张莉[1]2003年在《山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建》文中指出当前畜牧业生产中所使用的卵泡刺激素(FSH)产品都是从牛、羊、猪等家畜的脑垂体中直接提取的，由于材料来源有限、纯度差且常有其它激素的污染，影响了FSH的广泛应用。用基因工程方法可大量生产高纯度的FSH，降低生产费用，这对畜牧业生产具有重要意义。 本试验是从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板，PCR扩增目的基因片段，分别获得长为360bp的山羊FSH-α亚基DNA片段和长为390bp的山羊FSH-β亚基DNA片段，与预期的目的基因片段大小一致。将它们分别克隆至pMD 18-T，随机挑选几个阳性重组子进行测序。将测序结果与绵羊等多种哺乳动物该基因及相应的氨基酸进行同源性比较、分析。结果显示山羊FSH-α、β亚基基因及其各自对应的氨基酸与其他哺乳动物的同源性都非常高，一般均在80％以上，验证了在同一种内，甚至在所有的哺乳动物中FSH-α亚基是极为保守的；而FSH-β亚基尽管具有种属特异性，但也是相当保守的。将所得的山羊FSH-α、β亚基基因分别用加相应限制性内切酶酶切位点的引物大量扩增，回收后与pMD 18-T连接，筛选出阳性重组子，大量双酶切回收获得带粘性末端的山羊FSH-α、β亚基基因，将它们分别与同两个酶大量双酶切回收获得的带粘性末端的PF质粒进行连接，筛选阳性重组子。依此方法分别构建了FSH单亚基真核表达载体gFSH-α-PF、gFSH-β-PF和FSH双亚基真核表达载体gFSH-α-β-PF、dFSH-α-gFSHβ-PF。 本研究首次进行了山羊FSH的基因克隆、序列分析及表达载体构建方面的探索，填补了国内外重组山羊FSH基础研究的空白，为今后重组山羊FSH的大量生产应用提供了理论基础和实验依据。
彭甲银[2]2016年在《奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3基因的表达调控及功能研究》文中研究表明基质金属蛋白酶(MMPs)在卵泡发生、发育、排卵和黄体形成等生物过程中发挥着重要的功能。TIMP3作为MMPs的抑制剂可能参与卵泡周期中各生命活动间的相互协调,而关于TIMP3在奶山羊卵泡中是否表达,表达规律如何,表达调控信号通路及其表达产物调节卵泡激素合成和颗粒细胞凋亡的分子机制等方面的研究,尚未见报道。本研究以关中奶山羊卵泡及其颗粒细胞为研究对象,在克隆和分析TIMP3基因cDNA序列的基础上,分析TIMP3在卵泡周期中的表达规律,探究LH/hCG和mi RNA对TIMP3基因表达、TIMP3基因表达产物对卵泡激素合成、胞外基质重构和颗粒细胞凋亡等生物过程相关基因表达的分子调控机制,以及TIMP3基因表达产物对颗粒细胞凋亡的影响,阐明TIMP3基因在卵泡周期中的生物功能,主要获得以下研究结果:1.TIMP3基因cDNA的克隆及其序列的生物信息学分析采用RACE技术从奶山羊卵巢中获得TIMP3基因的cDNA,通过测序和序列分析发现:奶山羊TIMP3基因cDNA序列全长2208 bp,其中5'非翻译区(5'UTR)长348 bp,CDS区长636 bp(编码211氨基酸的蛋白),3'UTR长1224 bp;预测的氨基酸序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和大鼠的序列的相似度分别为100%、99%、100%、99%、97%和96%;蛋白质结构预测发现其蛋白质由一个N端结构域和一个C端结构域构成,其中每个结构域中包含6个保守的半胱氨酸残基。2.TIMP3基因在奶山羊卵泡周期中的表达规律分析通过Real-time PCR分析发现,TIMP3基因在奶山羊各组织中的表达存在差异,其中在输卵管中的相对表达量最高;在卵泡中,TIMP3基因mRNA的丰度随着卵泡的发育成熟逐渐升高,且在黄体中达到最高;比较分析发现,TIMP3在多羔奶山羊(连续3胎每胎产羔3-4只)卵巢组织中的表达量显着高于单羔奶山羊(连续3胎每胎产羔1-2只),显示TIMP3基因与奶山羊产羔数可能密切相关。