滕春波[1]2003年在《信号转导和转录激活因子3在小鼠子宫及黄体中的表达与调节》文中研究表明信号转导和转录激活因子3(STAT3)在动物的早期胚胎发生、细胞生长、凋亡控制和细胞运动等过程中起着很重要的作用。本实验以小鼠为材料，利用原位杂交和免疫组化等方法，并采用假孕、延迟着床、人工蜕膜化及激素处理等模型，研究了STAT3基因在早期妊娠子宫中的表达与调节。此外，还研究了促性腺激素对性未成熟小鼠子宫中STAT3表达和激活的调节，并对STAT3在小鼠黄体形成和退化过程中的作用进行了研究。 妊娠第1天的子宫腔上皮和腺上皮中，有较强的STAT3 mRNA表达，在第2～3天较弱。第4天上午子宫腺上皮中的STAT3免疫染色较强，且在胚泡所在处的的子宫腔上皮中有弱的酪氨酸磷酸化STAT3蛋白的核转位。第4天下午及午夜，胚胎将要着床处子宫的腔上皮和腺上皮中STAT3表达继续增强，酪氨酸磷酸化STAT3的核转位明显增强。第5天胚胎着床以后，着床位点处子宫腔上皮中酪氨酸磷酸化STAT3的核转位减弱。第4天的子宫中，在没有胚胎的子宫区段，酪氨酸磷酸化STAT3向细胞核中的转位不发生或很弱。在假孕第4天的子宫和延迟着床的子宫中未发现酪氨酸磷酸化STAT3的核转位现象。这些表明STAT3的激活需要活性胚泡的存在，可能在胚胎着床过程中起重要作用。 在妊娠第5～6天的蜕膜化基质细胞中可检测到STAT3表达及酪氨酸磷酸化。妊娠第8天时，STAT3免疫染色主要位于近腔蜕膜区，而酪氨酸磷酸化的STAT3主要位于近肌层蜕膜区，在子宫系膜侧的蜕膜中酪氨酸磷酸化STAT3的信号较强。人工诱导蜕膜化的子宫中，STAT3的表达及酪氨酸磷酸化形式与妊娠第8天的子宫中相似，表明STAT3与小鼠的蜕膜化过程密切相关。 在切除卵巢的小鼠中，孕酮处理对子宫中STAT3表达及激活基本上没有影响。雌激素处理后的子宫腔上皮上有STAT3 mRNA和蛋白质表达，而且有较弱的酪氨酸磷酸化STAT3的免疫染色。注射2天孕酮后再注射雌激素，能显着上调子宫腔上皮中STAT3的表达及酪氨酸磷酸化STAT3的核转位，表明雌激素与孕酮协同作用能启动STAT3的表达和激活。 用PMSG处理性未成熟的小鼠，可刺激子宫腔上皮和腺上皮中STAT3的表达，并促进子宫腔上皮和腺上皮中的STAT3发生酪氨酸磷酸化及核转位。hCG处理也能提高子宫 东北农业大学农学博士学位论文一腔上皮细胞核中酪氨酸磷酸化形式STAT3的水平。但PMSG处理48小时后用hCG处理则使STAT3的酪氨酸磷酸化减弱。 在黄体退化过程中，黄体细胞中的STAT3 mRNA表达平稳，STAT3兔疫染色逐渐增强，在即将退化的黄体中达到最强。酪氨酸磷酸化的STAT3水平随黄体退化的进行逐渐升高，但未发生核转位。在黄体退化过程中，STAT3很可能不是通过705位的酪氨酸磷酸化起作川。 总之，STAF3的表达及激活可能在小鼠的胚胎着床和蜕膜化过积中起巫要作川。促性3＄激累能调’lljU腔上皮利）J爬上皮中SM3的表达利激活。
冉昊[2]2015年在《蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在小鼠胚胎植入中的生理作用及机制》文中研究指明胚胎植入是哺乳动物妊娠建立过程的关键环节之一。在人中有大约75%的早期妊娠失败是由胚胎植入的异常所造成的。而处于接受态的子宫和有植入能力的囊胚是植入的必要前提。子宫接受态的建立是在卵巢雌孕激素及其核受体ER和PR的主导下,通过下游的转录因子、生长因子等的共同作用,引导子宫细胞进行有序的增殖与分化,获得对胚胎有容受能力的过程；因此雌孕激素及其受体的功能调控对子宫接受态的建立有着至关重要的作用。但到目前为止,关于雌孕激素及其受体在子宫及胚胎植入过程中作用的分子机制还有诸多未知的问题。本研究中,我们发现一个机体中广泛表达的胞质蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2,在围植入期子宫中呈现时空特异性的动态表达模式,其蛋白主要定位于子宫组织的细胞核中。利用PR-cre工具鼠,我们建立了子宫特异的Shp2敲除小鼠模型,发现子宫中的Shp2缺失导致胚胎植入失败,雌性小鼠不育。进一步的分析表明,Shp2的敲除导致子宫基质细胞增殖减弱,上皮细胞增殖增加以及孕酮响应基因表达下降等一系列孕激素信号响应不足的现象。深入的研究表明,Shp2的敲除影响了雌激素受体的活性,导致基质细胞中雌激素的靶基因PR表达受到抑制,子宫对雌孕激素的响应异常。而生化实验分析发现Shp2通过和ERα的直接相互作用调节ERα的转录活性,而且这种作用并不依赖于ERK信号通路的激活。我们利用CRISPR/Cas9技术建立了Shp2敲除的子宫内膜细胞系,并结合不同突变类型的Shp2表达载体证明细胞核中的Shp2,而非细胞质中的Shp2,通过N端的两个SH2结构域与ERα的相互作用促进ERα的转录活性。最终我们发现Shp2和ERa的相互作用促进ERα与靶基因PR启动子区域的结合及后续转录激活因子的募集过程,对调控子宫ERa的转录活性起着重要作用。本研究揭示了Shp2在胚胎植入过程中的重要作用以及ERa转录激活过程的新机制。这一发现将有助于更好地理解妊娠建立的调控过程,并对妊娠建立过程相关疾病有很好的借鉴意义,也为子宫中雌激素受体功能异常相关的疾病的诊断和治疗提供了理论基础。另外,这是首次揭示了Shp2核定位的生理功能,为Shp2的分子功能研究提供了更多的参考。
汪丽萍[3]2017年在《Rictor/mTORC2通路在卵子发生与早发性卵巢功能不全中的作用及其机制研究》文中指出一、研究背景与目的早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency,POI)是指女性40岁之前,原发性或继发性闭经至少4月(排除妊娠后),血清性激素水平低下(主要是E2)、抗苗勒氏管激素降低,和促性腺激素水平升高(主要是FSH),伴随生育力的丧失。随着社会经济的快速发展,职场女性精神压力剧增,加至基因、环境因素的综合影响,POI的发病率呈上升趋势。POI患者由于功能性卵泡的丧失,面临不育、更年期综合征等一系列健康问题,也提高了心血管疾病,骨质疏松骨折、老年痴呆等老年退行性疾病的易感性,严重影响女性的生存质量。POI的发病机制非常广泛,包括染色体基因异常、自身免疫病多器官受累、代谢因素、感染和医源性因素等。不同于自然状态的更年期,约500%的POI患者卵巢功能不可预知,约5%~10%的患者,在诊断POI后,仍然可以妊娠、分娩。大约650%的POI患者属于特发性,无病因可循,而且在出现临床症状之前,卵泡耗竭已经发生。故探索卵泡衰竭的分子机制,了解卵子发生、凋亡闭锁的机理,可为临床pOI的治疗策略提供新思路。