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干扰素刺激基因12（ISG12）抑制新城疫病毒复制的机制研究

2020-12-08阅读(414)

干扰素刺激基因12（ISG12）抑制新城疫病毒复制的机制研究

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的危害最严重的禽类传染病之一,具有高热、呼吸困难、接触性传播、败血经过等特点,给我国及世界养禽业造成了严重的经济损失。目前,免疫接种是预防和控制新城疫的主要途径,但有些时候得不到理想的效果,因此需要探索新的防制策略。本实验室前期通过RNA-Seq技术,筛选出NDV感染机体后与免疫相关的多个差异表达基因,从中挑选出干扰素刺激基因12（1）和12（2）（ISG12（1）/（2））进行抗病毒研究。本论文的主要研究结果如下:（1）NDV感染可诱导ISG12（1）和ISG12（2）表达。在NDV F48E9感染的10日龄SPF鸡胚和4周龄SPF鸡的法氏囊中,利用RT-qPCR对前期转录组数据进行验证,结果表明ISG12（1）/（2）表达显著上调。在不同毒力NDV感染的CEF和DF-1细胞中,也显示ISG12（1）上调,在NDV F48E9感染的DF-1细胞中,ISG12（2）表达也上调。提示ISG12可能在NDV感染中发挥一定的作用。（2）ISG12（1）和ISG12（2）均抑制NDV复制。构建鸡ISG12（1）/（2）的真核表达质粒,转染DF-1细胞后检测过表达ISG12（1）/（2）对NDV复制的影响。结果表明ISG12（1）/（2）过表达均能够显著抑制NDV复制,减少细胞上清中的病毒滴度。将ISG12（1）/（2）的干扰RNA（siRNA）转染DF-1细胞后,ISG12（1）/（2）表达受到抑制,促进了NDV复制。（3）ISG12（1）通过线粒体凋亡通路促进NDV诱导的细胞凋亡从而抑制NDV复制。在DF-1细胞中过表达/敲低ISG12（1）,流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示ISG12（1）可促进细胞凋亡。通过激光共聚焦显微镜发现ISG12（1）定位于线粒体,并且ISG12（1）还与促凋亡蛋白Bax共定位且促进Bax由细胞质到线粒体的重新分布。分别通过RT-qPCR以及Western blot检测线粒体凋亡通路相关分子的mRNA及蛋白水平的变化,结果显示过表达ISG12（1）后,促凋亡基因Bax、Bak、Cyt c、caspase3和caspase9显著上调,抑凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl显著下调,干扰ISG12（1）表达后得到相反的结果。这些结果表明ISG12（1）在NDV感染中可以通过线粒体凋亡通路介导细胞凋亡实现对NDV增殖的抑制作用。（4）ISG12（2）通过激活I型干扰素信号通路抵抗NDV感染。首先通过Western blot检测过表达/敲低ISG12（2）后凋亡相关基因的变化,结果显示ISG12（2）对凋亡相关分子影响作用不大,并且通过流式细胞术试验也表明过表达ISG12（2）对细胞凋亡作用不显著,以上结果表明ISG12（2）抑制NDV增殖并非依赖于细胞凋亡途径。过表达ISG12（2）后,利用RT-qPCR方法检测IFNs相关细胞因子变化,发现ISG12（2）过表达可明显促进IFNα和IFNβ的表达,并且促进MDA5、MAVS、IRF7和NF-κB的表达,反之过表达IFNα、IFNβ也可促进ISG12（2）的表达。此外,过表达ISG12（2）的细胞上清可明显抑制猪水泡性口炎病毒（VSV）的增殖,干扰ISG12（2）表达后可得到相反的结果。以上结果表明ISG12（2）可以调节干扰素的产生进而发挥抗NDV作用。通过免疫共沉淀联合质谱分析筛选了14个与ISG12（2）相互作用的宿主蛋白,对这些蛋白进行Go分类和通路分析,它们可能参与生物合成、代谢等生物过程,参与到Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路等,为深入研究ISG12（2）抗病毒机制奠定基础。综上所述,NDV感染机体后ISG12（1）和ISG12（2）均显著上调,ISG12（1）通过激活线粒体凋亡通路,与促凋亡蛋白Bax共定位诱导细胞凋亡抑制NDV增殖。ISG12（2）则通过促进干扰素的表达来抑制NDV感染。细胞凋亡和天然免疫都是细胞的基本防御机制,ISG12蛋白家族的两个成员分别通过这两种机制抵御病原体的入侵。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 新城疫概述
  •     1.1.1 NDV病原生物学特征
  •     1.1.2 ND的流行情况