3.LH/hCG对TIMP3基因表达的分子调控机制分析采用hCG对培养的颗粒细胞进行处理,Real-time PCR分析发现,TIMP3基因mRNA的丰度分别在处理后4 h和24 h出现峰值;Western Blot分析发现,TIMP3蛋白丰度随着处理时间延长而增加,24 h时达到最大;采用抑制剂进行阻断分析,发现hCG诱导的TIMP3的增加受PKA,PKC,MAPK和PI3K信号通路的影响。进一步对TIMP3基因转录调控区进行分析,发现TIMP3基因上游-1至-122bp的区域内,包含3个Sp1结合位点,定点突变分析,发现-67~-58和-74~-65的突变明显降低TIMP3的转录;采用cAMP激活剂FSK处理颗粒细胞,促进Sp1表达,发现TIMP3转录增强,该结果与EMSA,ChIP以及Sp1过表达和沉默分析相一致,由此确定cAMP通过调节转录因子Sp1来调节TIMP3表达。4.miRNA对TIMP3基因表达的分子调控机制分析依据生物信息学分析的结果,构建荧光素酶报告载体并与miRNAs共转进颗粒细胞中,发现miR-21,miR-221,miR-222和miR-181b均显着的抑制了荧光素酶的活性;采用Real-time PCR分析发现,与NC组相比miR-21和miR-181b显着减少了颗粒细胞中TIMP3基因mRNA的丰度,而miR-221和miR-222组差异不显着;Western Blot分析发现,与NC组相比miR-21,miR-181b,mi R-221和miR-222都显着减少了TIMP3蛋白的丰度,表明miR-21,miR-221,miR-222和mi R-181b与TIMP3基因3'UTR区特异位点结合,调控TIMP3基因的表达,其中miR-21和miR-181b通过促进mRNA降解调节TIMP3基因表达,而miR-221和mi R-222通过抑制翻译调节TIMP3的表达,且miR-21,miR-221,miR-222和miR-181b可促进颗粒细胞的活力。5.TIMP3基因表达产物对颗粒细胞凋亡和激素合成的分子调控机制分析采用腺病毒介导TIMP3基因过表达和siRNA沉默TIMP3基因表达,发现TIMP3基因过表达可抑制颗粒细胞的活力,促进细胞凋亡;TIMP3下调可抑制hCG诱导类固醇激素合成酶StAR,p450scc,HSD3B基因的表达,降低孕酮水平;同时TIMP3抑制ADAM17基因表达,促进ECM蛋白相关基因FN和DCN基因的表达。以上研究表明,LH/hCG与颗粒细胞上的受体LHR结合,激活cAMP信号通路,促进转录因子Sp1表达,Sp1与TIMP3基因Sp1应答元件结合,促进TIMP3基因表达,TIMP3蛋白通过促进StAR,p450scc,HSD3B基因的表达调节孕酮的合成,促进FN和DCN基因表达调节ECM的重构,抑制ADAM17基因表达,抑制颗粒细胞的活力,促进颗粒细胞凋亡参与卵泡周期的调控。这些研究结果,为进一步阐明TIMP3参与调控卵泡周期的分子机理,揭示卵泡发育成熟和排卵的分子调控机制提供理论和试验依据。
张建肖[3]2010年在《梅花鹿卵泡刺激素原核表达研究》文中进行了进一步梳理卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)广泛用于牛、羊、猪等动物的超排、人工受精等繁殖育种工作中。可通过多种方法获得FSH,但是由动物脑垂体中提取的FSH存在较多问题,如材料来源有限、提取纯化工作费时、费力、质量差、纯度低、常有其它激素的污染等。而采用基因重组技术可大量生产高纯度的FSH,降低生产费用,这对畜牧业生产具有重要意义。本文在导师关洪斌研究的基础上,进一步研究了梅花鹿FSHa/β两亚基基因的克隆和融合表达。