银离子可以减轻甘蓝外植体的褐化,促进不定芽的再生,硫代硫酸银比硝酸银效果更好。以植物重组质粒表达载体pCS1Ah(含Bt cry1Ah基因)转化甘蓝,优化了农杆菌介导的遗传转化体系:10 mg/L的卡那霉素浓度可有效筛选出转化植株;而在侵染中添加乙酰丁香酮,对甘蓝转化频率无显着影响;同时对农杆菌的侵染时间进行了优化,结果表明以8 min为最佳;经优化后的平均基因转化频率提高到了16.13%。本研究以结球甘蓝的下胚轴和具柄子叶为外植体,利用含有Bt cry1Ia8优化基因的植物组成型表达载体pCSIaN,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将抗虫基因导入结球甘蓝中,共获得了38株再生植株;经PCR阳性的有18株;Southern blot阳性植株有11株;RT-PCR阳性植株有10株;Western blot阳性有9株;表明cry1Ia8基因已整合到甘蓝的基因组中并得到有效的表达。用对Cry1Ac敏感和抗的小菜蛾进行抗虫性试验,结果表明部分转基因植株对敏感和抗性小菜蛾都具有一定的抗性。
陈石头[9]2004年在《榨菜高效再生体系的建立及其遗传转化影响因子的研究》文中指出本文以榨菜(Brassica juncea Czern. et Coss. var. tumida)‘浙桐1号’、‘浙桐3号’、‘浙桐4号’和‘种都榨菜’4个品种为材料，研究了影响榨菜离体植株再生的一些重要因素，并建立了高效的植株再生体系。同时，对农杆菌介导的榨菜遗传转化影响因子也作了一些研究，并初步建立了榨菜遗传转化体系。 以‘浙桐1号’子叶、带柄子叶、子叶柄及下胚轴等外植体为材料，不同激素及其浓度对其分化影响的研究结果表明，在我们筛选的优化培养基中，‘浙桐1号’的4种外植体均能达到较高的分化频率。其中带柄子叶在MS+BAP 2 mg·L~(-1)+NAA 0.2 mg·L~(-1)+AgNO_3 4 mg·L~(-1)+蔗糖3％+琼脂0.8％的最佳培养基中分化频率最高，达到了100％；在优化培养基中分化频率最低的下胚轴也达到了60.7％。此外，研究结果还表明，不同类型外植体在添加BAP+2,4-D的培养基中，其再生能力相差很大；而在添加BAP+NAA的培养基中虽也存在差异，但各种外植体的分化频率都很高。在筛选培养基的同时，我们还观察到不同苗龄的外植体其再生频率呈显着性差异，但不同外植体的最佳接种苗龄不同，4 d的子叶分化能力最强，而其它外植体的最佳苗龄均为5～6 d。 通过培养基的各种成分对榨菜再生体系影响的研究，发现AgNO_3能显着地促进外植体的分化，4～6 mg·L~(-1)的浓度为最佳；而升高琼脂浓度，则表现为抑制外植体分化，但能减轻玻璃化现象。 在建立了高效再生体系的基础上，以下胚轴为外植体，预培养3～4 d，菌液浓度为OD_(600)=0.5，侵染10～15 min，共培养4 d，壮观霉素浓度为5 mg·L~(-1)时，抗性芽分化频率高达4.0％。不同类型外植体，其转化频率差异很大，以子叶和带柄子叶为外植体时，并未得到任何抗性芽；以子叶柄为外植体时，也只能得到一些抗性愈伤组织。 以质粒载体上的CaMV35S启动子两端序列设计特异引物，对在分化培养基上筛 摘要选20天后的抗性芽进行检测结果表明，外源基因已整合到榨菜基因组上。抗性芽阳性率达80%以上。
刘冰江[10]2016年在《离体雌核发育诱导洋葱单倍体与分子标记开发》文中研究表明洋葱(Allium cepa L.,染色体数2n=2x=16)是百合科(Liliaceae)葱属(Allium)二年生蔬菜,在世界范围内栽培广泛,其年生产量和生产面积居于世界蔬菜生产的第叁位。我国种植洋葱的历史虽然较短,但是发展迅速,在全国各地广泛栽培,是重要的出口创汇蔬菜。洋葱是典型的异花授粉蔬菜,自交衰退严重。传统育种方法育成优良的自交系需要6~10年的时间,而通过单倍体途径在较短时间内就可以选育出整齐一致的纯系,明显提高选择效率。此外,单倍体加倍获得的双单倍体可作为重要性状的遗传分析、分子标记及数量性状研究的理想材料。本研究以不同来源的中日照型洋葱自交系、常规种、杂交种为材料,通过离体雌核发育途径诱导培养洋葱花蕾,对适宜培养基的筛选、培养程序优化、植株再生、染色体倍性鉴定、染色体加倍技术、分子标记鉴定等进行了研究。利用获得的洋葱不育双单倍体、可育双单倍体以及二者杂交获得的F1,采用SLAF-seq技术进行测序,获得多态性SLAF标记,并开发出大量特异性SNP位点。主要结果如下:1.以引自日本的3个中日照型洋葱杂交种的花蕾为外植体材料,研究了2,4-D和6-BA浓度及配比对单倍体诱导培养的影响。结果表明,含有1.5 mg·L-1 2,4-D+1.5 mg·L-1 6-BA和2.0 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1 6-BA的B5培养基适于胚的诱导,诱导率最高达到4.00%。2.对洋葱花蕾的诱导培养程序进行了优化研究,结果表明不同花蕾大小对洋葱的离体雌核发育有很大影响。直径2.1~3.0 mm的花蕾离体诱导培养时成胚率明显低于其它直径的花蕾。直径3.1~4.0 mm的花蕾诱导成胚率最高。‘地球’的花蕾经低温预处理1 d后成胚率明显增高,预处理3 d后胚的诱导率开始明显下降。