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植物多酶体外催化组合制备黄酮类化合物的研究

2020-12-02阅读(285)

植物多酶体外催化组合制备黄酮类化合物的研究

论文摘要

黄酮类化合物因其具有多种调节人体生理功能和治疗人类疾病的生理学功能而得到广泛的研究。目前黄酮类化合物的生产主要是通过植物提取和化学合成。然而,高成本的植物提取法和反应剧烈的化学合成法因其技术局限性限制了黄酮类化合物的大规模商业化生产。生物合成法因其具有成本低,反应条件温和等特点而成为黄酮类化合物合成的首选途径。本文以具有代表性的黄酮类化合物为研究对象,系统探索了生物合成法生产高附加值黄酮类化合物的可行性。挖掘、筛选不同来源的黄酮类化合物合成途径中的酶,对其反应条件进优化及研究其在黄酮类化合物生产中的特性;将玉米苯丙氨酸解氨酶（ZmPAL2）应用到反应分离耦合的催化体系,实现了肉桂酸的高效生产;通过分子改造技术提高了ZmPAL2的酪氨酸解氨酶活性,从而提高了p-香豆酸的产量;建立了能够高效合成柚皮素的体外多酶组合催化体系并对其条件进行优化,从而构建了柚皮素的无细胞体系合成途径;在谷氨酸棒杆菌中,利用分子手段对谷氨酸棒杆菌的启动子进行突变,获得具有不同强度启动子,并且在谷氨酸棒杆菌中成功构建出儿茶素的代谢途径。主要研究结果如下:（1）对不同来源的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）进行异源表达及反应条件的研究,筛选出具有较高酶活的玉米苯丙氨酸解氨酶（ZmPAL2）、大米4-香豆酰辅酶A连接酶（Os4CL）、矮牵牛查尔酮合成酶（MiCHS）和烟草查尔酮异构酶（NsCHI）。（2）利用ZmPAL2粗酶和含有ZmPAL2的重组菌进行肉桂酸的生物合成。在对反应条件优化后,ZmPAL2粗酶可以以10.0 g/L的苯丙氨酸为底物合成5.0g/L的反式肉桂酸;含有ZmPAL2的重组菌在反应分离耦合的体系中,可以以40.0g/L的苯丙氨酸为底物合成39.6 g/L的反式肉桂酸。（3）利用饱和突变对ZmPAL2进行理性改造,获得了酪氨酸酶活更高的F135H突变酶,并将其用于p-香豆酸的生物合成。对F135H突变酶的酶学性质研究表明,与天然酶相比,F135H突变对酶的最适pH、最适温度和pH稳定性没有影响,温度稳定性略有提高。与天然酶相比,突变酶通过粗酶和全细胞催化制备p-香豆酸的能力均有提高,产量分别提高了2.8倍和4.1倍。（4）利用筛选出的Os4CL、MiCHS和NsCHI体外多酶催化制备柚皮素。对多酶催化反应条件进行优化后,在优化后的条件下,多酶催化体系3 h内可以催化制备出32.0 mg/L的柚皮素。（5）筛选不同来源的儿茶素合成关键酶并进行组合优化,在谷氨酸棒杆菌中构建了儿茶素合成代谢途径。对谷氨酸棒杆菌的Tac启动子进行改造,构建含有不同强度的启动子库,证明合理选择不同强度的启动子可以提高黄酮类化合物的产量。本文基于黄酮类化合物体外多酶催化组合的研究,结合分子改造技术和对代谢途径中限制性因素的探究,实现了体外合成多种黄酮类化合物,为黄酮类天然产物合成中的进一步开发应用奠定基础。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 引言
  •   1.2 黄酮类化合物介绍及合成途径
  •     1.2.1 黄酮类化合物结构及其生理活性
  •     1.2.2 黄酮类化合物合成途径
  •   1.3 植物黄酮类化合物合成途径相关酶的研究现状
  •     1.3.1 苯丙烷代谢关键酶
  •     1.3.2 黄酮合成代谢关键酶
  •     1.3.3 儿茶素合成代谢关键酶
  •   1.4 黄酮类化合物合成的研究现状
  •     1.4.1 合成方法
  •     1.4.2 微生物体系构建天然产物合成途径制备植物代谢物研究现状
  •   1.5 多酶催化
  •     1.5.1 多酶催化体系
  •     1.5.2 多酶催化体系应用
  •   1.6 研究意义和研究内容
  •     1.6.1 研究意义
  •     1.6.2 研究内容
  •     1.6.3 技术路线
  • 第二章 植物苯丙烷代谢途径相关酶的克隆表达与酶学性质
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 菌株与质粒
  •     2.2.2 酶与试剂
  •     2.2.3 主要仪器和设备
  •     2.2.4 培养基与储液
  •     2.2.5 实验方法
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 酶的筛选与基因合成
  •     2.3.2 不同来源重组苯丙氨酸解氨酶的诱导表达与酶学性质表征
  •     2.3.3 不同来源重组4CL的诱导表达与酶学性质表征
  •     2.3.4 不同来源重组CHS的诱导表达与酶学性质表征
  •     2.3.5 不同来源重组CHI的诱导表达与酶学性质表征
  •   2.4 本章小结