本实验首先以原构建的克隆载体为模板,设计引入限制性内切酶EcoR I和XhoⅠ酶切位点的引物,对梅花鹿FSHα／β两亚基基因分别进行PCR扩增,然后将纯化回收的PCR产物与pMD18-T载体连接后,转化JM109感受态菌,通过XhoⅠ和EcoR I双酶切后插入表达载体pGEX-6P-2,重组质粒,将阳性克隆导入E.coli BL21, IPTG诱导表达GST-FSHa/β融合蛋白,最后使用SDS-PAGE进行分析鉴定。本实验最终成功克隆了FSHα亚基基因,PCR产物大小约370 bp,测序结果与GenBank序列一致,成功构建了重组表达载体pGEX-6P-2-FSHa,由IPTG诱导表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量39.3 kD处,出现特异性蛋白条带；FSHβ亚基基因PCR产物大小约400 bp,测序结果与GenBank序列一致,成功构建了重组表达载体pGEX-6P-2-FSHβ,由IPTG诱导表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量39.5 kD处,出现特异性蛋白条带。上述结果说明在E.coli BL21中成功表达了梅花鹿FSHα／β-GST融合蛋白。
李欣钰[4]2013年在《鹅FSH基因的克隆及表达初步分析》文中研究表明促卵泡激素(FSH)基因是动物繁殖性状的一个重要的候选基因,其对家禽的产蛋具有重要的调节作用。本研究利用RT-PCR结合RACE技术,获得了FSH基因的a亚基的CDS序列和β亚基的cDNA全长序列,采用qRT-PCR技术分析了鹅FSHβ基因在不同生殖周期mRNA的表达分析,并利用基因融合技术,探讨了FSH重组体在COS-7细胞中的表达及FSH信号通路中相关基因的表达变化。研究旨在为全面解析鹅FSH基因的结构特征及功能提供了一定的参考,同时也为鹅产蛋性能的改善和提高提供一定的理论依据。1.鹅FSH基因的克隆及序列分析本研究采用RT-PCR和RACE技术扩增了鹅FSHa基因CDS序列和FSHβ基因的cDNA序列,结果表明,鹅FSHa基因CDS全长363bp；鹅FSHβ cDNA全长序列包含16bp 5'UTR、396bp ORF,同时还发现FSHβ3'端UTR存在两个不同的剪接体,其大小分别为518bp和780bp。经生物信息学分析,发现FSHα、FSHβ基因均为亲水性蛋白,且都存在信号肽序列切割位点,推测其都为分泌蛋白。2. FSHβ基因在鹅不同生殖时期mRNA的表达分析选取浙东白鹅和扬州鹅为研究对象,分别采用半定量PCR和qRT-PCR检测了鹅不同组织及不同生殖时期(开产前期、产蛋期(排卵前期,排卵后期)、就巢期)FSHβ mRNA表达变化。RT-PCR结果显示,FSHβ基因在鹅垂体、下丘脑、卵巢、输卵管等生殖相关组织中的表达量较高。qRT-PCR结果表明,在开产前期、产蛋期、就巢期3个不同生殖时期垂体和输卵管FSHβ mRNA的表达量总体上要高于下丘脑和卵巢,且四个组织中FSHβmRNA表达量的变化趋势相同,均表现为先上升后下降,产蛋期达到峰值；产蛋期垂体中FSHβ mRNA的表达量与开产前期相比差异显着(P<0.05),与就巢期相比差异极显着(P<0.01),产蛋期卵巢和输卵管中FSHβ mRNA的表达量与开产前期相比差异均显着(P<0.05),而下丘脑FSHβ mRNA的表达量在3个生殖周期内表达变化差异不显着(P>0.05)；产蛋期扬州鹅与浙东白鹅FSHβ mRNA表达量,只有垂体中存在极显着差异(P<0.01)。3.鹅融合基因FSH在COS-7细胞中的表达通过融合基因技术构建了四种重组FSH质粒,转染COS-7细胞,放免检测12h、24h、36h、48h细胞上清液中FSH蛋白的分泌量。转染pVITRO2-FSHβ、 pVITRO2-FSHβ-CTP的细胞,结果表明CTP序列的增加可以提高FSH蛋白的分泌量,而转染异二聚体、单体质粒的细胞,分泌FSH蛋白的量呈相反的趋势。利用qRT-PCR技术检测转染叁种质粒后,FSH信号通路FSHβ、GnRH、GH、BMP基因在6h、12h、24h、36h、48h,5个时间点的表达量变化,结果表明各基因都存在一定的表达变化趋势。