哺乳动物的卵子发生是一个循序渐进的过程,经历复杂的形态变化和细胞分化。由初级卵母细胞经过-一系列减数分裂和形态变化,形成成熟卵子的过程称为卵子发生。卵泡生长指静止休眠状态的始基卵泡,被募集选择,发生一系列生化和形态变化,直至卵泡成熟,周期性排卵或卵泡凋亡闭锁。当获能的精子穿透次级卵母细胞透明带,产生顶体反应,卵母细胞迅速完成第二次成熟分裂,卵原核和精原核的染色体融合,形成二倍体的受精卵。GCs及卵泡膜细胞对正常卵子发生至关重要,卵泡数量不足或卵泡凋亡闭锁加速,将导致POI。然而,参与卵子发生过程中的一些信号通路,尤其是一些新的信号转导通路及其调节机制仍不明确,探索这些信号通路在卵子发生,以及POI中的分子机制仍将是今后研究的热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可接受并整合细胞内和细胞外的各种信号通路的刺激,如激素、生长因子、营养、能量代谢等,进而调节蛋白质的翻译、细胞的生长、存活、自噬与代谢等生理过程。在细胞内,mTOR以mTORC 1/2两种复合物的形式存在,其形态结构和功能的改变,与复合物存在的形式有关。而且二者在功能上截然不同,分别接受各自的上游蛋白信号,调节各自下游蛋白的生理功能。其中,mTORC1的活性能特异性地被雷帕霉素所抑制,mTORC2中含有雷帕霉素不敏感的组分Rictor,故其活性不受雷帕霉素的影响。关于Rictor蛋白的结构及各结构域的作用与上、下游的调节机制了解较少,目前认为Rictor/mTORC2可磷酸化Akt(Ser473),促进细胞存活与调节细胞骨架重组。mTORC2在卵泡发育与POI中的作用及调节机制亦不清楚,最近有研究发现去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)在诱导卵泡大量凋亡的同时,能抑制卵泡中PI3K信号通路的活性。VCD是生产杀虫剂、灭火剂、塑料和橡胶等的中间产物,由于其具有严重的卵巢毒性,会导致女性POI而丧失生育能力。我们在前期的工作中发现4-VCD在导致POI的同时,抑制了 Rictor/mTORC2信号通路的活性,但Rictor/mTORC2在卵泡发育与POI发生中的作用及调节机制尚不清楚。本课题通过Cre-loxP重组酶系统,构建卵泡特异敲除Rictor的小鼠为模型,结合4-VCD导致POI动物模型,应用组织学,胚胎学及细胞分子生物学方法,从分子、细胞与整体水平阐明mTORC2在卵子发育和成熟、卵泡凋亡闭锁、卵巢功能及早期胚胎发育中的作用,并探讨其可能的调控机制,为卵子发生的调节机制和POI的发病机制提供新内容,为女性POI相关疾病的防治提供实验依据和潜在的治疗靶点。二、研究方法1、应用Cre-IoxP系统(Rictor-loxp、ZP3-cre)构建卵泡细胞特异性Rictor基因敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定,用western blot和免疫组织化学确定基因敲除效果。2、通过HE染色、免疫组织化学以及免疫荧光技术分析Rictor/mTORC2对小鼠子宫大小,卵巢组织形态和各级卵泡和黄体数量的影响。3、通过TUNEL检测Rictor/mTORC2对小鼠卵泡发育凋亡闭锁的影响。4、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对敲除小鼠血液进行生化分析,检测Rictor/mTORC2对小鼠血清性激素变化的影响。5、通过流式细胞技术检测Rictor/mTORC2对小鼠卵母细胞细胞周期的影响。6、通过免疫荧光技术、western blot技术、Pulldown以及免疫共沉淀技术分析Rictor/mTORC2对卵泡凋亡和卵巢内分泌、胚胎发育的影响及相关的分子机制。7、通过给予正常小鼠4-VCD处理,建立POI动物模型,探讨Rictor基因在此模型中的作用。叁、研究结果1 4-VCD破坏早期卵泡发育,并且抑制卵泡Rictor/mTORC2信号通路的活性为了探讨mTORC2在POI中的作用,首先在4-VCD处理后的卵巢种对mTORC2信号通路的中心成分Rictor的活性进行检测。与对照鼠相比,VCD处理的小鼠中始基卵泡的数量减少了45%,初级卵泡减少了55%,但VCD对更高级的卵泡作用很微弱,对照组与处理组之间基本相近。有趣的是,在VCD处理过的卵巢中,Rictor的一种活性抑制状态——磷酸化Rictor(p-Rictor,Thr-1135)的表达水平明显上升。众所周知,Rictor作为mTORC2的核心组分通过在各种环境下磷酸化并活化Akt,并通过Akt磷酸化并抑制作为细胞凋亡转录因子Foxo3a的活性来促进细胞的存活。与预期的相一致,VCD处理后,卵巢中p-Akt(Ser-473)和p-Foxo3a(Ser-253)的表达量减少了。与此同时,叁种经典的促凋亡蛋白Bad,Bax和cleaved-PARP的表达量明显上升。作为SGK1的活性指标,NDGR1在Thr-346位点的磷酸化在对照组和VCD处理组小鼠的结果很接近,这说明mTORC2的另一种下游底物血清-糖皮质激素诱导型蛋白激酶1(SGK1)并没有改变。另外,我们发现S6K1的活性(p-S6K1,Thr-389)表达量反而上升。这些结果与前人报道的体内结果一致,S6K1介导Rictor Thr-1335位点的直接磷酸化,进而抑制S6K1的活性,形成了一个依赖于mTORC1并针对mTORC2的抑制反馈回路。Rictor的磷酸化与失活在VCD介导的卵泡凋亡中可能发挥重要作用。2卵母细胞中Rictor基因的缺失模拟POI的表型为了进一步阐明Rictor/mTORC2对卵泡存活的作用,应用Cre-loxp系统成功构建了卵母细胞特异性敲除Rictor的小鼠。与所预期的一样,在同窝的对照组小鼠的卵泡中检测到了 Rictor的表达,而在敲除小鼠内并没有发现,这说明Cre酶成功实现了对Rictor基因的重组,卵泡细胞特异性敲除Rictor的小鼠构建成功。同时,Rictor基因的缺失也引起了 p-Akt(Ser-473)表达量的降低。有趣的是,mTORC1的下游靶蛋白p-S6(S235/S236)的表达明显减少,这个现象在黄体中尤为明显。以往的研究表明,mTORC2通过激活Akt进而抑制mTORC1的负调控因子(TSC1/2)来活化mTORC1,由此可见,我们的研究结果与以往报道的结果高度一致。我们进一步检测了 Rictor/mTORC2信号通路下游蛋白的表达。Rictor的缺失引起了 p-Foxo3a的表达减少,同时,Bad,Bax和cleaved PARP表达增多。免疫组化的结果也通过Western Blot分析得到了证实。由此可见,卵母细胞中特异性敲除Rictor所引起的控制卵泡生存的潜在信号通路的变化与VCD基本一致。