刘成军[1]2004年在《基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在高氧肺损伤中的研究》文中研究表明目的 高氧机械通气是治疗新生儿呼吸窘迫综合症的重要措施，但长时间吸入高浓度氧又可引起肺氧毒性损伤，导致肺间质纤维化和明显肺发育障碍，是支气管肺发育不良（BPD）的主要致病因素之一。目前认为，细胞外基质（ECM）代谢紊乱参与了急、慢性肺损伤的病理生理过程，作为降解ECM成份最重要的基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制因子（TIMPs）在这个过程中可能发挥了重要的作用。本研究通过建立大鼠急、慢性高氧肺损伤的动物模型，动态观察MMPs、TIMPs的变化规律，探讨MMPs、TIMPs在高氧性肺损伤中的表达和意义。方法 幼年Wistar大鼠32只，随机分为空气对照组（8只）和高氧暴露3、7、14天组（每组各8只）,高氧组置于有机玻璃氧仓中，持续输入氧气（2L/min），保证氧浓度≥95%、CO2浓度≤5%。空气对照组置于同一室内空气中(氧浓度=21%),二组环境温度控制在21℃-25℃，湿度60%-70%。高氧暴露3d、7d、14d后取肺组织用免疫组织化学方法（SABC）观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在肺组织中分布，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA在肺组织中的表达，此外对支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白含量、肺通透系数、肺湿/干重比（W/D）以及肺组织病理学改变也进行了对比分析。结果 与空气组比较，高氧组3d时肺组织出现水肿、出血、炎性细胞浸润，随时间的推移进一步加重，14d时肺间隔明显增宽，间质纤维细胞和肺泡上皮细胞明显增生，出现肺纤维化倾向。W/D比值在3d（5.19±0.19）、7d（5.60±0.25）、14d
刘成军[2]2003年在《基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在高氧肺损伤中的研究进展》文中研究表明长时间吸入高浓度氧可引起肺氧毒性损害 ,导致急、慢性肺损伤。基质金属蛋白酶 (MMPs)是一类结构类似、生物学作用相近、依赖金属离子锌、钙的蛋白水解酶。是机体内细胞外基质 (ECM )降解的主要酶系。近年研究表明 ,MMPs及其组织抑制剂 (TIMPs)之间的失衡可能是高氧肺损伤及纤维化形成的重要机制之一。
刘成军, 许峰, 匡凤悟, 卢仲毅, 王兴勇[3]2004年在《基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中的变化》文中提出目的探讨基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中的表达和意义。方法幼年Wistar大鼠32只,随机分为空气组和高氧组,并于高氧暴露3d、7d、14d后用免疫组织化学方法(SABC)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在肺组织中分布,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA在肺组织中的表达,此外对支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量、肺通透系数、肺湿/干重比(W/D)以及肺组织病理学改变也进行了对比分析。结果:与空气组比较,高氧组3d时肺组织出现水肿、出血、炎性细胞浸润,随时间的推移进一步加重,14d时肺间隔明显增宽,间质纤维细胞和肺泡上皮细胞明显增生,出现肺纤维化倾向。W/D值、肺通透系数和BALF蛋白含量在3d、7d、14d均明显高于空气组(P<0.05)。免疫组化显示,MMP-2、NLMP-9、TIMP-1、TIMP-2在正常肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞显弱阳性表达,高氧组3d时肺泡上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肺泡间质细胞、支气管上皮细胞均呈强阳性表达,7、14天表达更加广泛。高氧组3d时MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平明显增加,7d最为显着(P<0.05),14d开始下降,TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达却持续增加,14d时仍无明显下降(P<0.05)。结论肺组织中MMP-2、MMP-9的过度表达和MMPs/TIMPs之间的比例失衡在高氧肺损伤及其纤维化形成过程中发挥重要的作用。