关洪斌[5]2003年在《梅花鹿卵泡刺激素的基因克隆、表达和活性分析》文中进行了进一步梳理卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)广泛用于牛、羊等动物的超排、人工受精等繁殖育种工作中。可以通过几种方法获得FSH，如从绝经期妇女尿中提取，或从猪、牛、羊等动物脑垂体中提取或采用重组DNA技术生产重组FSH。从绝经期妇女尿中及猪、牛、羊等动物脑垂体中提取的FSH存在严重问题，如材料来源有限、提取纯化工作费时、费力、质量差、纯度低、常有其它激素的污染等。采用基因重组技术生产重组FSH就可解决这些问题。例如解决材料来源问题、简化生产工艺、降低生产成本、批次间差异最小、并且没有其它激素污染、无抗体反应。本文采用RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot、Radioimmunoassy等方法首次研究了梅花鹿FSH的基因克隆、表达和活性分析，结果如下： 1．梅花鹿FSH-α亚基基因是由363个核苷酸组成，编码120个氨基酸。该序列已提交GenBank被接受，序列号为AY066018。将梅花鹿FSH-α亚基基因核苷酸序列与其它动物该序列相比，结果显示梅花鹿与山羊的同源性最高，达到99％，它们之间只有3个核苷酸不同。梅花鹿与豚鼠、狨的核苷酸同源性最低，为83％～84％，有57～59个核苷酸不同。将梅花鹿FSH-α亚基氨基酸序列与其它动物该序列相比，结果显示梅花鹿与山羊的同源性最高，达到99％。它们之间只有1个氨基酸不同。梅花鹿与牛、绵羊、印度水牛的同源性也高达到97％～98％，有3～4个氨基酸不同。从编码FSH-α亚基基因的核苷酸序列来看，在这些比较的动物中，FSH-α亚基基因核苷酸序列是高度保守的。 2．梅花鹿FSH-β亚基基因由390个核苷酸组成，编码129个氨基酸。该序列已提交GenBank被接受，序列号为AY156688。将梅花鹿FSH-β亚基基因核苷酸序列与其它动物相比，结果显示梅花鹿与绵羊、山羊、牛的同源性最高，达到92％～93％，它们之间有24～30个核苷酸不同。梅花鹿与仓鼠、大鼠、褐鼠的核苷酸同源性最低，为81％～82％，有71～74个核苷酸不同。从FSH-β亚基氨基酸序列来看，梅花鹿与绵羊、山羊、牛的同源性最高，达到92％～93％，它们之间有9～10个氨基酸不同。梅花鹿与朱鹮、鹌鹑的同源性最低，为60％～65％，有45～52个氨基酸不同。 3．重组FSH对促进昆明小鼠卵泡发育有一定效果，可促进次级卵泡向成熟卵泡的发育；对雌性未成年昆明小白鼠卵巢增重效果较明显；对促进小鼠子宫重量的增加有一定效果；重组FSH可提高小鼠血清中E_2含量，但不同个体反应不同。
蒋香菊[6]2014年在《绵羊卵泡发育中AMH、FSHR、LHR基因的表达特征分析》文中认为本实验以探索抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)，卵泡刺激素受体（follicle-stimulatinghormone receptor，FSHR）、黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）与卵泡发育相关基因在成年羊及羔羊卵巢中的定位及表达特征，以了解这些基因在绵羊卵泡发育的作用。本文通过分子克隆，RT-PCR定量分析及免疫组织化学等方法，对比分析AMH、FSHR和LHR在羔羊和成年羊卵巢卵泡中的表达模式，探讨这些基因在绵羊卵泡发育中的调控机制。实验分为以下四部分：1绵羊AMH基因的克隆、序列分析与原核表达以绵羊卵泡颗粒细胞为材料，提取总RNA，运用同源序列克隆技术，对绵羊AMH基因的cDNA全长进行克隆及序列分析。