这些结果一致表明Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信号轴调控卵泡凋亡过程中的起着核心作用。3卵巢中Rictor缺失引起卵泡细胞凋亡和卵泡丢失随后,我们检测了敲除小鼠中卵泡的数量。敲除小鼠的外形和体格生长发育正常,但子宫则较对照鼠小,在8月龄时,子宫重量只有对照鼠的45%(p<0.05)。随后对敲除小鼠的卵巢进行形态学观察,发现健康卵泡和黄体的数量均明显减少,同时闭锁卵泡明显增多,这一结果与促凋亡蛋白的过度表达是相吻合的。需要引起注意的是,在8月龄的敲除小鼠中,卵泡数量很少,几乎很难观察到。为了更精确地判断Rictor基因敲除对卵泡减少的影响,我们对每个卵巢选取了 5张切片,对不同发育阶段的卵泡进行了分类和计数。与对照鼠相比,6月龄时,条件敲除小鼠的健康卵泡减少了 40%,黄体减少了 50%。至8月龄时,敲除小鼠的健康卵泡减少了 67%,黄体减少了 71%(p<0.001),这表明卵泡细胞缺失Rictor基因,导致卵巢出现卵泡渐进性丢失。众所周知,排卵后残留的卵泡壁塌陷,卵泡膜的结缔组织、毛细血管等伸入到颗粒细胞(GCs)层,在LH作用下演变成体积较大,富含毛细血管并具有内分泌功能的黄体。黄体中GCs占大多数,黄体数量的减少意味着排卵的减少,或者提示可供发育成熟并排卵的卵泡储备不足。造成这种现象的原因可能是由于卵泡的过度耗竭,使得窦前卵泡到窦状卵泡、成熟卵泡的发育过程受阻所致。结合实验结果来看,过度的卵泡凋亡可能是更主要的因素,我们发现在敲除小鼠的卵巢中检测到了更多的闭锁卵泡(p<0.01)。为了进一步确定卵泡耗损具体发生在卵泡发育的哪个阶段,我们进一步分析了各个发育阶段卵泡的数量。尽管相对于对照鼠,敲除小鼠小卵泡(包括始基卵泡和初级卵泡)的数量降低,但是差异并不明显。前人的研究已经证实Zp3-Cre介导的基因敲除发生在初级卵泡以及其之后的发育卵泡的卵母细胞上,从常理上讲,卵泡中Rictor基因的缺失应该不会引起始基卵泡的大量损失,这与实际上观察到的结果是相吻合的(p<0.01)。此外,在8月龄的条件敲除小鼠的卵巢中观察到了窦卵泡和成熟卵泡的大量凋亡,这一结果与条件敲除小鼠卵巢中促凋亡蛋白表达水平显着上调的结果是一致的。以上结果表明,卵巢中Rictor基因的缺失促进了卵母细胞的凋亡,从而引起卵泡的大量耗损,由此导致卵巢储备功能降低。4卵母细胞内Rictor敲除导致小鼠生育能力下降通常情况下,卵泡储备的下降会导致雌鼠生育能力的下降。为了进一步检测条件敲除小鼠的生育能力,我们分别将4、6、8月龄的对照小鼠和敲除小鼠与已被证实有生育能力的野生型C57雄鼠进行交配。正如所预期的一样,敲除小鼠随着年龄的增大,生育能力下降。所有对照小鼠均成功妊娠,并正常分娩幼崽,然而在敲除小鼠组,4月龄和6月龄组内各有1只(11%)在为期两个月的观察期内未能成功受孕。更严重的是,所有8月龄的条件敲除小鼠都出现不育。值得注意的是,来自4月龄组的1只小鼠(11%)和来自6月龄组的4只小鼠产褥期死亡,同时伴发稽留流产和死胎。并且,在敲除小鼠组,成活的幼崽数明显比对照组的少,成功分娩率较对照小鼠降低。因此,敲除小鼠的生殖能力随着年龄的增长而下降,而且自8月龄开始出现不育。5卵母细胞内Rictor敲除小鼠的激素分泌异常作为生殖腺,卵巢在很大程度上受促性腺激素(如FSH和LH)的调节,同时分泌性激素(如E2、P4)。因此,我们检测了敲除小鼠的性激素水平。敲除小鼠FSH和LH的水平都比对照鼠相应的激素水平高,但差异并没有统计学意义(p>0.01)。考虑到敲除小鼠出现卵泡发育的阻滞和不排卵的表型,并且因为FSH促进卵泡发育,LH调节排卵,所以这些变化可能预示着存在某种正反馈效应。与此相反,敲除小鼠的雌二醇和孕酮的分泌都明显下降(p<0.01),尤其是孕酮,与对照鼠的孕酮水平相比几乎减少了一半(p<0.05)。黄体是雌性体内雌二醇的重要分泌源和孕酮的唯一来源,敲除小鼠卵母细胞凋亡,成熟卵泡减少,排卵减少,功能性黄体减少,自然引起性激素分泌的不足,间接导致了生育能力的下降。6来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的因为Zp3-Cre介导的基因重组特异的发生在卵母细胞中,所以,它不仅是一个非常好用的工具,用于研究目的基因在卵子生成过程中的生理功能,还被广泛的用于探索胚胎发育期间母系遗传的影响。最近一项研究利用破坏多等位基因的方法使Rictor基因失活,发现mTORC2对胚胎生长和发育发挥重要的作用。为了进一步明确来自母本的Rictor基因对胚胎发育是否必需,我们将性成熟的雌性敲除小鼠(Zp3-Cre+,Rictorloxp/loxp 排卵后的卵母细胞细胞缺失Rictor基因)和对照小鼠(Zp3-Cre-,Rictorloxp/loxp正常的卵母细胞)与具有生育能力的野生型C57雄鼠交配。在这个交配组合中,来自于条件敲除小鼠卵泡细胞的胚胎缺少母系遗传的Rictor基因,产生具有-/Rictor基因型的胚胎。但是我们并没有观察到对照小鼠和敲除小鼠胚胎之间有任何明显的解剖或组织学上的差异。虽然在每个特定观察时间点(E5,E10,E15)条件敲除小鼠的胚胎数目较对照组少,但是在整个观察期中(E5到E10),对照组和条件敲除组小鼠胚胎的总数分别保持相对稳定,在E5时,对照组是57个胚胎,敲除组是45个,比对照少。同样,其它两个时间点也是如此。但对于敲除组来说,从45到41,再到42,从时间点的变化上看数量相对稳定,也就是在胚胎发育过程中胚胎并没有明显减少,不会在发育过程中因为胚胎异常而死亡。而每个时间点胚胎数量减少是因为卵泡过度凋亡,卵巢排卵少导致的。这证明母系遗传的Rictor基因缺陷对正常胚胎发育没有影响。此外,对照鼠和敲除小鼠的胚胎在每个时间点的平均数量很接近。除此之外,组织形态学分析显示条件敲除小鼠E16的胎盘并无没有明显的形态学和组织学异常,而且滋养层细胞的标志蛋白-胎盘催乳素(PL-1),与对照小鼠的表达和分布基本一致。尽管条件敲除小鼠死胎发生率增加,但是幼崽外观并没有任何明显的发育缺陷。但是对照鼠和条件敲除小鼠的子宫组织学差异显着,条件敲除小鼠子宫腔的体积更小,而且分泌腺也明显减少,这些子宫组织形态学的异常很容易导致胚胎丢失。这些结果表明,仅仅具有父系遗传的Rictor基因对于整个胚胎发育过程已经足够了。综上所述,4-VCD破坏早期卵泡的发育,并且抑制Rictor/mTORC2信号通路的活性,小鼠卵泡中Rictor基因缺失,导致PO1,主要表现为过度的卵泡凋亡和闭锁,进而导致小鼠生育力的下降,敲除小鼠的FSH和LH水平比正常对照鼠的高。来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的。四、结论1、在VCD诱导的小鼠POI模型中,Rictor/mTORC2信号通路的活性下降;2、成功构建了卵泡特异性敲除Rrictor的条件基因敲除小鼠模型;3、卵泡中Rictor基因缺失引起引起小鼠卵泡过度凋亡和闭锁,出现POI的表型;4、Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信号轴调控卵泡凋亡的过程中起核心作用;5、卵泡Rictor基因敲除的小鼠生育力下降;6、来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的。综合上述,本研究发现Rictor/mTORC2在卵子发生、卵泡细胞存活与维持雌性生殖能力中起重要作用,卵泡特异性敲除Rictor的小鼠是研究POI的理想模型。