潘涛[4]2010年在《新生大鼠急性高氧肺损伤时P38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化和MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA表达的研究》文中指出目的:1、建立新生大鼠高氧性肺损伤的模型;2、观察高氧性肺损伤急性期肺组织中P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)的磷酸化与基质金属蛋白酶-2,9(matrix metalloproteinases,MMP-2,9)及其特异性组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)mRNA的表达水平的变化;3、探讨P38-MAPK的磷酸化对髙氧肺损伤急性期炎症反应及MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达的影响。方法:1、实验动物分组及动物模型的建立:72只3～5天的新生Sprague Dawley(SD)大鼠随机分成3组:Ⅰ空气组;Ⅱ高氧+生理盐水(高氧组) ;Ⅲ高氧+SB203580 (干预组),各24只。再按实验时间点3,7天分二个亚组12只;每个亚组分灌洗组和非灌洗组,各6只。将Ⅱ、Ⅲ组放于氧箱中,保持箱内氧气浓度为90%～95%,Ⅰ组置于空气中;Ⅲ组每日同一时间点尾静脉注射SB203580(P38-MAPK特异性磷酸化抑制剂,美国Sigma公司,0. 5 mg/kg);Ⅱ组尾静脉注射等量的生理盐水。2、标本采集:每组分为①肺泡灌洗组和②非肺泡灌洗组两个亚组。灌洗组在各时间点分别麻醉动物后以生理盐水行支气管肺泡灌洗,留取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)测定BALF中白细胞计数;非灌洗组各时间点处死动物,取部分右肺制作肺组织匀浆,检测磷酸化P38 MAPK,MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA,肺组织匀浆总蛋白;余下右肺组织称量后置于烤箱中测肺湿/干重比。左肺固定、包埋、切片,用于常规HE染色,观察肺组织病理学变化,拍照存档;3、肺组织磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)检测(Western blot法):采用改良RIPA缓冲液常规提取肺组织中蛋白质,BCA比色法(Bio-Rad蛋白定量检测试剂盒)测定所提取蛋白的浓度。各组蛋白取样100μg进行SDS- PAGE电泳,电转移至PVDF膜。以封闭缓冲液室温封闭1 h,phospho-P38 MAPK一抗(1∶1000,购自美国SANTA CRUZ公司) 4℃孵育过夜,二抗(1∶2000)孵育1 h,ECL显色。用Q550CW计算机图像分析系统对蛋白条带进行分析处理,蛋白含量用目的条带校正容积(Adj volume) /GAPDH校正容积(Adj volume)表示。4、肺组织MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA检测(RT-PCR法):(1)按TRIZOL总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)说明书操作。用RNA提取液( TRIZOL Reagent )从肺组织中提取总RNA。(2)逆转录合成互补DNA ( cDNA)第一链。(3) PCR扩增(引物及扩增条件详见实验步骤)。(4)产物分析:扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,用Q550CW计算机图像分析系统进行电泳条带分析。目标产物mRNA表达水平以目的条带校正容积(Adj volume) /GAPDH校正容积(Adj volume)表示。结果:1.一般状况:空气组大鼠精神状态佳、活动灵活,实验期间体重增长稳定;高氧组大鼠3天后精神反应差,7天后体重增长不明显,呼吸急促,活动迟缓;SB203580干预组大鼠精神状态稍差、活动稍减少、体重增长不明显,呼吸稍急促。2.肺组织病理切片:高氧组3天时肺泡腔内有明显出血和炎性细胞渗出,7天时损伤加重,肺间隔增宽,肺组织结构紊乱。SB203580干预组与高氧组比较炎症改变减轻,肺间隔增宽不明显。3.肺湿/干重比(W/D):实验3天,高氧组较空气组增高(5.5104±0.5001 vs 4.2706±0.3884,p<0.01);实验7天,该比值进一步升高(5.7671±0.3599 vs 4.3977±0.2313,p<0.01)。SB203580干预组与高氧组比较,相同时间点该比值明显降低(实验3天,4.7411±0.3112 vs 5.5104±0.5001,p<0.05;实验7天,4.6761±0.2504 vs 5.7671±0.3599,p<0.01)。4.肺组织匀浆总蛋白(Total Protein,TP)含量检测:实验3天,高氧组TP含量已高于空气组(1.0463±0.2113 vs 0.7323±0.0297,p<0.05);7天时,高氧组TP含量持续增高(1.2226±0.1751 vs 0.9416±0.1365,p<0.05);SB203580干预组与高氧组比较,实验3天时TP含量无显着差异(1.0262±0.1281 vs 1.0463±0.2113, p>0.05),7天时明显下降(0.9297±0.0642 vs 1.2226±0.1751,p<0.05)。