大肠杆菌CRISPR/Cas与耐药性的关系研究

论文摘要

近年来细菌耐药性形势严峻,严重威胁人类健康,成为全球公共健康领域的重大挑战。目前对于CRISPR/Cas系统与耐药性的关系研究尚不明确,因此本研究以鸡源大肠杆菌CRISPR/Cas系统为研究对象,首先检测大肠杆菌的CRISPR阳性率并比较CRISPR阳性和阴性菌株的耐药性差异,其次对CRISPR序列进行生物信息学分析,再次对cas基因的mRNA表达水平和CAS蛋白表达水平进行分析,为进一步研究CRISPR/Cas功能及耐药机制奠定基础。主要研究内容与结果如下:1.CRISPR与耐药性的关系。130株大肠杆菌中有39株大肠杆菌检测出CRISPR,CRISPR阳性率为30%;CRISPR阳性菌株均为多重耐药菌株,其耐药率（100%）显著高于CRISPR阴性菌株（87%）,表明CRISPR的存在与多重耐药表型相关。2.CRISPR的生物信息学分析。通过BLAST、RNA二级结构预测、CRISPRTarget等方法对CRISPR进行生物信息学分析,12株大肠杆菌中,有5种重复序列,其中15个碱基非常保守,不同菌株中重复序列部分碱基会发生突变;间隔序列有168条,其中77条为新发现序列,112条有比对结果的间隔序列中,72.3%的间隔序列与质粒的基因组序列具有同源性,25%与噬菌体有同源性,2.7%与细菌和病毒有同源性,表明重复序列的部分碱基突变和间隔序列的多变性与菌株的多重耐药性相关。3.荧光定量PCR分析。利用RT-qPCR方法检测标准株ATCC 25922和一株多重耐药株8个cas基因mRNA相对表达量,与标准株相比,这株多重耐药株8个cas基因mRNA表达量差异不显著,提示cas基因的mRNA表达可能与耐药性不相关。4.蛋白质组学分析。利用串联质谱标签法（Tandem mass tag,TMT）、平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）靶向蛋白验证技术对标准株ATCC 25922和这株多重耐药株进行蛋白质组学分析,共筛选到300个差异表达蛋白,其中上调167个,下调133个,差异表达蛋白功能富集在细菌趋化性、运动反应、代谢等通路。筛选到 9 个耐药性相关蛋白:Tsr、Tar、CheA、CheW、HisJ、ProV、OppF、Hfq、YbhC、PutA、AdhP、Prr、CysJ,主要富集在细菌趋药性和ABC转运蛋白,而CAS蛋白表达差异不显著,提示CAS蛋白的表达可能与耐药性不相关。本研究通过检测130株大肠杆菌的CRISPR,分析其与耐药表型的关系,对CRISPR重复序列和间隔序列进行生物信息学分析,探讨CRISPR序列与耐药性的关系,再进一步从cas基因mRNA表达水平和CAS蛋白表达水平研究其与耐药性的关系,为深入研究大肠杆菌的耐药机制奠定基础。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵霞

导师: 李琳

关键词: 大肠杆菌,耐药性,生物信息学

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000356

总页数: 63

文件大小: 4227K

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