张学敬[4]2014年在《前列腺素和孕酮对小鼠黄体退化中Slit/Robo表达的调节及相关机理》文中进行了进一步梳理黄体(corpus luteum, CL)是一种短暂存在的内分泌器官,其主要功能是分泌孕酮以维持妊娠及调节发情周期。如果动物没有受孕,则黄体启动退化程序,继而进入新一轮的发情周期。大量的研究证明,前列腺素(Prostaglandin F2α, PGF2α)是主要的溶黄体激素,而在黄体中特异性表达的Slit/Robo家族成员也参与了黄体退化过程。然而,关于PGF2α与Slit/Robo在调控黄体细胞凋亡过程中是否具有相互作用尚不清楚。本文以小鼠为研究对象,通过体外、体内实验研究了PGF2α在诱导黄体细胞凋亡过程中对Slit/Robo的调控作用,以及Slit/Robo通路对PGF2α凋亡途径的介导作用及其相关机理。取得的主要研究结果包括以下五个方面：1. Real-time PCR和免疫组织化学双染方法证明,Slit2和Robol高表达且共定位于小鼠的黄体细胞,且Slit/Robo;家族成员在黄体晚期高表达。利用原代培养的黄体细胞为模型进行体外实验,抑制Slit/Robo通路后导致黄体细胞的凋亡率及相关凋亡基因的表达显着下降,说明Slit/Robo通路具有促进小鼠黄体细胞凋亡的作用。2.利用体外培养的原代黄体细胞为模型进行体外实验,结果证明PGF2α对Slit/Robo家族成员的表达调节表现为剂量依赖性和时间依赖性。另外,利用假孕小鼠为模型进行体内实验,结果发现PGF2α的类似物-氯前列醇在诱导黄体退化的同时显着上调了Slits/Robos的mRNA和蛋白水平的表达。由此证明PGF2α在体外和体内条件下均上调了Slits/Robos的表达,Slit/Robo通路可能介导了PGF2α促进黄体退化的过程。3.利用体外培养的原代黄体细胞以及相关信号通路抑制剂,研究了PGF2α对Slits/Robos调节的信号通路,结果发现PGF2α是通过PKC依赖性的ERK1/2/P38途径上调了Slit/Robo家族成员的表达。4.利用体外培养的黄体细胞,添加或不添加Slit/Robo通路抑制剂处理组均用PGF2α诱导其凋亡,结果发现Slit/Robo通路抑制剂显着下调了PGF2α诱导的黄体细胞的凋亡率及相关凋亡基因的表达,说明Slit/Robo通路可能介导了PGF2α秀导的黄体细胞的凋亡。5.参照与PGF2α相似的思路和研究方法,本文还研究了孕酮(progesterone)在抑制黄体退化过程中对Slit/Robo家族成员的调控作用。结果证明,与PGF2α的作用相反,孕酮在体外和体内条件下均能够显着下调Slits/Robos的表达。综上所述,本论文证明了PGF2α口孕酮对黄体组织中Slit/Robo家族成员的表达分别具有上调和下调作用,并且Slit/Robo通路是PGF2α调节黄体退化的关键因素。这些结果为进一步研究生殖激素与黄体退化之间的关系提供了理论基础。
郭南南[5]2015年在《PGF诱导的MAPK与立早基因（ATF3、NR4A1和NR4A2）在假孕大鼠黄体中的表达与定位》文中进行了进一步梳理黄体的主要功能是分泌孕酮,它的退化意味着下一个发情周期的开始,因此,它在卵巢周期性调节和妊娠的维持中起着重要作用。在啮齿类动物中,黄体退化首先会发生功能性退化(孕酮合成水平明显降低),而后发生结构性退化(细胞凋亡的发生)。本论文采用苏木素-伊红染色(HE)、酶联免疫测定(ELISA)、免疫组织化学(IHC)、RT-PCR、real-time PCR、免疫印迹(Western blot)等方法,研究MAPK与立早基因(ATF3、NR4A1和NR4A2)在PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中的表达模式及其可能作用,为进一步研究哺乳动物卵巢黄体退化提供试验依据。主要内容如下:1.ATF3与MAPK参与PGF诱导假孕大鼠黄体退化的作用研究为了研究ATF3与MAPK成员参与PGF诱导假孕大鼠黄体退化的作用,本试验采用PMSG/hCG联合处理构建大鼠假孕模型。在假孕第七天注射PGF,分别在0h、10 min、30 min、1h、2 h和4 h颈椎脱臼法处死大鼠。ELISA结果表明:血中孕酮水平呈时间依赖性下降。WB结果表明:在PGF处理2h,ATF3的表达量显着上升(P<0.01);而在30min,p-ERK和p-JNK表达量显着上升(P<0.01);相比之下,p-p38的表达量却没有明显变化。IHC结果表明:PGF处理后,黄体中p-ERK的染色自外向里逐渐减弱;而ATF3的染色相对均匀的分布在大、小黄体细胞的细胞核。这些结果提示PGF会诱导MAPK部分成员的磷酸化,它们的变化可能参与调控黄体退化过程中ATF3表达的升高与孕酮水平的降低。2.核受体NR4A1与NR4A2在PGF诱导的大鼠黄体退化中的定位及其表达规律通过观察核受体NR4A成员NR4A1与NR4A2在PGF诱导的大鼠黄体退化中的表达规律,推测其在大鼠黄体退化过程中的可能作用。在假孕第七天行PGF不同时间点(0 h、30 min、1 h、2 h 和 4 h)注射,采用 RT-PCR 和 real-time PCR 方法检测卵巢中NR4A1与NR4A2mRNA表达变化,IHC观察黄体中NR4A1与NR4A2的定位。结果:NR4A1蛋白主要定位在黄体细胞的细胞质中,在卵母细胞和膜细胞上也有表达,且在PGF处理后,NR4A1mRNA水平先上升而后下降,并且在30min-lh表达量最高,与生理盐水组相比差异极显着(P<0.01)。而NR4A2在黄体中呈不均匀(片状或颗粒状)分布,大部分在黄体细胞的细胞质中表达,并且在PGF处理后,NR4A2 mRNA水平的变化趋势与NR4A1保持一致,处理30 min-1 h组NR4A2mRNA水平与生理盐水组相比差异极显着(P<0.01),但NR4A2mRNA水平的变化不及NR4A1敏感。上述结果提示核受体NR4A1和NR4A2可能与PGF诱导的假孕大鼠黄体退化有密切关系。