根据预测AMH蛋白序列将其氨基末端编码260个氨基酸序列亚克隆至pET15b构建原核表达载体，经IPTG诱导重组表达及鉴定。结果表明：获得绵羊AMH基因cDNA全长1797bp（Genbank No. KC986978），开放阅读框为1728bp，预测编码575个氨基酸，N端24个氨基酸为信号肽序列；蛋白分子与牛的同源性高达95.8%。原核表达获得符合预期大小AMH重组蛋白。2绵羔羊卵巢AMH的免疫组织化学分析以成年绵羊和一月龄羔羊卵巢为材料，利用HE染色观察卵巢的结构特征，免疫组织化学分析AMH在卵泡中的表达特征。结果表明：未经外源激素处理的一月龄羔羊卵巢皮质区存在较多的小的同步发育的有腔卵泡。经外源激素处理后的一月龄羔羊卵巢卵泡全部同步发育至大的有腔卵泡。而对外源激素不敏感一月龄羔羊个体，在卵巢皮质部的边缘布满大量的原始卵泡，初级和次级卵泡数量很少，无有腔卵泡。免疫组化显示AMH存在处于生长期的腔前卵泡和小的有腔卵泡，以及卵丘细胞上，在大多原始卵泡上无AMH的表达，而在原始卵泡向初级卵泡转变，外层的颗粒细胞由扁平向柱状转变时AMH有表达。成年羊与羔羊AMH的表达差异？在体外成熟培养后的卵丘细胞中，AMH在羔羊与成年羊中的表达并无差异。AMH可能参与卵泡发育的启动、向促性腺激素依赖期的转变等过程的调控，其功能作用还有待于进一步深入研究。3绵羔羊卵巢中FSHR免疫组织化学分析及FSHR多种剪接形式克隆鉴定利用免疫组化法检测FSHR在绵羔羊卵巢表达分布特征，和RT-PCR技术克隆鉴定FSHR多种剪接形式。结果表明：FSHR在超排羔羊和正常羔羊卵巢主要表达于卵泡颗粒细胞，且在原始卵泡就有阳性信号存在，正常成年羊在原始卵泡没有阳性信号存，在大的优势卵泡中FSHR的表达量降低。获得绵羊6种FSHR多种剪接形式全长编码区的序列，开放阅读框分别是695aa、694aa、648aa、633aa、595aa、533aa。羔羊卵巢中未发现533aa形式，而成年羊未发现694aa和648aa形式。它们可能与卵泡发育进程有关。4绵羔羊卵巢中LHR免疫组织化学分析通过检测LHR蛋白在羔羊和成年羊卵巢的表达变化，为卵泡的生长发育调控奠定理论基础。采用免疫组化法对绵羊卵巢LHR进行定位染色及Western blot检测相关蛋白。LHR主要在正常羔羊和超排羔羊及成年羊在卵巢大的窦状卵泡的颗粒细胞中高表达，超排羔羊LHR的阳性信号表达比成年羊的阳性性号要高。
石福岳[7]2013年在《家兔促卵泡激素β（FSHβ）基因克隆及表达研究》文中指出促卵泡激素是由动物垂体前叶嗜碱性细胞合成并分泌的一种糖蛋白激素,由a和β亚基组成,而p亚基是激素生物活性和免疫活性的决定因素。促卵泡激素p亚单位由FSHβ基因编码,前人的研究表明,FSHβ基因多态性与动物多产性有密切关联性,该基因是影响动物产仔数的主效基因之一。本研究以新西兰白兔为研究对象,采用基因克隆、原核表达和Real-time PCR等方法研究家兔FSHβ基因的在原核表达系统中的表达情况,制备抗家兔FSHβ多克隆抗体,并对FSHp基因在家兔卵巢、输卵管、子宫、睾丸和输精管等生殖器官中的表达差异进行了分析。主要结果如下：1.本研究参考GenBank数据库中日本大耳兔FSHβ基因的mRNA序列设计了一对引物,对新西兰白兔FSHβ基因进行克隆、序列分析,并将其与其它物种的FSHβ基因CDS序列和编码氨基酸序列进行同源性比较。结果表明,克隆得到的CDS序列与GenBank数据库中的序列完全一致,核苷酸序列与其它哺乳动物的同源性较高(86.4%-89.7%),但与禽类、鱼类的同源性较低,分别为74.1%和53.3%。基于FSHβ基因序列进行系统进化分析,可知家兔与人、黑猩猩的亲缘关系较近,聚类分析结果与生物学分类结果基本一致。