5. BALF中白细胞计数:实验3天,高氧组BALF中白细胞计数显着高于空气对照组,差异有统计学意义(42.32±4.78 vs 11.73±3.86,p<0.01);实验7天,白细胞计数进一步增加(126.48±18.88 vs 18.75±3.74,p<0.01)。SB203580干预组与高氧组比较,相同时间点白细胞计数显着下降(实验3天,21.35±3.21 vs 42.32±4.78, p<0.01;实验7天,33.75±8.63 vs 126.48±18.88,p<0.01)。6.肺组织磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)表达:空气组肺组织p-P38 MAPK仅有较弱的表达。实验3天,高氧组p-P38 MAPK表达明显增强,与相应时间点空气组比较,差异有统计学意义(1.506±0.160 vs 0.627±0.024,p<0.01);实验7天,p-P38 MAPK表达进一步增强(1.998±0.176 vs 0.664±0.034,p<0.01)。SB203580干预组与高氧组比较,相同时间点p-P38 MAPK表达明显减弱,差异有统计学意义(实验3天,0.936±0.051 vs 1.506±0.160,p<0.01;实验7天,1.319±0.082 vs 1.998±0.176,p<0.01)。7.肺组织MMP-2、MMP -9、TIMP-1 mRNA的表达:空气组MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达水平低。高氧组MMP-2(实验3天,3.428±0.316 vs1.681±0.092,升高103%,p<0.01;实验7天,1.149±0.129 vs 0.490±0.034,升高134%,p<0.01)、MMP-9(实验3天,0.383±0.011 vs 0.133±0.006,升高190%,p<0.01;实验7天0.329±0.008 vs 0.142±0.008,升高132%,p<0.01)、TIMP-1 mRNA(实验3天, 0.294±0.015 vs 0.112±0.010,升高54%,p<0.05;实验7天,0.449±0.009 vs 0.155±0.006,升高40%,p<0.05)表达明显增强,与相同时间点空气组比较,差异有统计学意义,且MMP-2、MMP-9 mRNA升高幅度较TIMP-1 mRNA升高幅度大; SB203580干预组与髙氧组比较,相同时间点MMP-2(实验3天,2.104±0.094vs3.428±0.316,降低39%,p<0.01;实验7天0.620±0.027vs 1.149±0.129,降低46%,p<0.01)、MMP-9(实验3天,0.208±0.012vs 0.383±0.011,降低46%,p<0.01;实验7天, 0.198±0.0112 vs 0.329±0.008,降低57%,p<0.01)、TIMP-1 (实验3天,0.197±0.013 vs 0.294±0.015,降低18%,p<0.05;实验7天,0.273±0.018 vs 0.449±0.009,降低14%, p<0.05)mRNA表达减弱,差异有统计学意义,且MMP-2、MMP-9 mRNA降低幅度较TIMP-1 mRNA降低幅度大。结论:1.长期的高浓度吸氧可导致新生大鼠的急性肺损伤,病理表现为肺组织局部充血和出血、炎症渗出、肺间隔断裂、肺泡腔扩大和肺结构组织紊乱;2. p-P38 MAPK在新生大鼠急性高氧性肺损伤的肺组织中表达水平明显升高,且随肺损伤程度的加重而进一步升高,提示P38 MAPK信号传导通路的激活可能参与了高氧肺损伤发病过程中的调控;3.高氧肺损伤时肺组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达明显上调,并且MMP-2、MMP-9/TIMP-1的平衡被改变,表明基质金属蛋白酶(MMPs)的过度表达及与基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂(TIMPs)表达之间的失衡在高氧肺损伤的发展及转归中发挥重要的作用;4. P38 MAPK特异性磷酸化抑制剂SB203580通过抑制P38 MAPK的磷酸化,可减轻高氧肺损伤急性期的炎症反应,同时影响MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达,提示P38 MAPK信号传导通路的激活可能参与了高氧肺损伤急性期炎症反应和MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达的调控,为新生儿髙氧肺损伤的防治提供了新途径。