李晓明[6]2004年在《牦牛周期黄体退化过程中黄体细胞凋亡的生物学特征》文中指出本研究采用不同的手段和研究方法，通过对牦牛周期黄体退化过程中组织形态学的观察、体外培养条件下周期黄体细胞凋亡的生物学特征的分析、TNFa对体外培养周期黄体细胞凋亡的影响以及周期黄体退化过程中黄体细胞内c-myc和Bad的表达的测定等，系统地研究了牦牛周期黄体退化过过程中细胞凋亡的生物学特征，取得了如下结果： (1)采集不同阶段牦牛的周期黄体，进行HE染色、光镜观察、超微结构观察和DNA原位荧光标记检测(DAPI)，发现整个周期黄体期均有黄体细胞凋亡现象，但主要见于发情期黄体。随着黄体老化，黄体组织中的血管也发生退化。(2)用酶消化法制备牦牛原代黄体细胞，经血清撤除诱导其凋亡，然后检测其生物学特征。采用原位荧光标记(DAPI和PI法)法检测发现，凋亡细胞主要表现为核固缩、并发散高亮的蓝色荧光；DNA原位末端标记检测表明，凋亡细胞呈TUNEL阳性反应；透射电镜观察显示，凋亡细胞核固缩、染色质边集、核碎裂和凋亡小体形成；DNA电泳呈现典型的“梯状带”，与已知分子量的Mark对比，证实凋亡的黄体细胞中存在分子量为180—200bp整倍数的DNA片段。(3)在培养液中，添加不同剂量的TNFa，均能诱导体外培养的牦牛周期黄体细胞发生凋亡，并呈剂量依赖性；流式细胞术(FCM)检测，可见明显的凋亡峰。(4)用免疫组化法检测了周期黄体不同阶段c-myc和Bad的表达情况，发现在整个周期黄体期，黄体细胞中c-myc和Bad均有不同程度的表达，并且均定位于细胞浆中。在周期黄体存活的过程中，随着其存活时间的延长，黄体细胞的阳性表达率和表达强度也呈逐渐增大的趋势，并在发情前期和发情期黄体达到相对稳定的表达状态；在发情期黄体中，部分黄体细胞的核内也有c-myc蛋白存在。 以上结果表明，黄体细胞凋亡是导致牦牛周期黄体退化的主要原因；牦牛黄体细胞可以在体外培养；血清撤除能诱导其凋亡；凋亡的黄体细胞在形态学和生化等方面具有典型的特征；TNFa能诱导体外培养的牦牛黄体细胞发生凋亡，并呈剂量依赖性；c-myc和Bad基因的表达可能参与牦牛黄体细胞凋亡的分子调控。
许琴[7]2013年在《比格犬子宫与卵巢ERα、ERβ的表达及ERβ新剪接异构体的研究》文中研究指明比格犬因其性情温顺，体格适中，遗传背景清晰，均质性好，在医药、公共卫生、生命科学和军事医学研究领域，发挥着重要的作用。但目前，我国比格犬种群内的不发情或发情不孕、休情期延长、停发情、窝产仔数少等情况比较常见，严重制约着比格犬的生产效率，因此，针对比格犬生殖调控机理的研究具有重要的理论与实际意义。本研究对不同发情阶段比格犬卵巢与子宫内雌激素受体ERα、ERβ蛋白的表达规律进行了研究，并对犬ERα、ERβ及可能存在的ERβ剪接异构体进行基因扩增，构建真核表达重组质粒，并瞬时转染293T细胞，对其活性进行初步研究。突出的结果是首次发现了比格犬ERβ的四个剪接异构体，为深入进行比格犬ERα、ERβ及其剪接异构体在生殖调控中的作用机制研究奠定了基础。现将实验研究报告如下。1.间情期与发情期比格犬血清性激素检测及卵巢与子宫正常组织形态的比较应用病理切片技术对间情期及发情期比格犬卵巢及子宫的正常组织形态进行比较，并对两个发情阶段比格犬血清性激素：E2、PRGE、FSH和LH水平进行测定，分析其性激素变化特点和卵巢、子宫在不同阶段的组织形态学特征。性激素检测结果表明：在发情期比格犬出现了很明显的E2峰值，而在间情期及发情后期雌激素均维持在极低的水平。而PRGE在间情期未能检测到，在发情期及发情后期均能检出，并且在发情后期表达水平明显升高。组织形态学比较结果表明：间情期犬子宫及其内膜较薄，间质纤维增生，黄体中以初级卵泡为主，可见1-2个次级卵泡，未见成熟卵泡，卵泡和黄体细胞间纤维较多、血管少。发情期犬子宫及其内膜增厚，内膜腺体腔较大，部分腺体呈分枝状弯曲，腺上皮肿大，胞浆淡染，少数可见核下空泡。卵巢中卵泡数量较多，有初级、次级和1-2个成熟卵泡。黄体细胞数量多，排列规则，境界清楚，间质纤维比较疏松，血管多，未见空泡变性。2.间情期与发情期比格犬卵巢与子宫内ERα、ERβ的定位与定量研究运用免疫组织化学和图像灰度分析法对间情期与发情期比格犬卵巢及子宫内ERα、ERβ蛋白的表达进行组织定位和半定量分析，结果如下：⑴比格犬ERα、ERβ的免疫组织化学定位ERα主要表达于卵泡颗粒细胞、卵巢间质腺腺上皮细胞胞核内，胞质内有微弱表达，卵母细胞胞核及卵母细胞胞质内也有表达，在卵泡膜内膜的间质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞的胞核内也有少量表达。在膜黄体细胞的胞核，颗粒黄体细胞的胞核与胞质内均有表达。ERβ主要表达于卵泡颗粒细胞，卵巢间质腺的腺上皮细胞及颗粒黄体细胞的核膜及胞质内，少量表达于卵巢间质动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、静脉内皮细胞的核膜及胞质内。ERα主要表达于子宫内膜腺体细胞胞核内，而ERβ主要表达于子宫内膜腺体细胞核膜及胞质，在血管内皮细胞及平滑肌细胞胞质内也有表达。BCIP/NBT与AEC双染可见ERα、ERβ在子宫内可表达于同一个内膜腺体细胞，但其定位部位不同：ERα主要在核内，而ERβ主要在核膜及胞质内。⑵ERα、ERβ半定量分析结果间情期与发情期比格犬卵巢内各组成成份ERα蛋白的表达特点：间情期与发情期比格犬卵巢内腺体、卵泡及周围基质、黄体各组份ERα表达的变化以腺体（0.03297±0.004075vs0.06647±0.008961，P＜0.01）和黄体（0.01286±0.003219vs0.06241±0.007671，P＜0.01）为显着，在发情期的表达水平均较间情期显着增加。表明ERα蛋白主要表达于发情期卵巢腺体及黄体内。间情期与发情期比格犬卵巢内各组成成份ERβ蛋白的表达特点：由间情期发展至发情期，比格犬卵巢生长卵泡、初级卵泡、黄体、间质血管各组份中，生长卵泡ERβ表达水平显著增加（0.04471±0.004291vs0.1300±0.03970，P＜0.01），黄体内ERβ表达水平显著下降（0.1515±0.02711vs0.1008±0.02247，P＜0.01），但黄体内ERβ的起始表达水平很高，与初级卵泡及间质血管中的表达水平（0.01879±0.001484）比较仍保持在较高的水平。初级卵泡及卵巢间质血管中ERβ保持在相对较低的水平。表明在卵巢内ERβ蛋白主要表达于生长卵泡及黄体内。