禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡脾脏mRNA与miRNA表达规律的研究

论文摘要

禽网状内皮组织增生症病毒（REV）是引发禽网状内皮组织增生症（RE）的病原。RE是一种对禽类危害严重的肿瘤病和免疫抑制病,与马立克病（MD）和禽白血病（AL）并称为三种危害禽类的病毒性肿瘤病。在宿主与病原相互作用过程中miRNA起着重要的作用,大多数miRNA基因位于与肿瘤形成密切相关的脆弱基因位点,在肿瘤发生发展的多个环节中发挥着类似肿瘤癌基因或抑癌基因的关键性作用,研究并分析REV感染细胞内源性miRNA对进一步揭示REV致病的分子机理、发掘细胞抗REV分子靶标具有重要的理论意义与应用前景。鉴于此,本研究利用SPF鸡人工感染模型,选择脾脏组织作为研究对象,因为脾脏是鸡重要的外周免疫器官,是成熟T、B淋巴细胞的定居和免疫应答场所。采用高通量测序技术以及qRT-PCR检测方法,通过鉴定免疫致病相关的主要差异mRNA和miRNA,初步探讨了REV与鸡体在miRNA调控水平上的相互作用。主要研究内容如下:1.本研究使用REV-SNV标准株腹腔注射1日龄SPF雏鸡。分别在7、14、21、28、35和42dpi采集三种主要的免疫器官（脾脏、胸腺和法氏囊）,观察临诊症状、记录眼观病变并计算免疫器官指数。结果表明,REV感染SPF鸡后,与对照组相比,感染组雏鸡出现精神萎靡,羽毛凌乱且稀少,食欲减退,体重减轻等症状。剖检见法氏囊和胸腺萎缩、脾脏肿大,同时法氏囊和胸腺指数下降、脾脏指数升高。2.根据REV的gag基因保守序列设计一条特异性探针及引物,建立了TaqMan探针qRT-PCR检测方法。结果显示标准曲线线性关系良好,线性回归方程为Y=-3.4171X+41.92,相关系数R2=0.9965;特异性良好,仅能检测REV,无交叉反应现象;敏感性良好,最小检出模板浓度约为10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;重复性良好,批内、批间变异系数均小于2%。应用该方法,对7、14、21、28、35和42dpi脾脏、胸腺和法氏囊的病毒载量与前病毒载量进行检测,结果表明,在每个时间点均能检测到病毒RNA与前病毒DNA。脾脏、胸腺和法氏囊（前）病毒载量整体趋势一致,均在28dpi检测到最低的（前）病毒载量。除法氏囊在21dpi检测到最高的（前）病毒载量外,脾脏和胸腺均在14dpi检测到最高的（前）病毒载量。3.选取7、14和21dpi的脾脏组织样品,利用高通量测序技术对两组样品进行转录组测序。通过转录组数据分析,获得1507个差异mRNA,其涉及先天免疫反应（TLR、MAD5、TRIM25）、适应性免疫反应（LY6E、CD36、LAG3）、凋亡与自噬（IRF1、PDCD1、WNT5A）和炎症反应（CCL4、TNFRSF18、CDKN2）等。另外模式识别受体、T细胞受体、JAK-STAT、TNF以及NF-kappa B信号通路等在REV感染期间发挥重要作用。最后,通过qRT-PCR验证33个免疫相关mRNA,其表达量与测序数据呈正相关,在三个时间点的相关系数分别为:R2=0.961、0.9681和0.9467,表明转录组测序结果准确、可靠。4.miRNA表达谱分析结果显示,在7、14和21dpi共获得63个差异miRNA（30个已知miRNA和30新型miRNA）以及7373个候选靶基因。功能富集分析结果表明,miRNA在SPF鸡的不同生长阶段具有重要的生物学功能并在多种类型的信号通路中发挥着重要调控作用。最后,通过qRT-PCR验证15个miRNA,其表达量与测序数据呈正相关,在三个时间点的相关系数分别为:R2=0.9384、0.9718和0.9788,表明小RNA测序结果准确、可靠。5.miRNA与mRNA的整合分析结果显示,在7、14和21dpi共获得482个差异靶基因,并预测到886个已知miRNA-mRNA作用对和580个新型miRNA-mRNA作用对。功能富集分析结果显示,差异表达靶基因显著富集在免疫相关的信号通路类别中,如免疫系统、细胞生长与凋亡、信号分子和相互作用、信号转导类别。通过qRT-PCR进一步验证14对免疫相关miRNA-mRNA作用对。结果表明,REV感染后miRNA可以调控炎性细胞因子（CCR2、CCR4、CCR8、STAT1）发生变化,并影响T、B淋巴细胞调节因子（CTLA4、CASP10、RAPGEF4）的表达。同时,凋亡因子（FOS、JUN、TNFSF6）和肿瘤调节因子（MAPK10、TNFRSF13C）的表达也发生变化。这些结果拓宽了对REV感染引起免疫抑制和诱导肿瘤发生机制的理解,但其具体作用机制尚需进一步研究。

