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受体相互作用蛋白RIP1在抗结核免疫中的作用及其互作蛋白的筛选

2020-12-08阅读(920)

受体相互作用蛋白RIP1在抗结核免疫中的作用及其互作蛋白的筛选

论文摘要

结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（M.tuberculosis,MTB）感染引起的慢性传染病,属于人畜共患病,对人类健康和畜牧业发展造成了严重威胁。免疫系统中巨噬细胞吞噬MTB后,引发的天然免疫反应强度与机体抗结核水平有重要关系。RIP1作为受体相互作用蛋白家族（receptor-interacting proteins,RIPs）中第一个被发现的成员,被认为在固有免疫应答中发挥了关键作用,但是目前尚没有RIP1在巨噬细胞抗结核免疫中的相关报道。为了研究RIP1在结核感染后固有免疫应答中的作用,首先利用慢病毒包装感染的方式建立了小鼠Rip1基因稳定过表达巨噬细胞株（RAW-RIP1）,以此细胞株为研究材料,观察RIP1对于细胞抗结核能力变化的影响。攻菌试验证明,过表达RIP1的巨噬细胞感染结核分枝杆菌后,相比较野生型细胞,胞内活菌增殖受到一定程度的抑制,IL-12p40、TNF-α等促炎症因子分泌水平有显著升高,提示RIP1可能通过适度激活炎症信号通路提高了巨噬细胞的抗结核能力。接下来,针对RIP1这一潜在的结核治疗靶点,通过酵母双杂交的方法筛选了RIP1的互作蛋白,希望从蛋白质互作角度研究其调控免疫反应的作用机制。首先在Y187酵母菌株中建立了小鼠巨噬细胞cDNA文库:提取小鼠巨噬细胞RAW264.7的RNA,利用SMARTTM技术合成第一链cDNA,长距离PCR（LD-PCR）扩增双链cDNA后,使用CHOMA SPIN+TE-400柱子纯化ds cDNA,使用LiAc法将纯化好的ds cDNA与pGADT7-RecAB载体共转化入Y187酵母感受态细胞中,将转化液铺板于150mmSD/-Leu选择培养基上,30℃培养3d,收获转化子,用冻存液重悬后进行细胞计数,分装每管1ml于-80℃保存。经鉴定,文库库容达到8.6×106 cfu,平均插入片段长度达到1.45kb,可以用于后续互作蛋白的筛选。在此基础上,进一步根据NCBI公布的小鼠Rip1基因序列,将编码区插入pGBKT7载体中,构建诱饵载体,将诱饵载体转化Y2H酵母感受态细胞（Bati-RIP1）,经过毒性和自激活检测,证明其可以直接用于杂交筛选。将Bati-RIP1与文库混合,30℃,40 rpm/min杂交20 h,离心收集接合子后铺板于150mm DDO/X/A选择培养基,30℃培养4d后挑选蓝色克隆接种于QDO/X/A选择培养基,30℃培养5d后挑选蓝色克隆扩大培养提取质粒,经测序鉴定出2个RIP1互作蛋白,分别为Isochorismatase结构域蛋白1（ISOC1）和RNA结合蛋白家族Pumilio成员PUM2。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）确认RIP1与ISOC1和PUM2确实可以在巨噬细胞内发生互作。综上所述,本研究初步证明了RIP1在结核感染后通过适度增强炎症反应提高了巨噬细胞的抗结核能力,是潜在的结核治疗靶点之一,并通过建立小鼠巨噬细胞cDNA文库和酵母双杂交筛选,鉴定了RIP1与ISOC1、PUM2的互作关系,为接下来深入研究RIP1调节结核菌感染引发的免疫反应机制奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 结核病与抗结核免疫
  •     1.1.1 结核病概述
  •     1.1.2 结核病免疫学
  •   1.2 受体相互作用蛋白家族
  •     1.2.1 RIPs成员结构特点
  •     1.2.2 RIP1 在炎症相关免疫反应中的作用
  •   1.3 基于片段互补的蛋白质互作研究技术
  •     1.3.1 酵母双杂交
  •     1.3.2 双分子荧光互补
  • 第二章 RIP1在巨噬细胞抗结核免疫中的作用
  •   2.1 主要试剂、载体、菌株和细胞
  •     2.1.1 试剂
  •     2.1.2 载体
  •     2.1.3 菌株和细胞
  •   2.2 主要溶液的配置
  •   2.3 研究方法
  •     2.3.1 小鼠Rip1 基因稳定过表达巨噬细胞株的构建
  •     2.3.2 RIP1 在巨噬细胞抗结核免疫中的作用
  •   2.4 结果
  •     2.4.1 建立稳定过表达RIP1 的巨噬细胞株
  •     2.4.2 RIP1 在巨噬细胞抗结核免疫中的作用
  •   2.5 讨论与小结
  • 第三章 小鼠巨噬细胞cDNA文库的构建
  •   3.1 主要试剂、载体、菌株和细胞
  •     3.1.1 试剂
  •     3.1.2 载体
  •     3.1.3 菌株和细胞
  •   3.2 主要溶液的配置
  •   3.3 研究方法
  •     3.3.1 第一链cDNA的合成
  •     3.3.2 长距离PCR（LD-PCR）扩增dscDNA
  •     3.3.3 CHROMA SPIN+TE-400 纯化柱纯化dscDNA
  •     3.3.4 酵母双杂交文库的建立
  •   3.4 结果
  •   3.5 讨论与小结
  • 第四章 酵母双杂交筛选RIP1 相互作用蛋白
  •   4.1 主要试剂、载体、菌株和细胞
  •     4.1.1 试剂
  •     4.1.2 载体
  •     4.1.3 菌株和细胞
  •   4.2 主要溶液的配置
  •   4.3 研究方法
  •     4.3.1 小鼠Rip1 诱饵载体的构建
  •     4.3.2 pGBKT7-Rip1 转化酵母菌株Y2H
  •     4.3.3 RIP1 在酵母中的表达检测
  •     4.3.4 Bait-RIP1 自激活检测
  •     4.3.5 Bait-RIP1 毒性检测
  •     4.3.6 酵母双杂交
  •     4.3.7 RIP1 互作蛋白的鉴定
  •   4.4 结果
  •     4.4.1 RIP1 诱饵载体及菌株的构建
  •     4.4.2 酵母双杂交结果
  •     4.4.3 免疫共沉淀验证RIP1与ISOC1、PUM2 的互作关系
  •   4.5 讨论与小结
  • 第五章 结论
  • 附录 A 主要仪器和耗材
  • 附录 B 贴壁细胞培养方法
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 付蓓蓓

    导师: 张涌

    关键词: 受体相互作用蛋白,结核分枝杆菌,炎症反应,酵母双杂交

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学

    分类号: S852.4

    总页数: 66

    文件大小: 2100K

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