间情期与发情期比格犬ERα、ERβ蛋白在卵巢内的表达特点：在间情期及发情期比格犬卵巢内ERβ的表达水平显著高于ERα（间情期：0.08646±0.008002vs0.02398±0.001911，P＜0.01；发情期：0.09007±0.007534vs0.04691±0.003052，P＜0.01）比格犬卵巢内ERα在由间情期发展至发情期时表达水平显著增加（0.02398±0.001911vs0.04691±0.003052，P＜0.01），而ERβ在两个生理阶段基本保持不变（0.08646±0.008002vs0.09007±0.007534，P＞0.05），但与ERα比较，维持在较高的表达水平。说明在间情期与发情期卵巢内均以ERβ的表达占主导地位。间情期与发情期比格犬ERα、ERβ蛋白在子宫内的表达特点：在比格犬子宫内，在间情期，ERα、ERβ都有表达，但都维持在相对较低的水平，并且两者的表达水平无显著差异（0.02855±0.008855vs0.02908±0.003865，P＞0.05），而发展至发情期时， ERα的表达水平显著增加（0.02855±0.008855vs0.04896±0.006833，P＜0.01），ERβ仍维持在相对较低的水平（0.02170±0.003959）。由此得出结论在发情期比格犬子宫内，ERα为优势表达的雌激素受体亚型。3. ERα、ERβ及ERβ新剪接异构体的扩增与鉴定应用RT-PCR扩增了ERα和ERβ的全长编码序列：ERα1791和ERβ1593，并首次筛选出了ERβ的四个选择性剪接异构体：第4外显子完整缺失的一个；第7外显子完整缺失的一个；部分第4和部分第5外显子组合缺失的两个。应用5`3`RACE对第4外显子完整缺失的ERβ1293及第7外显子完整缺失的ERβ1257两个剪接异构体扩增出其全长编码序列。ERα1791分子量为66kD，ERβ1593分子量为59kD；ERβ1293缺失300bp，编码430aa，分子量为48kD；ERβ1257缺失181bp，编码418aa，分子量为47kD，碱基的缺失造成了读码移位，使翻译提前终止，在其终止密码子前插入10个非编码ERβ氨基酸残基。讫今，我们尚未查到关于比格犬ERβ的剪接异构体的研究报道。本实验首次发现比格犬ERβ的四个剪接异构体，扩增出其中两个的全长编码序列，并且证明其在瞬时转染的293T细胞中能够翻译成蛋白质。4. ERα、ERβ及ERβ剪接异构体真核表达重组质粒的构建及活性的初步研究构建了pEGFP-n1-ERα1788，pEGFP-n1-ERβ1590，pEGFP-n1-ERβ1290，pEGFP-n1-ERβ1254真核表达重组质粒，瞬时转染293T细胞，提取细胞总蛋白，经WB验证ERα1788、ERβ1590、ERβ1290、ERβ1254在体外均能翻译成目的蛋白质。
徐业芬[8]2010年在《Smad信号转导通路相关基因表达与湖羊高繁殖力关系的研究》文中指出湖羊是世界着名的多胎绵羊品种,Smad信号通路中的很多信号分子与绵羊的生殖和卵泡发育有密切关系,参与调控绵羊排卵数、产羔数等多胎性状,为了探讨湖羊多胎与Smad信号通路的关系,我们利用RT-PCR技术首次系统检测了Smad信号通路中相关信号分子基因的组织表达谱,并进一步利用实时荧光定量PCR的方法研究了繁殖力较低湖羊(经产单羔：单羔组)和繁殖力较高湖羊(经产叁、四羔：多羔组)与Smad信号转导通路相关基因在垂体和卵巢组织以及有腔卵泡中的表达差异,并分析了Smad言号通路中的有关基因表达量与排卵数的相关性。我们的研究结果提供了Smad言号通路有关基因在mRNA表达水平对湖羊排卵数的可能调控机理,同时为揭示湖羊高繁多胎机理和筛选影响湖羊多胎性状的特有候选基因提供了参考。1.湖羊BMP/Smad言号通路相关基因组织表达特征用RT-PCR法检测湖羊BMP/Smad信号通路中信号分子基因组织表达特征,结果成功克隆得到了BMP/Smad信号通路中BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP15、BMPRIA、BMPRIB、BMPRII、Smad1、Smad5、Smad4等信号分子基因部分cDNA片段,组织表达谱研究表明,BMP2、BMP4、BMP7、BMPRII、BMPRIA、BMPRIB、Smad1知Smad4基因在成年发情期湖羊母羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉组织中均有表达,而BMP6基因仅在成年湖羊母羊卵巢、输卵管、’肾脏、肌肉组织中有表达；Smad5在子宫、输卵管、肺脏和肌肉组织中没有表达；BMP15仅在卵巢组织表达,为卵巢组织特异表达基因。从结果看,BMP/Smad信号转导通路相关基因mRNA表达与湖羊垂体和卵巢功能可能有密切联系2.高、低产湖羊垂体组织BMP/Smad信号通路分子基因表达差异及与排卵数相关性的研究我们首次利用荧光定量PCR技术对湖羊BMP/Smad信号通路中信号分子基因(包括BMP蛋白家族基因BMP2、BMP4、BMP7; BMP受体基因BMPRIA、BMPRIB、BMPRII;细胞内Smad蛋白家族基因Smadl、Smad4、Smad5) mRNA在高繁殖力(经产叁、四羔：多羔组)和低繁殖力(经产单羔：单羔组)湖羊母羊发情后24-36小时排卵时期在垂体组织中的表达水平进行分析。结果显示,多羔组卵巢排卵数极显着高于单羔组(P<0.01)；在垂体组织中,BMP2、BMP7、BMPRIA、BMPRII.Smadl知Smad4基因表达量在单羔组和多羔组垂体组织内没有显着差异(P>0.05),但是,多羔组BMP4、BMPRIB知Smad5基因表达量极显着低于单羔组(P<0.01),且与卵巢排卵数均分别呈不同程度的负相关(P<0.05或P<0.01),说明湖羊垂体组织BMP4.BMPRIB知Smad5基因表达量差异可能是引起湖羊较高产羔数的原因之一。3.高、低产湖羊卵巢组织BMP/Smad信号通路分子基因表达差异及与排卵数相关性的研究我们利用荧光定量PCR技术分析了高繁殖力(经产叁、四羔：多羔组)和低繁殖力(经产单羔：单羔组)湖羊母羊发情后24-36小时排卵时期卵巢组织中BMP/Smad通路中的BMP蛋白家族基因(BMP2、BMP4、BMP6、BMP7BMP15), BMP受体基因(BMPRIA、BMPRIB、BMPRII)和细胞内Smad蛋白家族基因(Smadl、Smad5, Smad4)表达水平差异及其与卵巢排卵数间的相关性,结果显示：多羔组湖羊BMP4、BMPRIB知Smad4基因mRNA表达极显着高于单羔组(P<0.01),BMP15知BMPRII基因mRNA表达显着高于单羔组(P<0.05),而BMP2、BMP6、BMP7、BMPRIA、Smadl知Smad5基因mRNA表达在单羔组和多羔组间没有显着差异(P>0.05)；相关分析表明卵巢组织中BMP4、BMP15、BMPRIB、BMPRII、Smad5和Smad4基因mRNA表达与排卵数呈正相关,表明BMP4、BMP15、BMPRIB、BMPRII知Smad4基因在mRNA水平对湖羊排卵数有影响,可能是影响湖羊高产、多胎性状的候选基因。