论文目录

符号说明

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 禽网状内皮组织增生症的病原学

1.1.1 分类

1.1.2 形态及组成

1.1.3 复制

1.2 禽网状内皮组织增生症病毒的流行病学研究现状

1.2.1 自然宿主与实验宿主

1.2.2 传播途径

1.2.3 流行现状

1.3 转录组学概论及其生物学应用

1.4 非编码小RNA的研究进展

1.4.1 miRNA概述

1.4.2 miRNA与家禽肿瘤病

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株、菌株、载体及实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液配制

2.1.4 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 TaqMan探针qRT-PCR检测方法的建立

2.2.1.1 引物和探针的设计与合成

2.2.1.2 总RNA的提取与残留基因组DNA的去除

2.2.1.3 RT-PCR反应

2.2.1.4 目的片段的琼脂糖凝胶回收纯化

2.2.1.5 连接与转化

2.2.1.6 阳性克隆鉴定与测序

2.2.1.7 质粒标准品的提取

2.2.1.8 qRT-PCR反应条件的优化

2.2.1.9 qRT-PCR标准曲线的建立

2.2.1.10 敏感性试验

2.2.1.11 特异性试验

2.2.1.12 重复性试验

2.2.2 REV感染SPF鸡疾病模型

2.2.2.1 实验动物分组及其处理

2.2.2.2 样品采集与处理

2.2.2.3 免疫器官指数的测定

2.2.2.4 免疫器官病毒载量的测定

2.2.3 REV感染SPF鸡脾脏转录组的构建

2.2.3.1 测序流程

2.2.3.2 数据整理和过滤

2.2.3.3 参考基因组信息整理及统计

2.2.3.4 比对分析

2.2.3.5 mRNA表达量分析

2.2.3.6 mRNA表达差异分析

2.2.3.7 差异表达mRNA的功能富集分析

2.2.4 免疫相关主要差异mRNA的验证

2.2.4.1 引物设计与合成

2.2.4.2 反应条件与体系

2.2.4.3 结果计算与统计学分析

2.2.5 REV感染SPF鸡脾脏miRNA表达谱的构建

2.2.5.1 测序流程

2.2.5.2 原始数据统计及过滤

2.2.5.3 长度分布统计

2.2.5.4 基因组比对

2.2.5.5 Small RNA注释

2.2.5.6 miRNA表达差异分析

2.2.5.7 miRNA特征分析

2.2.5.8 miRNA表达模式分析

2.2.5.9 靶基因预测

2.2.5.10 差异miRNA靶基因的功能分析

2.2.6 加polyA尾法验证miRNA测序结果

2.2.6.1 引物设计与合成

2.2.6.2 反应条件与体系

2.2.6.3 结果计算与统计学分析

2.2.7 miRNA与 mRNA表达谱的整合分析

2.2.7.1 miRNA与 mRNA表达模式分析

2.2.7.2 候选靶基因表达差异分析

2.2.7.3 差异表达靶基因的功能分析

2.2.7.4 miRNA-mRNA作用对的筛选

2.2.8 免疫相关差异miRNA靶基因的验证

2.2.8.1 引物设计与合成

2.2.8.2 反应条件与体系

2.2.8.3 结果计算与统计学分析

3 结果

3.1 TaqMan探针qRT-PCR检测方法的建立

3.1.1 重组质粒的PCR鉴定及其测序分析

3.1.2 qRT-PCR反应条件的优化