匡凤梧, 刘成军, 许峰, 卢仲毅, 王兴勇[5]2003年在《基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中的变化》文中进行了进一步梳理目的:探讨基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中的表达和意义。方法:幼年Wistar大鼠32只,随机分为空气组和高氧组,并于高氧暴露3d、7d、14d后用免疫组织化学方法(SABC)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在肺组织中分布,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA在肺组织中的表达,此外对支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量、肺通透系数、肺湿/干重比(W/D)以及肺组织病理学改变也进行了对比分析。结果:与空气组比较,高氧组3d时肺组织出现水肿、出血、炎性细胞浸润,随时间的推移进一步加重,14d时肺间隔明显增宽,间质纤维细胞和肺泡上皮细胞明显增生,出现肺纤维化倾向。W/D值、肺通透系数和BALF蛋白含量在3d、7d、14d均明显高于空气组(P<0.05)。免疫组化显示,MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在正常肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞呈弱阳性表达,高氧组3d时肺泡上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肺泡间质细胞、支气管上皮细胞均呈强阳性表达,7、14天表达更加广泛。高氧组3d时MMP-2、MMP-9mRNA表达水平明显增加,7d最为显着(P<0.05),14d开始下降,TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达却持续增加,14d时仍无明显下降(P<0.05)。结论:肺组织中MMP-2、MMP-9的过度表达和MMPs/TIMPs之间的比例失衡在高氧肺损伤及其纤维化形成过程中发挥重要的作用。
罗莉漫[6]2007年在《p38丝裂素活化蛋白激酶在新生大鼠高氧肺损伤中的作用》文中提出目的高浓度氧(简称高氧)指氧含量高于常压下空气的气体,在新生儿救治中具有重要作用,但因高氧长时间进入肺部后,产生大量活性氧,急性期引起急性肺损伤(ALI),继而引发慢性肺损伤而导致另一并发症支气管肺发育不良(BPD),严重影响患儿生活质量。肺脏是氧化应激性损伤的重要靶器官,目前新生儿高氧肺损伤的发病机制尚未完全清楚,有研究表明,中性粒细胞(PMN)的迅速激活、各种细胞因子(CK)的大量释放和转化生长因子-β1(TGF-β_1)的过度表达等在高氧肺损伤的发生发展及其转归中发挥重要的作用。本实验采用新生大鼠建立高氧肺损伤动物模型,检测p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)的表达,并给予p38MAPK特异性抑制剂SB203580对新生大鼠高氧肺损伤进行干预治疗,检测SB203580干预前后新生大鼠高氧肺损伤模型中白细胞介素-8(IL-8)和TGF-β_1含量的变化,以及肺组织病理学和肺湿/干重比的改变,来探讨p38MAPK在新生大鼠高氧肺损伤中的表达和意义,及其特异性抑制剂SB203580对新生大鼠高氧肺损伤产生保护作用的机制。方法160只新生大鼠随机分为Ⅰ空气对照组、Ⅱ高氧组、Ⅲ高氧+SB203580组、Ⅳ高氧+生理盐水组。将Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组新生大鼠暴露于>95% O2,共3 d,同时Ⅰ组置于正常空气中喂养。Ⅲ组从高氧暴露第1 d开始,给予SB203580 5 mg/kg腹腔注射,1/d,共3 d;Ⅳ组给予生理盐水5 mg/kg腹腔注射,1/d,共3 d。在12 h、24 h、72 h和1 w四个时相点处死新生大鼠,进行肺组织病理学检查和肺湿/干重比值(W/D)测定,以Western-blot法检测p38MAPK表达,以酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肺组织IL-8和TGF-β_1的含量。结果①各实验组12 h、24 h肺组织病理学检查均无明显差异。高氧组及高氧+生理盐水组高氧暴露72 h时,肺组织光镜下观察表现为明显的急性炎症和出血,1 w时肺间隔明显增宽,组织结构紊乱。高氧+SB203580组72 h光镜下观察以急性炎症反应为主,1 w时光镜下观察肺泡内炎细胞基本吸收,肺泡发育及结构基本正常。②高氧组与空气对照组相比,肺W/D在12 h和24 h无明显差异,在72 h和1 w高氧组明显高于空气对照组;高氧+生理盐水组与高氧+SB203580组相比,肺W/D在12 h和24 h无明显差异,在72 h和1 w高氧+生理盐水组明显高于高氧+SB203580组。③新生大鼠暴露于高氧12 h时, p38MAPK开始表达,72 h达高峰,后逐渐降低。在高氧暴露72 h时,空气对照组未见p38MAPK表达,高氧组可见p38MAPK表达;高氧+生理盐水组p38MAPK表达明显强于高氧+SB203580组。④在高氧组和高氧+生理盐水组中,肺组织IL-8和TGF-β_1浓度随时间延长呈持续上升趋势,在各时相点均明显高于空气对照组和高氧+ SB203580组(P < 0.01)。结论①新生大鼠连续吸入高氧可导致ALI。②p38MAPK参与了新生大鼠高氧肺损伤的过程。③SB203580能够通过阻断p38MAPK表达,进而抑制IL-8和TGF-β_1表达来减轻新生大鼠高氧肺损伤。