4.不同繁殖力湖羊有腔卵泡BMP/Smad信号通路基因表达水平研究为了进一步探讨湖羊多胎与BMP/Smad信号通路的关系,我们以机械法获取高繁殖力(经产叁、四羔：多羔组)和低繁殖力(经产单羔：单羔组)湖羊母羊发情后24-36小时排卵时期卵巢组织中的部分有腔卵泡,利用荧光定量PCR技术对BMP/Smad信号通路基因(包括BMP蛋白家族基因BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP15; BMP受体基因BMPRIA、BMPRIB、BMPRII;细胞内Smad蛋白家族基因Smadl、Smad4、Smad5) mRNA在有腔卵泡中的表达水平进行分析,结果显示：多羔组湖羊BMP4,BMPRIB和BMPRIl基因mRNA表达显着高于单羔组(P<0.05), Smad4基因mRNA表达极显着高于单羔组(P<0.01), BMP15 mRNA显着低于单羔组(P<0.05), BMP2、BMP6、BMP7、BMPRIA、Smad1知Smad5基因mRNA表达在单羔组和多羔组湖羊有腔卵泡中的表达没有显着差异(P>0.05)。结果提示单羔组和多羔组湖羊BMP4、BMP15、BMPRIB、BMPRIⅠ和Smad4基因表达差异可能是湖羊多胎原因之一。5.湖羊TGF-β/Smad言号通路相关基因组织表达特征用RT-PCR法检测湖羊TGF-β/Smad信号通路中信号分子基因组织表达特征,结果成功克隆得到了TGF-β/Smad信号通路中TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad7等信号分子基因部分cDNA片段,组织表达谱研究表明,TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2知Smad7在湖羊母羊卵巢、子宫、输卵管等生殖器官有表达外,在下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉组织中也均有表达,但是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRⅠ在肺脏组织中没有表达,而TGF-βRⅡ、Smad2知Smad7在肺脏中有表达。从结果看,TGF-β/Smad信号通路相关基因在湖羊体内广泛表达,而在卵巢组织均可检测到其明显表达,说明TGF-β/Smad信号通路相关基因对湖羊繁殖功能可能有一定的影响。6.高、低产湖羊卵巢组织TGF-β/Smad信号通路分子基因表达差异及与排卵数相关性的研究对高繁殖力(经产叁、四羔：多羔组)和低繁殖力(经产单羔：单羔组)湖羊母羊发情后24-36小时卵巢组织中TGF-β/Smad信号通路的TGF-β蛋白基因(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3), TGF-P受体基因(TGF-βRⅠ知TGF-βRⅡ)和细胞内Smad蛋白家族基因(Smad2、Smad7)在卵巢组织的表达水平及其与卵巢排卵数间的相关性进行研究,发现多羔组湖羊卵巢组织TGF-β1知TGF-β2基因表达显着高于单羔组(P＜0.05), TGF-β3、TGF-βRⅡ知TGF-βRⅠ基因表达极显着高于单羔组(P<0.01)；Smad7基因表达则显着低于单羔组(P<0.01)；Smaad2基因在多羔组和单羔组卵巢组织间没有显着差异(P>0.05)。进一步的相关分析结果表明TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3知TGF-βRⅠ与排卵数无相关,TGF-βRⅡ与卵巢排卵数存在显着正相关(P<0.05),Smad7与卵巢排卵数存在显着负相关(P<0.01)。表明TGF-PRⅡ和Smad7基因在mRNA水平对湖羊排卵数有影响,可能是影响湖羊高产、多胎性状的候选基因。
司丽芳[9]2010年在《IGF-1、IL-18在妊娠大鼠下丘脑—垂体—性腺轴的表达及IFN-γ对其表达和对妊娠的影响》文中研究说明正常妊娠时,一些细胞因子通过复杂的神经-内分泌-免疫网络的相互调节作用,在下丘脑-垂体-性腺轴的表达有所变化,这些细胞因子受某些内外界因素的影响表达紊乱时,往往会引发各种妊娠疾病,严重时会造成妊娠终止。目前,调控妊娠的一些细胞因子在有机体的调控特性及其相互作用的机理还不是十分清楚。有资料显示,白细胞介素-18(Interleukin-18, IL-18)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1 ,IGF-1)和γ-干扰素(Interferon-gamma ,IFN-γ)、均参与妊娠调控,但IL-18、IGF-1和IFN-γ在妊娠中的相互调控作用还不太清楚。本研究采用免疫组化SP法对妊娠各期大鼠下丘脑-垂体-性腺轴中IGF-1和IL-18的分布及IFN-γ对IGF-1和IL-18表达的影响进行了研究,并采用图象分析系统对其表达进行了分析。采用荧光定量RT-PCR法分别检测了植入后期大鼠卵巢和子宫中IL-18mRNA和IGF-1mRNA的表达变化及阴道壁注射IFN-γ后对卵巢和子宫中IL-18和IGF-1表达的影响,用ELISA法检测了外周血中IL-18和IGF-1水平的变化,并结合显微及形态分析法进一步研究了不同剂量IFN-γ对妊娠的影响,以期为妊娠早期胚胎丢失机理增添神经生物学研究资料。研究结果如下:1. IGF-1和IL-18在各妊娠期大鼠下丘脑视前室周核、视上核、视前大细胞核、视前内侧核、视前外侧核、视交叉上核、弓状核等21个核团均有表达,分布范围较广;在腺垂体及神经垂体均有表达;在卵巢表达于黄体的粒性黄体细胞、生长卵泡、成熟卵泡;子宫内膜基质细胞、子宫腺上皮细胞、子宫壁平滑肌细胞、血管内皮中也有IGF-1和IL-18阳性产物分布。提示IGF-1和IL-18通过下丘脑-垂体-性腺轴的途径对妊娠发挥着重要的功能。2.IGF-1和IL-18在妊娠大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的表达在妊娠各期存在一定的差异:如IGF-1在下丘脑主要核团胚胎植入前期、植入期、植入后期表达持续升高,妊娠中期表达较低,妊娠晚期表达明显高于妊娠中期,IL-18在下丘脑主要核团胚胎植入前期和植入期的表达不断下降,植入后期表达显着升高。说明两者的表达具有一定的时间程序和空间特性,也有各自的特点。