3.1.3 标准曲线的建立

3.1.4 特异性试验

3.1.5 敏感性试验

3.1.6 重复性试验

3.2 REV感染SPF鸡疾病模型

3.2.1 体重变化

3.2.2 免疫器官指数及其病理变化

3.2.3 免疫器官病毒载量变化

3.2.3.1 免疫器官病毒载量与前病毒载量的测定

3.2.3.2 病毒载量与前病毒载量相关性分析

3.3 REV感染SPF鸡脾脏转录组的表达规律

3.3.1 数据整理和过滤

3.3.2 参考基因组基因注释信息统计

3.3.3 比对分析

3.3.4 mRNA表达量分析

3.3.4.1 样品表达模式

3.3.4.2 样品相关性检验

3.3.4.3 PCA分析

3.3.5 mRNA表达差异分析

3.3.6 差异表达mRNA的功能富集分析

3.3.6.1 GO富集分析

3.3.6.2 KEGG富集分析

3.4 免疫相关主要差异mRNA的验证

3.4.1 差异m RNA qRT-PCR验证

3.4.2 qRT-PCR结果与NGS结果相关性分析

3.5 REV感染SPF鸡脾脏miRNA的表达规律

3.5.1 原始数据统计及过滤

3.5.2 长度分布统计

3.5.3 Small RNA注释分析

3.5.4 miRNA差异分析

3.5.5 miRNA特征分析

3.5.6 miRNA表达模式分析

3.5.7 候选靶基因预测

3.5.8 差异miRNA靶基因的功能分析

3.5.8.1 候选靶基因的GO富集分析

3.5.8.2 候选靶基因的KEGG富集分析

3.6 加polyA尾法验证miRNA测序结果

3.6.1 差异miRNA qRT-PCR验证

3.6.2 qRT-PCR结果与NGS结果的相关性分析

3.7 mRNA与 miRNA表达谱的整合分析

3.7.1 mRNA与 miRNA表达模式对比

3.7.2 候选靶基因表达差异分析

3.7.3 差异表达靶基因的功能分析

3.7.3.1 DETG的 GO富集分析

3.7.3.2 DETG的 KEGG富集分析

3.7.4 miRNA-mRNA作用网络

3.7.4.1 已知miRNA-mRNA作用网络

3.7.4.2 新型miRNA-mRNA作用网络

3.8 免疫相关差异miRNA靶 mRNA的验证

3.8.1 qRT-PCR验证差异miRNA的靶mRNA

3.8.2 差异miRNA与其靶mRNA相关性分析

4 讨论

4.1 REV感染SPF鸡后脾脏mRNA表达规律分析

4.1.1 先天性免疫反应相关基因变化

4.1.2 适应性免疫相关基因变化

4.1.3 炎性细胞因子相关基因变化

4.1.4 凋亡与自噬相关的基因变化

4.2 miRNA与 mRNA表达谱的整合分析

5 结论

6 参考文献

7 致谢

8 攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高朔

导师: 胡敬东

关键词: 高通量测序,免疫抑制

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 山东省自然科学基金(ZR201702140074),泰山产业领军人才项目(LJNY201610),山东省农业重大应用技术创新项目(39703)

分类号: S852.65

总页数: 117

文件大小: 8532K

下载量: 64

禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡脾脏mRNA与miRNA表达规律的研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