2.PCR扩增FSHβ基因去信号肽序列,并成功构建了去信号肽FSHβ基因的原核表达载体pGEX-4T-1-FSHp,经IPTG诱导表达、超声波破碎菌体、SDS-PAGE凝胶电泳检测,得到大小约为42kDa的融合蛋白,而且重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物主要是以包涵体形式存在的,将得到的包涵体融合蛋白纯化后免疫小鼠,分离小鼠血清,得到FSHβ多克隆抗体,对多克隆抗体进行ELISA和Western Blot检测,结果表明抗体的效价为1：256000,特异性较好。3.对FSHP基因在9-23周龄家兔的卵巢、输卵管、子宫、睾丸和输精管等生殖器官中的表达水平进行实时荧光定量PCR检测。结果表明,FSHβ基因在5个生殖器官中均有表达,13周龄各组织间表达量差异不显着(P>0.05),各组织中随周龄的变化FSHβ基因的表达呈现出一定的规律,总体来说,在13～15周龄时表达量均较高。因此,FSHβ基因在其它生殖组织中也可表达,且在初情期前后的表达量最高。
刘海港[8]2013年在《济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ全基因克隆与多克隆抗体的制备及应用研究》文中研究说明济宁青山羊是我国重要的山羊品种资源，具有性成熟早，繁殖率高，四季发情，遗传性稳定，适应性强，肉质鲜美等优良的种质特性，是独特的羔皮品种；沂蒙黑山羊是山东省地方优良肉用品种，但性成熟相对较晚，繁殖率相对较低；二者繁殖性状具有明显的差异。有关两种山羊性成熟、繁殖率、多胎性等生物学特性的遗传差异机制是多年来国内外研究学者关注的科学问题，是否与雌激素受体的表达、分布及其功能存在内在的联系目前尚不完全清楚。但目前有关济宁青山羊和沂蒙黑山羊两种亚型的雌激素受体(ERα/β)基因克隆尚未见报道，另外，由于缺乏对它们进行特异性结合的抗体，也限制了对雌激素受体分布、表达及其功能的研究。本研究旨在克隆济宁青山羊和沂蒙黑山羊雌激素受体基因，分析基因结构和功能特性，进行原核表达，制备多克隆抗体，建立免疫组化分析方法，检测山羊卵巢和子宫内ERs的分布。根据GenBank发布的绵羊ERα和ERβ基因序列设计引物，应用RT-PCR方法从济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢组织中扩增ERα和ERβ基因。经双酶切和测序分析后，连接到原核表达载体pET32a(+)，构建重组表达载体pET32a(+)-ERα和pET32a(+)-ERβ，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定；经Ni-NTA纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并检测抗体效价及特异性；使用该抗体检测济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢和子宫组织细胞中的ERα和ERβ的分布。实验结果显示：1．克隆出济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ基因的全部开放阅读框，长度分别为1791bp和1584bp。分析与其它物种同源性并构建基因进化树，显示雌激素受体基因在物种进化过程中呈现了高度的保守性，比较了两种山羊雌激素受体氨基酸序列及蛋白空间结构差异，ERβ的变异程度较ERα更大。2．成功构建原核表达载体pET32a(+)-ERα和pET32a(+)-ERβ，重组载体可在BL21（DE3）宿主菌中进行高效表达，表达出分子量约为45ku和53ku的融合蛋白；Western blotting证明两种融合蛋白能均能与兔抗人的ERs多克隆抗体特异性反应，制备的多克隆抗体经ELISA检测效价均达到1:214以上，以此抗体代替购置的标准兔抗人ERs抗体，进行Western blotting反应，特异性良好。3．建立了可靠的检测两种亚型雌激素受体分布的免疫组化方法，对济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢、子宫等组织检测结果表明，ERα和ERβ在济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢和子宫的分布情况大致相同。