刘成军, 许峰, 匡凤梧, 党润, 卢仲毅[7]2004年在《基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在高氧性肺损伤中的变化》文中研究说明目的 探讨基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中表达及意义。方法 幼年Wistar大鼠32只,随机分为空气组和高氧组,并于高氧暴露3、7、14 d后用免疫组织化学方法(SABC)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在肺组织中的分布,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA在肺组织中表达,此外对支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量、肺通透系数、肺湿／干重比(W／D)及肺组织病理学改变也进行对比分析。结果 高氧组3 d时肺组织出现水肿、出血、炎性细胞浸润,7 d时进一步加重,14 d时间质细胞增生,肺间隔明显增宽,出现肺纤维化倾向。W／D值、肺通透系数和BALF蛋白含量在3、7、14 d均明显高于空气组(P均<0.05)。免疫组化法示MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在正常肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞呈弱阳性表达,高氧组3 d时肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、巨噬细胞、肺泡间质细胞均呈强阳性表达,7、14 d表达更广泛。与空气组相比,高氧3 d时MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平明显增加,7 d时最显着,14 d开始下降(P均<0.05),而TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达却持续增加,14 d时仍无明显下降(P均<0.05)。高氧暴露后MMP-2／TIMP-2、MMP-9／TIMP-1比值亦增加,其中7 d时最为显着,14 d开始下降。结
刘成军, 许峰, 匡凤悟, 卢仲毅, 王兴勇[8]2004年在《基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中的变化》文中研究说明目的:探讨基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在高氧性肺损伤中的表达和意义。方法:幼年Wistar大鼠32只,随机分为空气组和高氧组,并于高氧暴露3 d、7 d、14 d后用免疫组织化学方法(SABC)观察MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在肺组织中分布,用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)观察MMP-2、MMP -9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA在肺组织中的表达,此外对支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量、肺通透系数、肺湿/干重比(W/D)以及肺组织病理学改变也进行了对比分析。结果:与空气组比较,高氧组3 d时肺组织出现水肿、出血、炎性细胞浸润,随时间的推移进一步加重,14 d时肺间隔明显增宽,间质纤维细胞和肺泡上皮细胞明显增生,出现肺纤维化倾向。W/D值、肺通透系数和BALF蛋白含量在3 d、7 d、14 d均明显高于空气组(P<0.05)。免疫组化显示,MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在正常肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞显弱阳性表达,高氧组3 d时肺上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肺泡间质细胞、支气管上皮细胞均呈强阳性表达,7、14天表达更加广泛。高氧组3 d时MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平明显增加,7 d最为显着(P<0.05),14 d开始下降,TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达却持续增加,14 d仍元明显下降(P<0.05)。结论:肺组织中MMP-2、MMP-9的过度表达和MMPs/TIMPs之间的比例失衡在高氧肺损伤及其纤维化形成过程中发挥重要的作用。