  • 第三章 苯丙氨酸酶催化制备肉桂酸的研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 菌株与质粒
  •     3.2.2 酶与试剂
  •     3.2.3 主要仪器和设备
  •     3.2.4 培养基与储液
  •     3.2.5 实验方法
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 粗酶催化制备肉桂酸的反应条件优化
  •     3.3.2 最适条件下粗酶催化反应历程
  •     3.3.3 全细胞催化制备肉桂酸的反应条件优化
  •     3.3.4 最适条件下全细胞催化反应历程
  •     3.3.5 反应分离耦合强化全细胞催化制备肉桂酸过程
  •     3.3.6 顺反式肉桂酸抑菌活性差异与顺反式结构转换
  •   3.4 本章小结
  • 第四章 理性设计提高苯丙氨酸解氨酶对P-香豆酸的催化活性
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 菌株与质粒
  •     4.2.2 酶与试剂
  •     4.2.3 主要仪器和设备
  •     4.2.4 培养基与储液
  •     4.2.5 实验方法
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 序列比对和突变位点的确定
  •     4.3.2 F135 的饱和突变
  •     4.3.3 F135H的酶学性质表征
  •     4.3.4 F135H产 p-香豆酸的性能研究
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 体外多酶组合催化合成柚皮素
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与方法
  •     5.2.1 菌株与质粒
  •     5.2.2 酶与试剂
  •     5.2.3 主要仪器和设备
  •     5.2.4 培养基与储液
  •     5.2.5 实验方法
  •   5.3 结果与讨论
  •     5.3.1 pH对柚皮素产量的影响
  •     5.3.2 温度对柚皮素产量的影响
  •     5.3.3 底物浓度对柚皮素产量的影响
  •     5.3.4 酶配比对柚皮素产量的影响
  • 2 对柚皮素产量的影响'>    5.3.5 MgCl2对柚皮素产量的影响
  •     5.3.6 辅酶A对柚皮素产量的影响
  •     5.3.7 ATP对柚皮素产量的影响
  •     5.3.8 丙二酰辅酶A对柚皮素产量的影响
  •     5.3.9 通过提高反应体系中各组分的浓度来提高柚皮素的产量
  •     5.3.10 优化反应条件下多酶体系催化制备柚皮素的反应历程
  •   5.4 本章小结
  • 第六章 代谢工程改造谷氨酸棒杆菌制备儿茶素
  •   6.1 前言
  •   6.2 材料与方法
  •     6.2.1 菌株与质粒
  •     6.2.2 酶与试剂
  •     6.2.3 主要仪器和设备
  •     6.2.4 培养基与储液
  •     6.2.5 PCR引物
  •     6.2.6 实验方法
  •   6.3 结果与讨论
  •     6.3.1 用于合成儿茶素的重组质粒的构建
  •     6.3.2 重组质粒转化至谷氨酸棒杆菌
  •     6.3.3 重组谷氨酸棒杆菌在AMM培养基中发酵制备儿茶素
  •     6.3.4 重组谷氨酸棒杆菌在CGXⅡ培养基中发酵制备儿茶素
  •     6.3.5 谷氨酸棒杆菌不同强度启动子的筛选
  •     6.3.6 不同强度启动子的测序
  •     6.3.7 谷氨酸棒杆菌启动子库在天然产物合成中的应用
  •   6.4 本章小结
  • 第七章 结论与展望
  •   7.1 结论
  •   7.2 特色与创新
  •   7.3 展望
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 参考文献
  • 附录Ⅰ 文章中所使用的酶的基因序列号及蛋白序列号

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 臧颖

    导师: 欧阳嘉

    关键词: 黄酮类化合物,肉桂酸,柚皮素,香豆酸,多酶催化

    来源: 南京林业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 南京林业大学

    基金: 国家重点研发计划(2017YFD0600205),江苏省优势学科,南京林业大学优秀博士论文基金

    分类号: Q946

    DOI: 10.27242/d.cnki.gnjlu.2019.000094

    总页数: 115

    文件大小: 4678K

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