在卵巢成熟卵泡膜细胞、上皮细胞和颗粒细胞以及子宫内膜上皮细胞、腺上皮细胞、平滑肌细胞存在ERα大量分布，而ERβ主要分布于卵巢颗粒细胞和子宫内膜上皮细胞、平滑肌细胞。本研究克隆了济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ基因；获得了特异性兔抗山羊ERs多克隆抗体，使用该抗体建立免疫组化方法检测了济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢及子宫ERs的分布表达，为进一步研究雌激素受体的生物学功能奠定了方法学和形态学基础。
杨志敏[9]2014年在《转猪Kiss1基因和FSHR基因小鼠制备及繁殖性能评估》文中认为亲吻素(Kissl)和卵泡刺激素受体(Follicle Stimulating Hormone Receptor, FSHR)基因对产仔数有显着影响,在家畜繁殖生理学领域占有重要地位。Kissl是公认的下丘脑促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH)上游重要调控因子,在性腺轴系统中起中枢节点的作用,能直接作用于GnRH神经元,刺激GnRH的分泌,激活性腺轴,并且在发情周期内正向调控黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)和卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)的分泌。在雌性哺乳动物中,卵泡刺激素的主要作用是促进性腺发育和维持正常的生殖功能,促进卵巢中卵泡的生长、卵泡颗粒细胞的增生和雌激素的合成与分泌,刺激卵泡细胞上LH受体的产生。它对卵泡生长发育和成熟分化起重要调控作用,直接影响卵泡发育的数量和质量,而FSHR是FSH发挥生理功能不可或缺的重要因素。本文旨在探究Kissl和FSHR基因与繁殖功能之间的关系,以猪的Kissl和FSHR基因为研究对象,将构建的小鼠脑部特异表达的真核载体pCaMKIIa-Kissl和小鼠卵巢颗粒细胞表达的AMH-pFSHR真核载体线性化处理后,显微注射入小鼠受精卵以制备转基因小鼠。通过Southern blot方法统计转基因小鼠阳性率；利用Genome Walking确定外源基因的插入位点；统计转基因阳性小鼠及其后代的产仔数性状,从而验证这两个基因能否促进卵泡发育和成熟,为提高猪的后代产仔数提供新思路。主要实验结果如下：1.利用PCR扩增出猪Kissl基因的CDS区,并将其克隆到pMD19-T载体上。酶切和测序结果显示pMD19-T-Kissl载体构建正确,与公布的猪Kissl基因CDS区同源性达到100%。将Kissl基因插入表达载体pCaMKⅡ,酶切和测序结果表明pCaMKⅡα-Kissl构建正确。2.利用显微注射的方法将线性化处理的pCaMKⅡα-Kissl和AMH-pFSHR片段分别注入小鼠受精卵中,制备转基因小鼠。通过提取基因组DNA,利用PCR法对获得的71只GO代转pKissl基因小鼠检测,发现4只表现为阳性,阳性率为5.63%(4／71)。将PCR阳性个体经过Southern blot鉴定获得4.22%(3/71)的阳性率。43只转pFSHR基因GO代小鼠,通过PCR法检测后获得9个阳性个体,转基因阳性率为20.93%(7/43),随后将PCR阳性个体进行Southern blot验证,最终获得6.97%(3/43)的阳性率。3.利用Genome Walking对获得3个转基因阳性小鼠进行Kissl基因定位分析发现,其中一个个体有两个插入位点。采用同样的方法对3个转pFSHR基因小鼠定位时发现,每个个体都只有一个插入位点。4.将GO代阳性个体与阴性母鼠交配获得F1代小鼠,经过PCR水平的检测,最终确定阳性率为43.05%(65/151)。转pKissl基因的小鼠在F1代表现出产仔数增多的趋势。同期转pFSHR基因F1代阳性个体与阴性种公鼠交配获得F2代小鼠,经过PCR水平检测,最后获得29.33%(22/75)的阳性率。转pFSHR基因小鼠具有产仔数多且后代成活率高的趋势。
