α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶基因的克隆与表征

论文摘要

人参皂苷（Ginsenosides）属于三萜皂苷类化合物,是人参属植物中最主要的活性成分,具有抗肿瘤、抗氧化以及调节免疫力等多种药理作用。人参皂苷Rd是原人参二醇型皂苷在人体肠道内的主要代谢产物之一,对心脑血管、神经以及免疫系统具有独特的药效功能;同时人参皂苷Rd还是转化Rb1、Rb2、Rb3和Rc为高活性稀有人参皂苷C-K的中间体。由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量较低,通过直接从植物中提取Rd的方法难以满足其实际应用。利用特定的糖苷水解酶可以水解人参皂苷主要成分（如:人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc）C-20位外侧糖基获得人参皂苷Rd。本论文从实验室前期分离获得的一株纤维菌属（Cellulosimicrobium aquatile Lyp51）中克隆到一个α-L-阿拉伯咲喃糖苷酶（EC3.2.1.55）基因和一个双功能β-木糖苷酶（3.2.1.37）/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶基因,在Escherichiacoli BL211（DE3）中进行异源重组表达、并对重组蛋白进行了纯化、酶学性质研究和人参皂苷转化。利用Ni2+亲和层析柱纯化融合了组氨酸标签的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（CaAraf51）,纯酶的比活力为15U/mg。CaAraf51可以水解人参皂苷Rc C-20位外侧的α-L-阿拉伯呋喃糖苷得到Rd。在最适反应条件下（pH5.0,40℃）分别以pNPαAraf和人参皂苷Rc为底物,重组酶的Km分别为1.1 mM和0.57 mM;Vmax分别为25 μmol/min/mg和6.25 μmol/min/mg。0.87mg/mL人参皂苷Rc在30℃C,pH7.5的磷酸缓冲液中与9.6U/mL纯酶混合孵育1h后人参皂苷Rd的产量为0.71mg/mL/h,转化率为90%。重组的双功能酶（Xylarap51）纯化后比活力为15.45U/mg。Xylarap51可以分别水解人参皂苷Rb3和Rb2C-20位外侧的β-D-木糖苷与α-L-阿拉伯吡喃糖苷得到Rd。将两个酶基因进行融合获得一个多功能的酶（Afxyap51）基因,重组酶Afxyap51具备转化人参皂苷Rc、Rb3和Rb2得到Rd的能力;其水解强弱为Rc>Rb3>Rb2。本实验不仅挖掘了能够转化人参皂苷Rb2、Rb3和Rc的皂苷水解酶,而且还为酶蛋白的应用奠定了一定的基础。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1 课题研究的目的与意义

1.1 原人参二醇型皂苷

1.2 人参皂苷Rd的药理活性与生物转化

1.3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶研究进展

1.4 双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶研究进展

1.5 融合蛋白研究概述

1.6 重叠延伸PCR技术简介

2 研究思路

2.1 本研究技术路线

2.2 本课题研究内容

第二章糖苷水解酶基因的克隆表达

1 实验材料

1.1 实验培养基与试剂

1.2 实验菌株与质粒

2 实验方法

2.1 目的基因克隆

2.2 目的基因的表达与纯化

2.3 蛋白浓度检测

2.4 酶活性检测

3 实验结果与分析

3.1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（CaAraf51）的克隆表达

3.2 双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶（Xylarap51）基因的克隆表达

第三章重组酶的酶学性质研究及应用

1 实验材料、仪器、试剂

1.1 实验材料和试剂

1.2 实验仪器

2 实验方法

2.1 酶的最适pH和pH稳定性

2.2 酶最适温度与温度稳定性

2.3 化学试剂与金属离子对酶活性影响

2.4 酶对乙醇以及糖的耐受性

2.5 酶的底物特异性

m和V_max的测定'> 2.6 酶动力学常数K_m和V_max的测定

2.7 人参皂苷Rd的分析方法

3 实验结果与分析

3.1 重组CaAraf51的特性

3.2 Xylarap51的底物特异性

第四章融合表达

1 实验材料、仪器与试剂

2 实验方法

2.1 重组质粒的提取

2.2 带有同源片段的目的基因扩增

2.3 融合基因的构建与克隆

2.4 融合基因的表达

2.5 融合蛋白酶活性检测

3 实验结果与分析

3.1 融合基因

3.2 融合基因的克隆

3.3 融合基因的表达

3.4 融合蛋白活性检测

3.5 结论

第五章结论与展望

1 总结

2 创新点

3 展望

附录

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 左莎莎

导师: 文孟良

关键词: 克隆表达,人参皂苷,基因融合,阿拉伯呋喃糖苷酶,木糖苷酶,阿拉伯吡喃糖苷酶

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南大学

分类号: Q78

总页数: 65

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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶基因的克隆与表征

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