李文斌[9]2006年在《维甲酸与丝裂原活化蛋白激酶调控高氧肺损伤机制的研究》文中指出背景:急慢性肺损伤是造成新生儿尤其是早产儿死亡、伤残的主要原因之一,不成熟肺组织长时间暴露于高氧环境是导致急慢性肺损伤发生发展的重要因素。动物研究表明,在肺泡形成关键时期,长时间高氧暴露可阻碍肺泡间隔形成,使肺泡数目减少、呼吸膜内表面积减小和肺泡腔体积增大,与支气管肺发育不良(BPD)患儿肺部病理特征极其相似。同时,持续高氧暴露可促发肺部广泛炎症反应,导致肺泡毛细血管内皮细胞和上皮细胞坏死、凋亡,损害肺泡—毛细血管屏障功能;促使间质成纤维细胞向肺泡腔迁移、增生,并产生胶原蛋白沉积于肺泡腔,导致肺纤维化的发生。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组依赖锌离子的中性蛋白酶,它们是降解细胞外基质(ECM)的主要介质,并与其特异性组织抑制物(TIMPs)一起参与了体内许多生物学过程,如胚胎发育、支气管分枝形成、血管发生、炎症过程以及损伤修复等。MMP-2、MMP-9又称明胶酶-A、明胶酶-B。在肺组织发育过程中,MMP-2和MMP-9的一个重要功能就是裂解ECM成分,产生具有生物学活性的片段,从而诱导肺泡上皮细胞的迁移以及肺分枝形态的发生,因此它们对于胚胎期以及出生后肺发育起至关重要的调控作用。我们以及其他研究者研究证实,高氧暴露引起早产大鼠急性肺损伤和肺发育阻滞同时,肺组织MMP-2、MMP-9表达水平和MMPs/TIMPs比值明显升高,ECM降解加速,肺组织发生广泛重塑,最终导致肺发育受阻。肺泡上皮主要由Ⅰ型(AECⅠ)和П型肺泡上皮细胞(AECⅡ)组成。AECⅡ是肺内主要干细胞,肺泡上皮损伤修复的唯一途径是AECⅡ增殖、迁移并向AECI转化,从而使肺泡壁重新上皮化以恢复气血屏障。在肺发育和损伤修复过程中,肺细胞增殖及凋亡行为受多种因素的精细调控。研究表明,高氧暴露可导致肺细胞DNA损伤,诱导肿瘤抑制蛋白p53及其下游靶基因表达,使细胞周期阻滞于G1/S期,以利于DNA修复;若DNA修复不成功,则诱导细胞发生凋亡。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞增殖、分化、凋亡等信息传递途径的交汇点和共同通路,细胞外各种刺激信号可通过不同的细胞内信息传递系统,共同交汇于MAPKs。一旦被激活,MAPKs通过使其下游的转录因子磷酸化来调控靶基因表达。近年来研究表明,MAPK信号传递通路在MMPs/TIMPs的表达调控中扮演重要角色;并且还参与了肺发育和高氧肺损伤过程中细胞增殖和凋亡的调节。但MAPK信号传递通路是否参与高氧暴露下不成熟肺组织MMPs/TIMPs的表达调控?目前尚未见报道。两个大样本临床随机研究证实,维生素A是迄今为止唯一能降低BPD发生率和死亡率且无明显毒副作用的药物,但其作用机制尚未明了。维甲酸(RA)是维生素A在生物体内的重要活性形式,调节包括细胞生长、分化、发育和肿瘤发生等在内的多种重要生物学功能。研究表明,RA不仅能促进发育期大鼠肺泡形成,还能促进成熟肺组织损伤后的修复过程。给予外源性RA可改善肺泡结构、降低肺纤维化程度,对新生大鼠高氧肺损伤具有保护作用。进一步研究发现,RA对多种肺损伤的保护作用可能与调节MMPs/TIMPs的表达有关。那么,RA是否参与高氧暴露下肺组织MMPs/TIMPs表达调控?RA调节高氧暴露下肺组织MMPs/TIMPs的表达是否与调控MAPKs功能状态有关?迄今尚未见报道。另外,研究证实,RA还参与了细胞周期调控。那么,RA对高氧肺损伤时肺细胞凋亡、增殖的影响是否也与调节MAPKs的活性有关?目前尚不清楚。目的:通过建立早产大鼠高氧暴露动物和细胞模型,1、进一步阐明MMPs/TIMPs在高氧肺损伤中的作用;2、探讨MAPKs(ERK1/2、JNK1/2和p38)是否参与高氧暴露下MMPs/TIMPs的表达调控;3、探讨RA是否通过调控MAPKs功能状态调节MMPs/TIMPs的表达,从而发挥高氧肺损伤保护作用;4、从细胞增殖和凋亡角度,进一步论证RA高氧肺损伤保护作用机制。为RA的临床应用提供理论依据。方法:1、剖宫取出孕21 d(足月为22 d)SD早产鼠,随机分为4组:I、空气组;II、高氧组;III、空气+RA组;IV、高氧+RA组,I、III组置于空气中,II、IV组置于85 % O2中,III、IV组每日腹腔注射RA(500μg / kg)。于4 d、7 d、14 d收集肺组织标本,采用RT-PCR方法检测MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表达,采用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9酶原及活酶表达,运用Western blot技术对TIMP-1、TIMP-2、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38、p38蛋白表达进行检测。2、原代培养早产鼠(孕19 d～20 d)AECII和肺成纤维细胞(LFs),待其生长至亚汇合状态时,将培养瓶中培养液换成含2 % FCS的MEM,并随机分为四组:I、空气组,II、高氧组,III、空气+RA组,IV、高氧+RA组。其中,III、IV组培养液中加入含有终浓度为1×10-6 mol/L的RA,I、II组培养液中加入含有相同终浓度的无水乙醇。I、III组置于空气中,II、IV组置于90 %高氧中。于培养2、6、12和24 h时提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法检测MMP-2、MT1-MMP、和TIMP-2 mRNA表达;提取12 h和24 h细胞总蛋白及培养上清浓缩液,采用明胶酶谱法检测细胞总蛋白与培养上清混合液中MMP-2和MMP-9酶原及活酶表达,采用Western blot技术检测p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38和p38蛋白表达;提取12 h和24 h细胞LFs核蛋白,采用Western blot方法检测p-c-Jun/c-Jun表达。