论文摘要
Pif1解旋酶作为一种依赖于ATP供能的DNA解旋酶,广泛分布于原核生物和真核生物体内,在基因组稳定性的维持和核酸代谢调控等方面发挥着重要作用。酿酒酵母Pif1（Saccharomyces cerevisiae Pif1,ScPif1）解旋酶作为Pif1家族中的典型成员,是该家族中被最早鉴定并且深入研究的成员之一。体内研究表明,ScPif1解旋酶参与端粒稳定性的维持、冈崎片段的成熟、DNA复制过程中G4 DNA的解除以及同源重组修复等多种重要代谢途径。体外研究则显示ScPif1同时拥有5’-3’方向的双链DNA、RNA/DNA杂交链以及G4 DNA的解旋活性,其中最为引人注目的是其高效的G4DNA解旋功能,在体内条件下,G4 DNA因其高度的稳定性而成为生物体生理代谢的一大阻碍,ScPif1通过其高效的G4 DNA解旋功能而在多种生理代谢途径中发挥着重要作用。目前,关于ScPif1的研究主要集中在体内或体外的生理生化实验中,对于ScPif1结构的研究则非常有限。本研究针对以上难点,首先采用多序列比对的方式鉴定了ScPif1的解旋核心结构域,并通过二级结构预测的方式,对全长ScPif1蛋白进行了合理的截短设计,通过大肠杆菌表达系统对截短后的ScPif1237-780蛋白进行了表达纯化,获得了可用于结晶实验的高纯度蛋白样品,并在随后的结晶实验中获得了多种DNA复合物的晶体,结合硒代蛋白晶体的反常散射数据获得的相位,首次解析了ScPif1解旋核心结构域的高分辨率三维结构。之后,基于解析的晶体结构,本研究综合利用定点突变实验、凝胶过滤层析技术、X射线小角散射技术、基于荧光各向异性的DNA结合技术、快速停留FRET技术以及单分子实验技术等多种实验方法对ScPif1的解旋核心结构域的功能机制进行了深入地研究,取得了如下主要成果:1)首次在ScPif1的晶体结构中观察到了可以特异结合ATP的保守Q基序,并通过对该基序的突变实验证实了这类基序的缺失会极大地削弱ScPif1对ATP的特异性识别功能。2)首次通过突变体实验揭示了ScPif1特异性结合DNA的分子机制,即His303和His705选择性的识别DNA而不是RNA。这一发现从结构上解释了ScPif1在体内对端粒酶的移除机制。3)通过对ScPif1多种DNA复合物结构的DNA结合位点分析,首次揭示了ScPif1对鸟嘌呤偏好性的结构基础。ScPif1拥有的这类鸟嘌呤碱基偏好性,使其可以更为有效地进行G4 DNA的解旋。4)首次在ScPif1的结构中发现了一段存在于2B结构域外侧并具有独特折叠模式的2C结构域,并证实了该结构域拥有对ScPif1解旋和易位活性的调控作用。5)首次从晶体结构中成功鉴定出了生物学相关的二聚体形式,并在此基础上提出了一种G4 DNA诱导的ScPif1二聚体形成机制。6)首次在晶体结构中发现了一段潜在的G4 DNA结合位点,并通过突变实验验证了该位点中多个氨基酸参与G4 DNA的特异性结合和解旋活性。从结构上解释了ScPif1所具有的G4 DNA识别机制。综上所述,本论文通过对ScPif1解旋核心结构的深入研究,阐明了ScPif1对多种生理底物的识别机制以及结合底物后的寡聚状态,为进一步理解ScPif1在体内发挥的多种功能提供了理论依据。
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摘要ABSTRACT主要符号对照表第一章 文献综述 1.1 解旋酶简述 1.1.1 解旋酶的特性 1.1.2 解旋酶的分类 1.2 SF1家族解旋酶 1.2.1 SF1解旋酶的分类 1.2.2 解旋酶SF1家族的保守基序 1.2.3 解旋酶SF1家族典型成员的结构与功能研究 1.3 Pif1家族解旋酶研究进展 1.3.1 Pif1家族解旋酶概述 1.3.2 Pif1的端粒调节功能 1.3.3 Pif1的G4 DNA解旋功能 1.3.4 Pif1对冈崎片段成熟的促进作用 1.3.5 Pif1在DSB损伤修复中的功能 1.3.6 Pif1对tDNA和rDNA复制的调控作用 1.4 解旋酶研究技术 