IGF-1在胚胎的植入后期及妊娠晚期表达较多,说明IGF-1可能在胚胎的发育及分娩的启动方面具有重要的时间程序调控作用,同时表现了在下丘脑及垂体水平上参与妊娠的空间调控特性,而在卵巢及子宫的表达则说明,IGF-1能够调节卵泡和黄体的功能,从而影响卵巢中类固醇的生成;并参与了母胎界面的免疫耐受调节。同时IGF-1和IL-18的协同作用也为妊娠的维持创造了有利的免疫微环境。3. IGF-1和IL-18在妊娠各期大鼠的下丘脑变化主要在下丘脑视前室周核、视上核、视前大细胞核、视前内侧核、视前外侧核、视前交叉上核、弓状核等主要核团,说明下丘脑视前区的核团与妊娠调控密切相关。4.妊娠大鼠阴道壁注射不同剂量的IFN-γ后,下丘脑-垂体-性腺轴中IGF-1和IL-18的表达变化各不相同。注射100IU/g体重、500IU/g体重的IFN-γ后,下丘脑视前区视前室周核等核团中IGF-1和IL-18的表达均下调,下丘脑其它核团及垂体、子宫和卵巢中IGF-1和IL-18的表达也有不同程度的变化。在外周血中,妊娠早期的植入后期IGF-1和IL-18的表达水平有不同程度的下调。提示,高剂量的IFN-γ对妊娠期大鼠下丘脑-垂体-性腺轴中IGF-1和IL-18的表达及植入后期大鼠外周血中IGF-1和IL-18的水平均具有调控作用。表明IFN-γ对妊娠的调控是非常复杂和精细的。5.给妊娠早期大鼠注射高剂量的IFN-γ(500IU/g体重),会造成胚胎丢失和妊娠终止。这可能是IFN-γ不同程度的下调了子宫和卵巢中IGF-1和IL-18的表达及外周血中IGF-1和IL-18的水平而造成的妊娠终止,结果提示,注射高剂量IFN-γ是机体免疫调控紊乱,妊娠失败的原因之一。6.阴道壁注射小剂量(2IU/g体重)的IFN-γ,可上调流产大鼠子宫和卵巢中IL-18mRNA及IL-18蛋白表达的同时还可以上调外周血中IL-18的水平,使其接近正常妊娠组,结果提示外源注射小剂量的IFN-γ可以通过调节机体内一些细胞因子的水平,在维持妊娠中具有重要作用。7.米非司酮致大鼠流产后,其外周血血清中IGF-1和IL-18的水平均有所降低,而注射小剂量的IFN-γ其水平又有所回升,IFN-γ可能是通过调节妊娠大鼠下丘脑-垂体-性腺轴IL-18和IGF-1的水平来抑制流产引发的炎症过程,从而通过免疫途径调控并维持妊娠。提示临床检测妊娠早期大鼠外周血中IL-18和IGF-1的水平对于预防胚胎丢失和流产具有一定的参考价值。8. IFN-γ与IGF-1、IL-18的表达存在密切关系。正常妊娠时,注射高剂量IFN-γ引起IGF-1和IL-18的表达下调,打破了Th1/Th2型细胞因子平衡关系,造成妊娠终止。注射小剂量的IFN-γ则通过下丘脑-垂体-性腺轴的途径及血液反馈途径上调IGF-1和IL-18的表达,影响母胎界面的免疫微环境,调节流产大鼠Th1/Th2型细胞因子平衡,维持妊娠。IFN-γ在预防妊娠早期流产中发挥着重要作用。
曹力[10]2007年在《流产大鼠IFN-γ和IL-10的表达及外源IFN-γ对流产的影响》文中研究说明为了探讨妊娠过程中细胞因子的相互作用及在流产发生中的机理,本试验采用超敏感的免疫组织化学SP法研究了正常妊娠大鼠及米非司酮致流产大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴中IFN-γ和IL-10的分布及变化特点,同时外源注射不同剂量IFN-γ,研究了IFN-γ对米非司酮致流产大鼠IL-10的表达变化及对妊娠结局的影响。主要结果如下:1. IFN-γ和IL-10免疫反应阳性细胞在正常妊娠大鼠及流产大鼠下丘脑广泛分布,主要分布于下丘脑的视前大细胞核、交叉上核、视上核、弓状核、室旁核和室周核等。IFN-γ和IL-10阳性细胞还分布于腺垂体、黄体及卵泡组织中。2在正常妊娠大鼠及流产大鼠下丘脑中,流产组IFN-γ和IL-10的表达强于正常妊娠组。表明母体为维持胎儿正常发育,尽力维持两种细胞因子之间的平衡.3在腺垂体中,流产组IFN-γ的表达增强,而IL-10表达降低,免疫反应阳性细胞数目减少。在卵巢中,流产组IFN-γ的表达增强,IL-10表达降低。说明腺垂体、卵巢中IFN-γ和IL-10的表达变化与流产的发生有密切关系。4第叁脑室周区的IFN-γ和IL-10阳性神经元其胞体与突起嵌入室管膜上皮内,另有一些神经元距室管膜有一定距离,但有突起伸入室管膜。提示IFN-γ和IL-10的这些阳性神经元可能在脑与脑脊液、神经体液信息传递回路中起中介作用。5外源注射小剂量IFN-γ(1U/g体重-10U/g体重),能够引起米非司酮致流产大鼠下丘脑、垂体中IL-10阳性细胞表达增强、数目增多,引起卵巢黄体、卵泡颗粒细胞中IL-10的表达显着增强,子宫胚胎吸收率减少。提示小剂量IFN-γ可能通过下丘脑、垂体、卵巢轴调控IL-10的表达,影响神经内分泌功能,防止胚胎吸收,有防止流产的作用。6外源注射大剂量IFN-γ(50U/g体重以上),可使黄体和卵泡颗粒细胞中的IL-10表达减弱,提示外源注射大剂量IFN-γ有促流产作用。
参考文献：
[1]. 信号转导和转录激活因子3在小鼠子宫及黄体中的表达与调节[D]. 滕春波. 东北农业大学. 2003
[2]. 蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在小鼠胚胎植入中的生理作用及机制[D]. 冉昊. 中国农业大学. 2015
[3]. Rictor/mTORC2通路在卵子发生与早发性卵巢功能不全中的作用及其机制研究[D]. 汪丽萍. 南方医科大学. 2017
[4]. 前列腺素和孕酮对小鼠黄体退化中Slit/Robo表达的调节及相关机理[D]. 张学敬. 中国农业大学. 2014
[5]. PGF诱导的MAPK与立早基因（ATF3、NR4A1和NR4A2）在假孕大鼠黄体中的表达与定位[D]. 郭南南. 南京农业大学. 2015
[6]. 牦牛周期黄体退化过程中黄体细胞凋亡的生物学特征[D]. 李晓明. 甘肃农业大学. 2004
[7]. 比格犬子宫与卵巢ERα、ERβ的表达及ERβ新剪接异构体的研究[D]. 许琴. 中国人民解放军军事医学科学院. 2013
[8]. Smad信号转导通路相关基因表达与湖羊高繁殖力关系的研究[D]. 徐业芬. 南京农业大学. 2010
[9]. IGF-1、IL-18在妊娠大鼠下丘脑—垂体—性腺轴的表达及IFN-γ对其表达和对妊娠的影响[D]. 司丽芳. 西北农林科技大学. 2010
[10]. 流产大鼠IFN-γ和IL-10的表达及外源IFN-γ对流产的影响[D]. 曹力. 西北农林科技大学. 2007
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