张军强[10]2003年在《山羊促卵泡素（FSH）基因cDNA的克隆、序列分析与表达研究》文中研究表明利用RT—PCR技术从山羊脑垂体RNA中成功扩增出促卵泡素(FSH)α和β亚单位cDNA。山羊FSHα亚单位cDNA的阅读框由363个bp组成，编码由120个氨基酸组成的多肽，前24个氨基酸为潜在的信号肽序列，成熟肽由96个氨基酸组成，预测分子量为10.79kDa，其56和82位上存在两个潜在的N—糖基化位点。β亚单位cDNA的阅读框由390个bp组成，编码由130个氨基酸组成的多肽，前18个氨基酸为潜在的信号肽序列，成熟肽由111个氨基酸组成，预测分子量为12.53kDa，其7和24位上存在两个N—糖基化位点。山羊FSHα亚单位与已发表的绵羊、牛、水牛的氨基酸序列同源性分别为100％、97.5％和98.3％，山羊FSH β亚单位与已发表的绵羊、牛和猪的氨基酸序列同源性分别为97.7％、93.1％和93.1％。 将克隆于pGEM-T Easy质粒中的FSH β亚单位基因片段通过PCR扩增获得去信号肽的cDNA阅读框，再将此插入到原核表达载体pGEX-6p-1的谷胱甘肽S—转移酶(GST)基因的下游，获得重组质粒pGEX-6p-1-FSH β。将此重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，通过对重组大肠杆菌菌体的超声波裂解物的SDS—PAGE电泳分析及Western-blot鉴定，结果表明重组菌能满意表达融合蛋白形式的FSH β，即FSH β蛋白与谷胱甘肽S—转移酶相连组成的蛋白质，分子量约为41kDa，与预期大小一致，电泳扫描净灰度达28％。 用粗制的GST-FSH β融合蛋白包涵体作为免疫原免疫雌性ICR小鼠，观察免疫应答反应及其产生的生物学效应。结果表明，大肠杆菌表达的GST-FSH β融合蛋白免疫小鼠制备了针对FSH β的特异性多克隆抗体。免疫组小鼠子宫的生长受到抑制，子宫重与对照组存在显著差异(p＜0.05)。由此表明，针对FSH β的多抗与小鼠体内FSH发生了免疫中和效应。 本实验研究结果，不仅揭示了山羊FSH的分子结构，而且为山羊FSH基因工程产品的研制，及开展山羊FSH免疫与应用研究奠定了基础。
参考文献：
[1]. 山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建[D]. 张莉. 东北农业大学. 2003
[2]. 奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3基因的表达调控及功能研究[D]. 彭甲银. 西北农林科技大学. 2016
[3]. 梅花鹿卵泡刺激素原核表达研究[D]. 张建肖. 山东大学. 2010
[4]. 鹅FSH基因的克隆及表达初步分析[D]. 李欣钰. 江西农业大学. 2013
[5]. 梅花鹿卵泡刺激素的基因克隆、表达和活性分析[D]. 关洪斌. 东北农业大学. 2003
[6]. 绵羊卵泡发育中AMH、FSHR、LHR基因的表达特征分析[D]. 蒋香菊. 石河子大学. 2014
[7]. 家兔促卵泡激素β（FSHβ）基因克隆及表达研究[D]. 石福岳. 扬州大学. 2013
[8]. 济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ全基因克隆与多克隆抗体的制备及应用研究[D]. 刘海港. 山东农业大学. 2013
[9]. 转猪Kiss1基因和FSHR基因小鼠制备及繁殖性能评估[D]. 杨志敏. 扬州大学. 2014
[10]. 山羊促卵泡素（FSH）基因cDNA的克隆、序列分析与表达研究[D]. 张军强. 扬州大学. 2003