1.4.1 解旋酶的底物结合活性测定技术 1.4.2 解旋酶的解旋活力测定技术 1.4.3 解旋酶的聚集形态分析技术 1.5 研究目的和意义第二章 ScPif1的表达纯化与活性鉴定 引言 2.1 实验材料、仪器、试剂 2.1.1 实验材料 2.1.2 实验试剂 2.1.3 实验仪器 2.2 实验方法 2.2.1 ScPif1的序列生物信息学分析 2.2.2 ScPif1的载体构建 2.2.3 ScPif1的表达与纯化 2.2.4 ScPif1的聚集状态和均一性分析 2.2.5 ScPif1的基本生化性质测定 2.3 实验结果 2.3.1 ScPif1的序列生物信息学分析结果 2.3.2 ScPif1的载体构建和表达纯化结果 2.3.3 ScPif1的聚集状态和均一性分析结果 2.3.4 ScPif1的基本生化活性检测结果 2.4 小结与讨论第三章 ScPif1的晶体结构研究 引言 3.1 实验材料、仪器、试剂 3.1.1 实验材料和试剂 3.1.2 实验仪器 3.2 实验方法 3.2.1 实验主要缓冲溶液的成分237-780 结晶实验的样品准备'> 3.2.2 ScPif1237-780结晶实验的样品准备237-780 结晶实验'> 3.2.3 ScPif1237-780结晶实验237-780 的晶体结构的解析'> 3.2.4 ScPif1237-780的晶体结构的解析 3.2.5 小角X射线散射实验 3.2.6 荧光各向异性法，动态光散射实验和凝胶过滤实验 3.2.7 圆二色旋光分光法测定实验 3.2.8 单分子荧光共振能量转移实验 3.3 实验结果237-780 的单蛋白结晶实验'> 3.3.1 ScPif1237-780的单蛋白结晶实验237-780 的单链DNA复合结晶实验'> 3.3.2 ScPif1237-780的单链DNA复合结晶实验237-780 与G4 DNA和Fork dsDNA的复合结晶实验'> 3.3.3 ScPif1237-780 与G4 DNA和Fork dsDNA的复合结晶实验237-780 与单链DNA复合物晶体结构的解析'> 3.3.4 ScPif1237-780与单链DNA复合物晶体结构的解析237-780 与单链DNA复合物的晶体结构初步分析'> 3.3.5 ScPif1237-780与单链DNA复合物的晶体结构初步分析237-780 活性状态二聚体的验证'> 3.3.6 ScPif1237-780活性状态二聚体的验证 3.4 小结与讨论第四章 基于ScPif1结构的功能研究 引言 4.1 实验材料、仪器、试剂 4.1.1 实验材料和试剂 4.1.2 实验仪器 4.2 实验方法 4.2.1 突变体蛋白样品的准备 4.2.2 DNA结合活性的测定实验 4.2.3 解旋活性和易位活性的测定实验 4.3 实验结果237-780 核苷酸结合位点的结构与功能研究'> 4.3.1 ScPif1237-780核苷酸结合位点的结构与功能研究237-780 的单链DNA结合位点结构研究'> 4.3.2 ScPif1237-780的单链DNA结合位点结构研究237-780 的 2C结构域结构分析与功能验证'> 4.3.3 ScPif1237-780 的 2C结构域结构分析与功能验证237-780 中G4 DNA结合位点的鉴定'> 4.3.4 ScPif1237-780 中G4 DNA结合位点的鉴定 4.4 小结与讨论第五章 结论与创新点 5.1 结论 5.2 创新点参考文献附录致谢作者简介
文章来源
类型: 博士论文
作者: 陆科羽
导师: 奚绪光
关键词: 解旋酶,四链体,二聚体,射线衍射,射线小角散射
来源: 西北农林科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 西北农林科技大学
分类号: Q75
总页数: 147
文件大小: 58687K
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标签：解旋酶论文; 四链体论文; 二聚体论文; 射线衍射论文; 射线小角散射论文;