3、分别以ERK1/2、JNK1/2和p38特异性阻断剂PD98059(10×10-6mol/L)、SP600125(10×10-6mol/L)和SB203580(10×10-6mol/L)作为干预方式,运用RT-PCR方法检测早产鼠LFs高氧暴露12 h MMP-2、MT1-MMP、和TIMP-2 mRNA表达,采用明胶酶谱法检测细胞总蛋白与培养上清混合液中MMP-2酶原及活酶表达和采用Western blot技术检测p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38和p38蛋白表达。4、取上述各组4 d早产鼠肺组织标本,采用TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测PCNA表达, Western blot技术检测p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38和p38表达水平。5、取上述各组12 h AECII和LFs,采用流式细胞术(Annexin V—PI双标记)检测细胞凋亡,Western blot检测AECII p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-p38、PCNA、P53及Caspase-3表达。结果:1、高氧、RA对早产鼠肺组织MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2表达的影响mRNA水平:空气暴露4 d、7 d、14 d时,早产大鼠肺组织MMP-2 mRNA的表达呈明显下降趋势;MMP-9和MT1-MMP mRNA的表达变化不明显; TIMP-1 mRNA的表达呈升高趋势,而TIMP-2 mRNA的表达则呈下降趋势;RA对空气暴露下MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达均无明显影响;与空气组比较,高氧暴露后,MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-1 mRNA的表达均有不同程度升高;RA不同程度下调高氧暴露后MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-1 mRNA的表达;而高氧、RA对TIMP-2 mRNA的表达无明显影响。蛋白水平:空气暴露下,4 d、7 d、14 d时,MMP-2酶原和活酶的表达水平呈明显下降趋势;MMP-9酶原的表达在7 d、14 d时有所下降,而其活酶表达水平在14 d时才明显下降;RA对空气暴露下MMP-2和MMP-9酶原及其活酶的表达无明显影响;与空气组比较,高氧暴露明显提高了MMP-2活酶、MMP-9酶原及其活酶的表达,而对MMP-2酶原的表达无明显影响;RA不同程度下调高氧暴露后MMP-2活酶、MMP-9酶原及其活酶的表达;空气暴露下,4 d、7 d、14 d时,TIMP-1蛋白表达水平呈升高趋势;而TIMP-2的表达则无明显变化;RA对空气暴露下TIMP-1和TIMP-2表达无明显影响;高氧暴露显着提高TIMP-1的表达, RA则有进一步促进高氧暴露后TIMP-1蛋白表达升高趋势;而高氧、RA对TIMP-2蛋白表达无明显影响。2、高氧、RA对早产鼠肺组织p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38、p38蛋白表达的影响高氧暴露显着提高p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38表达水平;RA不同程度降低高氧暴露下p-JNK1/2和p-p38表达,但进一步上调p-ERK1/2表达;高氧、RA对总ERK1/2、JNK1/2和p38表达无影响。3、高氧、RA对早产鼠AECⅡ和LFs MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2表达的影响高氧暴露使LFs和AECⅡMMP-2、MT1-MMP mRNA表达明显上调,RA则明显下调高氧暴露下MMP-2和MT1-MMP mRNA表达;高氧、RA对TIMP-2 mRNA表达无明显影响;高氧暴露明显增强LFs、AECⅡ细胞裂解蛋白和培养上清浓缩液混合物中MMP-2(LFs、AECⅡ)和MMP-9(AECⅡ)酶原及活酶表达,而RA则具有下调作用。4、高氧、RA对早产鼠AECⅡ和LFs p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38、p38蛋白表达的影响高氧暴露显着提高LFs和AECⅡp-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38表达水平;RA不同程度降低高氧暴露下p-JNK1/2和p-p38表达,但进一步上调p-ERK1/2表达;高氧、RA对总ERK1/2、JNK1/2和p38表达无影响。5、高氧、RA对早产鼠LFs核蛋白p-c-Jun/c-Jun表达的影响高氧暴露显着提高LFs p-c-Jun表达水平,RA则明显下调高氧暴露下其表达。