ECH和YIP调控子叶表皮铺板细胞形态建成机制的初步研究

论文摘要

拟南芥子叶表皮细胞（cotyledon pavement cell,PC）是一种具有特殊形态的细胞,类似于七巧板形状,呈现相互交错的嵌合状态。据报道,子叶表皮细胞的嵌合状态是通过调控细胞的各向异性生长而形成,受ROP小G蛋白（Rho-related GTPase of plants）的调控,主要是ROP2和ROP6蛋白的作用。另有报道发现两种蛋白:ECH（ECHIDNA）和YIP（YPT/RAB GTPase Interacting Protein）彼此之间具有互作,在拟南芥中形成一种定位于反面高尔基网（transgolgi network,TGN）的复合物,调控细胞壁合成成分的运输过程。ROP蛋白和ECH/YIP二者能够影响拟南芥细胞伸长,改变细胞的形状,因此,本研究猜想ECH/YIP与ROP在某方面可能存在联系。然而,关于ECH和YIP如何通过影响ROP而进一步调控子叶表皮细胞形态建成的机制尚不清楚。本项研究中,选用拟南芥子叶作为材料,研究了ECH和YIP与ROP2/ROP6的关系、与细胞骨架的关系。首先本研究通过杂交得到ech/GFP-ROP2,yip4a yip4b/GFP-ROP2,ech/GFP-ROP6,yip4a yip4b/GFP-ROP6株系,杂交株系的表型均趋向于ech和yip4a yip4b,植株变矮、多分支,子叶变得细尖。在ECH和YIP蛋白缺失时,研究发现,不管是细胞质内还是细胞膜上,ROP2和ROP6的表达均受影响。为进一步证明这个结论,本研究在转录水平上证实了ROP2和ROP6的mRNA表达会降低,说明ECH和YIP可能直接或间接调控ROP2和ROP6基因的表达。同时,在蛋白水平上,本研究检测了ROP2和ROP6总蛋白的表达情况,发现除了ROP2蛋白在ech中升高之外,ROP6在ech、ROP2与ROP6在yip4a yip4b中总蛋白的表达均降低。接着,为了研究ROP活性与ECH和YIP的联系,通过Pull-down实验发现ROP2蛋白在突变体中活性降低,说明ECH和YIP可能是ROP2的上游效应因子,能够激活ROP2;而ROP6在yip4a yip4b中活性降低,在ech中活性却升高。这说明了PC中ROP的激活过程需要ECH和YIP参与。由于ROP能够调控细胞骨架,进一步从细胞骨架角度研究,发现ech和yip4a yip4b中微管变得整齐,微丝变得纤细且整齐,细胞骨架的混乱程度减弱。另外,本研究通过构建ECH、YIP4a和YIP4b过表达载体和瞬时表达实验,初步发现ECH/YIP基因在子叶中呈点状定位,证明了ECH和YIP定位于反面高尔基体网上。在ECH、YIP4a和YIP4b组织表达模式方面,本研究使用GUS染液追踪了子叶发育的不同阶段中ECH和YIP的表达位置和表达量。这为研究ECH和YIP在子叶表皮细胞形态建成的调控作用奠定了基础。综上所述,本研究以ECH和YIP调控细胞伸长为启发点,以ROP能够调控细胞的形态建成、影响子叶表皮细胞的嵌合状态为出发点,阐明了ECH和YIP的存在能够影响ROP的表达和蛋白活性,进而改变拟南芥子叶表皮细胞的嵌合状态。通过进一步分析对细胞骨架的影响,本研究发现了ECH和YIP影响微管和微丝的重排,最终证明了ECH和YIP参与细胞的形态建成。本次研究为进一步探索ECH和YIP在子叶表皮细胞形态建成中的调控通路提供了一个新的研究进展。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 拟南芥子叶

1.2 子叶表皮铺板细胞

1.2.1 子叶表皮细胞的介绍

1.2.2 ROP与子叶表皮细胞的研究进展

1.3 ECH和 YIP的研究进展与功能

1.3.1 ECH和 YIP的研究进展

1.3.2 ECH和 YIP的功能

1.4 本项目的研究内容和拟解决的关键问题

1.4.1 研究内容

1.4.2 拟解决的关键问题

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验所用植物

2.1.2 实验所用菌株

2.1.3 实验所用载体

2.2 实验试剂

2.3 实验仪器

2.4 培养基配制

2.5 实验方法

2.5.1 消毒拟南芥种子

2.5.2 拟南芥的种植

2.5.3 PCR程序和反应体系

2.5.4 抗生素的配制

2.5.5 制备感受态细胞

2.5.6 大肠杆菌的转化

2.5.7 农杆菌感受态的转化

2.5.8 构建载体

2.5.9 农杆菌介导的植物遗传转化法

2.5.10 提取拟南芥DNA（粗提）

2.5.11 子叶表皮铺板细胞观察和统计

2.5.12 T-DNA鉴定

2.5.13 激光共聚焦显微镜

2.5.14 实时荧光定量PCR检测

2.5.15 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及 Western 免疫印迹实验

2.5.16 ROP活性

2.5.17 GUS染色

2.5.18 拟南芥的瞬时表达方法

2.5.19 GFP-Trap beads鉴定蛋白

3 结果与分析

3.1 ECH和 YIP调控拟南芥细胞伸长

3.1.1 ech和 yip4a yip4b植株表型分析

3.1.2 ech和 yip4a yip4b子叶表皮铺板细胞表型

3.2 突变体子叶中ROP2和ROP6 的亚细胞定位

3.3 ECH和 YIP影响子叶中ROP2和ROP6 的表达

3.3.1 ech和 yip4a yip4b中内源ROP2和ROP6 的转录水平分析

3.3.2 ROP在 ech与 yip4a yip4b中的转录水平分析和蛋白水平分析

3.4 子叶中ROP2和ROP6 的激活过程需要ECH和YIP

3.5 ech/rop24i6 突变体鉴定及子叶表皮细胞表型统计分析

3.6 ECH和 YIP调控细胞骨架

3.6.1 ech/GFP-TUA和 yip4a yip4b/GFP-TUA中微管排列统计分析

3.6.2 ech/FABD2-GFP中微丝排列分析

3.7 幼苗中ECH和 YIP的组织表达模式分析

3.8 子叶中的ECH和 YIP定位于TGN上

3.8.1 ECH和 YIP过表达株系表型分析与鉴定

3.8.2 ECH和 YIP与反面高尔基体网共定位

4 讨论

4.1 ECH和 YIP调控细胞伸长过程

4.2 ECH和 YIP影响ROP亚细胞定位和转录水平

4.3 ECH和 YIP影响ROP蛋白激活过程

4.4 ECH和 YIP影响细胞骨架的重排过程

参考文献

附录 A 鉴定所用QPCR引物及其他引物

附录 B 载体构建引物

附录 C 缺失ECH和YIP对内吞作用无重要影响

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张珊珊

导师: 林德书

关键词: 子叶表皮细胞,细胞形态建成

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 福建农林大学

分类号: Q943

总页数: 68

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ECH和YIP调控子叶表皮铺板细胞形态建成机制的初步研究

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