而‘大宝’的花蕾经低温预处理1 d后成胚率没有显着变化,预处理3 d后胚的诱导率明显下降。3.不同基因型洋葱雌核发育胚的诱导率存在很大差异。本试验供试的9个洋葱基因型中胚的诱导率最高的是杂交种‘地球’,诱导率为4.67%,其次为‘大宝’和‘阿盾’,诱导率分别为4.33%和4.00%,没有显着差异。2个常规种‘天正红玉’和‘天正黄金’分别诱导出了6枚和8枚胚,诱导率显着少于其他基因型。2个自交系503和217分别诱导出13枚和10枚胚,诱导率显着大于常规种,但显着少于5个杂交种。总的来说,杂交种的胚诱导率大于自交系,自交系的诱导率大于常规种。4.将所获得的雌核发育胚转移至含有30 g·L-1蔗糖的1/2B5+0.5mg·L-1NAA培养基中,5d后即可发育成正常植株。利用流式细胞仪对所获得的再生植株进行dna相对含量测定,结果显示正常二倍体的样品分离峰出现在140相对荧光强度中,据此断定分离峰出现在70荧光强度的为单倍体材料。为进一步验证再生植株的倍性,对通过流式细胞仪鉴定过的植株再进行根尖染色体计数分析,结果表明经鉴定为二倍体的植株染色体数为2n=2x=16,鉴定为单倍体的染色体数为n=x=8,与流式细胞仪的鉴定结果完全吻合。5.研究了秋水仙素不同浓度、不同处理时间对单倍体植株染色体加倍效果的影响。结果表明,在处理时间相同的情况下,随着秋水仙素浓度升高,再生植株的存活率降低,但二倍体率增加;在相同秋水仙素浓度下,随处理时间延长,植株的成活率下降,但二倍体率增加。浓度为200mg·l-1的秋水仙素处理48h,对两个供试品种的染色体加倍效果最好,成活率分别为61.11%、50.00%,加倍率分别为44.44%、38.89%。6.利用dnf-566、rns-357和acskp1标记对部分再生植株进行了检测。‘阿盾’的11株再生植株均为纯合的msms或msms,‘地球’的15株再生植株中在ms位点的基因型均为纯合的。‘大宝’的16株再生植株中,有13株在ms位点的基因型均为纯合的,3株是杂合的。7.生根良好的再生植株经驯化、炼苗后,移栽到试验基地网棚,绝大多数再生植株成活,形态正常,生长发育良好。洋葱单倍体植株矮小、细弱,开花期与二倍体洋葱植株基本一致,但抽生花薹矮小。整个花序较小,花蕾数少而且小。花药小,没有花粉。双单倍体植株性状表现符合二倍体特征,能正常开花。经分子标记鉴定为msms基因型的双单倍体植株育性正常,而鉴定为msms基因型的双单倍体植株表现为雄性不育。育性正常的双单倍体植株开花后套袋,放入苍蝇授粉自交,获得了发育饱满、发芽力强的自交种子。对不育双单倍体植株,利用其作为母本与可育双单倍体杂交,获得了f1代种子。8.以获得的可育双单倍体dh-17、不育双单倍体dh-1及部分f1代单株为材料,利用基于简化基因组深度测序的slaf-seq技术,选择洋葱转录组作为参考进行电子酶切预测,最终确定使用pvuii+scai酶切。将南芥的测序读长与参考基因组的比对结果显示双端比对效率为80.60%,大部分测序读长的插入片段长度都在范围之内,表明建库质量良好。通过测序共获得125.98m读长,各样品所获读长数量在29736~30825419范围内。所有样品的测序质量值q30均大于80%,说明测序碱基错误率较低,所获数据合格。测序获得平均gc含量为35.77%,而且含量比较平均,说明达到了测序要求。对满足质量要求的测序数据进行聚类分析,共开发出各类型标签294911个,其中多态性SLAF标签14776个,仅占SLAF标签总数的5%。根据基因型编码规则对筛选出的多态性标签进行基因型编码,共得到可编码8种基因型的标签6384个,其中5354个多态性标签符合aa×bb类型,占可编码标签的83.86%。利用多态性标签进一步进行SNP位点的开发,共得到36109个群体的SNP。样品亲缘关系鉴定结果表明异常标签数目所占比例均远远小于0.5%,由此可以判定样品F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5均为DH-17和DH-1的子代。
参考文献：
[1]. 结球甘蓝离体遗传转化体系的建立及转FOC1基因植株的获得[D]. 刘洁. 甘肃农业大学. 2016
[2]. 甘蓝组织培养再生、转化及筛选系统的优化研究[D]. 王慧芳. 山西农业大学. 2004
[3]. 油菜安全高效转化体系研究[D]. 邹智. 中国农业科学院. 2008
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[6]. 农杆菌介导白芥防御素基因转入甘蓝型油菜的研究[D]. 王贺一. 四川大学. 2007
[7]. 基因工程改良几种重要蔬菜的抗虫性[D]. 杨广东. 浙江大学. 2002
[8]. Bt cry1Ia8抗虫基因对结球甘蓝的转化及其表达[D]. 崔磊. 中国农业科学院. 2009
[9]. 榨菜高效再生体系的建立及其遗传转化影响因子的研究[D]. 陈石头. 浙江大学. 2004
[10]. 离体雌核发育诱导洋葱单倍体与分子标记开发[D]. 刘冰江. 山东农业大学. 2016
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