6、高氧、RA、PD98059、SP600125、SB203580对早产鼠LFs MMP-2、MT1-MMP以及TIMP-2表达的影响RA、SP600125、SB203580在下调p-JNK1/2和p-p38表达同时,LFs MMP-2和MT1-MMP mRNA表达也明显下调,而TIMP-2 mRNA表达则不受影响; PD98059对LFs MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2 mRNA表达无明显影响。7、高氧、RA对早产鼠肺组织细胞增殖、凋亡的影响高氧暴露4 d,肺实质凋亡细胞显着增加,且以AECII、毛细血管内皮细胞和AECI为主;RA明显降低高氧暴露下肺细胞凋亡;高氧暴露4 d,PCNA阳性细胞指数明显下降;RA明显提高高氧暴露肺组织PCNA表达,同时高氧暴露使肺泡分隔第二嵴明显减少、气腔明显增大;RA使空气暴露早产鼠肺泡第二嵴明显增多、肺泡直径变小,而对高氧暴露动物气腔大小以及第二嵴形成没有明显影响。8、高氧、RA对原代培养早产鼠LFs和AECII增殖、凋亡的影响高氧暴露12 h, AECII以晚期凋亡和坏死为主,同时,与空气组比较,其早期凋亡细胞数也显着升高;RA明显下调高氧暴露下AECII坏死、凋亡;高氧暴露12 h,明显降低AECII PCNA表达,显着提高其P53和Caspase-3活性片段表达;RA则明显上调AECII PCNA表达,下调P53和Caspase-3活性片段表达;高氧、RA对LFs坏死、凋亡无明显影响。结论:1、MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2动态表达变化规律与其在肺泡化过程中的作用密不可分;2、高氧暴露明显改变MMPs/TIMPs的表达,在肺泡形成关键时期,MMPs/TIMPs之间平衡关系的破坏是造成肺发育受阻和肺纤维化的重要因素;3、高氧暴露激活MAPKs信号传递通路(主要是JNK1/2和p38)是导致MMPs/TIMPs表达失衡的重要原因;4、高氧暴露,导致AECⅡ大量凋亡、坏死,增殖受到抑制;同时,LFs所受影响较小,两种细胞对高氧暴露的差异性行为也是导致未成熟肺组织异常重构的重要原因;5、RA通过下调JNK1/2和p38磷酸化水平、上调ERK1/2磷酸化水平,进而下调MMP-2、MMP-9、MT1-MMP表达与活化,降低AECⅡ坏死、凋亡,从而发挥高氧肺损伤保护作用。
李静[10]2007年在《p38MAPK信号转导通路在高氧肺损伤中的作用》文中研究指明目的氧疗是临床最常用治疗呼吸衰竭的手段之一,但可带来由于持续高浓度用氧后的氧化应激性肺损伤。目前高氧肺损伤的具体发病机制尚不明确,但相关研究表明,细胞凋亡参与了高氧肺损伤的发生发展。p38蛋白激酶(p38 MAP kinase, p38MAPK)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路叁个主要的亚家族之一,与细胞增殖、存活和凋亡密切相关。本文复制高氧肺损伤动物模型,动态观测肺组织中细胞凋亡及相关信号蛋白p38MAPK的表达,并探讨p38MAPK对细胞凋亡的调控作用。方法幼年Wistar大鼠40只,随机分为空气对照组、高氧暴露组(高氧暴露1、2、3d)和p38MAPK干预组(尾静脉注射SB203580 2h后置于高氧仓中3d)。采用TUNEL技术观察肺组织的细胞凋亡指数,用免疫组化和蛋白质免疫印迹法观察p38MAPK在肺组织中的分布和蛋白表达变化,并观察SB203580干预后细胞凋亡指数的变化及p-p38MAPK表达的变化。结果病理组织学改变表明,高氧组在高氧暴露后1、2天时与空气对照组无明显差别;高氧暴露3天后可见肺组织水肿、出血和炎症细胞侵润。TUNEL检测结果显示,高氧暴露组和空气对照组相比较,肺凋亡指数在高氧暴露1天、2天无明显差异(P> 0.05)。高氧暴露3天后,支气管上皮、肺泡上皮及血管内皮细胞中TUNEL阳性细胞明显增加,肺凋亡指数和空气对照组相比较,差异有显着性(P< 0.05)。免疫组化结果显示:空气对照组偶有少量磷酸化p38MAPK阳性表达,主要见于肺泡上皮细胞及气道上皮细胞,高氧暴露各组则阳性细胞明显增多,广泛分布肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、血管内皮细胞、浸润炎症细胞,胞浆和胞核均有表达。免疫印迹结果显示,空气对照组p-p38MAPK蛋白有阳性表达,高氧暴露1天, p-p38蛋白表达即明显增强,和空气对照组相比较,差异有显着性(P< 0.05)。高氧暴露2天蛋白表达达高峰,高氧暴露第3天蛋白表达有所下降,但仍强于空气对照组,差异有显着性(P< 0.05)。与未干预的高氧暴露3天组相比, p38MAPK干预组肺凋亡指数明显降低,差异有显着性(P< 0.05)。结论1、高氧暴露可以诱导肺细胞凋亡。2、高氧暴露早期可在肺组织检测到p38MAPK信号的活化,活化的p38MAPK信号蛋白广泛分布于肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、血管内皮细胞及浸润炎症细胞。3、p38 MAPK信号途径参与了高氧诱导的肺组织细胞凋亡,起促凋亡作用。
参考文献：
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