  •     1.1.3 ND的防治
  •   1.2 NDV与宿主的相互作用
  •     1.2.1 NDV与宿主天然免疫应答
  •     1.2.2 NDV与细胞凋亡
  •   1.3 ISG12 简介
  •     1.3.1 ISG12 的发现
  •     1.3.2 ISG12 基因家族
  •     1.3.3 ISG12 相关的功能研究
  •   1.4 本研究的目的和意义
  • 第二章 ISG12（1）对NDV复制影响及机制
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 SPF鸡胚、SPF鸡
  •     2.1.2 细胞、质粒、菌株与毒株
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 主要仪器及常用试剂配制
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 ISG12（1）真核表达载体的构建与鉴定
  •     2.2.2 ISG12（1）真核重组质粒的转染与表达验证
  •     2.2.3 NDV感染机体或细胞后ISG12（1）表达变化检测
  •     2.2.4 ISG12（1）对NDV复制影响的检测
  •     2.2.5 ISG12（1）对细胞凋亡影响的检测
  •     2.2.6 激光共聚焦
  •     2.2.7 统计学分析
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 载体构建与鉴定
  •     2.3.2 NDV感染后在体内外ISG12（1）表达均显著上调
  •     2.3.3 过表达ISG12（1）抑制NDV的复制
  •     2.3.4 干扰ISG12（1）表达可促进NDV的复制
  •     2.3.5 过表达ISG12（1）促进NDV诱导的DF-1 细胞凋亡
  •     2.3.6 干扰ISG12（1）表达可抑制NDV诱导的DF-1 细胞凋亡
  •     2.3.7 ISG12（1）定位于线粒体
  •     2.3.8 ISG12（1）与Bax共定位并促进Bax的重新分布
  •     2.3.9 ISG12（1）通过激活线粒体凋亡通路促进了NDV诱导的凋亡
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 ISG12（2）对NDV复制影响及机制
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 SPF鸡胚、鸡
  •     3.1.2 细胞、质粒、菌株与毒株
  •     3.1.3 主要试剂
  •     3.1.4 主要仪器及常用试剂配制
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 ISG12（2）真核表达载体的构建与鉴定
  •     3.2.2 ISG12（2）真核重组质粒的转染与表达验证
  •     3.2.3 NDV感染机体或细胞后ISG12（2）表达变化检测
  •     3.2.4 ISG12（2）对NDV复制影响的检测
  •     3.2.5 ISG12（2）对细胞凋亡影响的检测
  •     3.2.6 ISG12（2）诱导干扰素能力检测
  •     3.2.7 免疫共沉淀联合质谱分析ISG12（2）与宿主互作蛋白
  •     3.2.8 统计学分析
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 载体构建与鉴定
  •     3.3.2 NDV感染后ISG12（2）显著上调
  •     3.3.3 过表达ISG12（2）抑制NDV的复制
  •     3.3.4 干扰ISG12（2）表达可促进NDV的复制
  •     3.3.5 ISG12（2）发挥非凋亡的抗病毒机制
  •     3.3.6 ISG12（2）激活I型干扰素信号通路
  •     3.3.7 过表达ISG12（2）质谱分析
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李晓琴

    导师: 杨增岐

    关键词: 新城疫病毒,病毒复制,作用机制

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家自然科学基金(NO.31572538)

    分类号: S852.65

    总页数: 70

    文件大小: 5799K

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