导读:本文包含了容积敏感性氯通道论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:通道,敏感性,容积,心肌,心室,细胞,膜片。
容积敏感性氯通道论文文献综述
徐剑英,刘勇,郑衍芳,王立伟,陈丽新[1]（2018）在《I~-激活人甲状腺原代细胞容积敏感性氯通道的研究》一文中研究指出目的:探讨I~-诱导的人甲状腺原代细胞的氯通道的电生理学及药理学特性。方法:干贴壁法进行原代细胞培养;免疫荧光法鉴定甲状腺原代细胞;全细胞膜片钳技术记录细胞氯通道电流;阴离子置换法研究氯通道离子选择性。结果:细胞外灌流NaI(1μmol/L)可激活甲状腺原代细胞膜氯通道开放,产生氯电流,该电流有明显外向优势,无电压及时间依赖性失活,其翻转电位接近氯离子平衡电位。该电流可被氯通道阻断剂NPPB抑制,同时该电流具有容积敏感性,能够被47%高渗溶液抑制。该通道对阴离子的通透性依次为:I~->Br~->Cl~->Gluconate~-。结论:NaI可以激活人甲状腺原代细胞容积敏感性氯通道,该通道对I~-的通透性高于Cl~-。(本文来源于《黑龙江医药科学》期刊2018年03期）
霍聪[2]（2017）在《容积敏感性氯通道对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的作用》一文中研究指出心肌肥厚是指心脏在长期负荷增加的情况下,心肌组织出现的增生性变化,表现为心肌细胞肥大,心肌纤维细胞增生,基质重构。虽然心肌肥厚在应激初期具有血流动力学方面的代偿意义,但持续性心肌肥厚可使心肌细胞损伤、纤维化,心脏收缩和舒张功能出现障碍,最终可导致心力衰竭甚至猝死。因此,深入研究心肌肥厚的发生发展机制,具有重要的临床意义。大量研究表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)对心肌肥厚形成和发展起重要作用。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAAS的主要效应物质,它可以通过多种途径诱导心肌肥厚,活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)是其中的关键信号通路之一。容积敏感外向整流性氯通道(volume-sensitive outwardly rectifying chloride channel,VSOR Cl-)也称容积敏感性氯通道,在哺乳动物各组织细胞中广泛表达,参与了细胞增殖、迁移、分化、凋亡等多种生理病理过程,但顾名思义,其最主要的生理功能是调节细胞容积。当细胞容积增大时,VSOR Cl-通道开放,使水伴随着氯离子及其他渗透性物质排出细胞,维持细胞容积,此称之为调节性容积减少(regulatory volume decrease,RVD)。而心肌肥厚的最主要生理学基础是心肌肥大,即心肌细胞容积不可逆性增大,那么,在Ang II诱导心肌细胞肥大的过程中,是否有VSOR Cl-通道的参与?它发挥了何种作用?是通过什么机制?基于此科学假设,本研究在Ang II诱导心肌细胞肥大的模型上,观察VSOR Cl-通道的变化,并通过氯通道阻滞剂4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸(4,4-diisothiocya nostilbene-2,2’disulfonic acid,DIDS)及沉默VSOR Cl-通道的通道蛋白LRRC8A来阻断VSORCl-通道,检测其对Ang II诱导心肌细胞肥大的影响,并探讨其可能的机制。研究目的:1.构建Ang II诱导心肌细胞肥大模型。2.观察Ang II对VSOR Cl-电流及VSOR Cl-通道蛋白LRRC8A的表达的影响。3.探讨阻断VSOR Cl-通道对Ang II诱导心肌肥大的作用及可能的机制。研究方法:1.实验分组:分正常对照组、Ang II组、Ang II+si RNA组、Ang II+DIDS组、si RNA组、DIDS组,分别检测细胞面积、肥厚基因m RNA表达、ROS水平和NADPH氧化酶活性。2.H9C2心肌细胞培养及Ang II刺激构建心肌肥大模型。3.鬼笔环肽免疫荧光染色H9C2细胞显示细胞骨架检测细胞面积。4.实时定量PCR检测H9C2心肌肥大标志物ANP和β-MHC以及LRRC8A的m RNA的表达情况。5.Western-blot技术检测H9C2细胞中LRRC8A的蛋白表达水平。6.全细胞膜片钳技术检测H9C2心肌细胞VSOR Cl-电流变化。7.含有si RNA的腺病毒转染H9C2心肌细胞。8.荧光探针DCFH-DA染色检测H9C2心肌细胞内ROS水平。9.活性试剂盒检测NADPH氧化酶活性。研究结果:1.Ang II诱导H9C2心肌细胞肥大模型的构建:按Ang II经典刺激浓度10-6mol/L分别处理H9C2心肌细胞0h、12h、24h、36h、48h、72h。心肌细胞面积及肥大基因ANP、β-MHC的m RNA水平呈时间依赖性升高,其中心肌细胞面积在48h达到最大(P<0.05,n=100),肥大基因ANP、β-MHC的m RNA水平在36h达到最大(P<0.05,n=6),确定了检测上述各指标的最佳作用时间。2.Ang II对H9C2心肌细胞LRRC8A的影响:Ang II处理H9C2心肌细胞,能使LRRC8A的m RNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性升高。10-6mol/L Ang II分别作用36h和48h时,LRRC8A的m RNA和蛋白表达水平达到最大(P<0.05,n=6;n=3)。3.腺病毒RNAi干扰实验:含有si RNA的腺病毒转染H9C2心肌细胞72小时后,可有效下调LRRC8A的m RNA及蛋白表达水平,从4个候选序列中,筛选出沉默效果最好的片段供实验使用。4.Ang II对H9C2心肌细胞VSOR Cl-电流的影响:在等渗条件下,Ang II 20μmol/L作用10分钟能激活VSOR Cl-电流,而si RNA沉默LRRC8A可以显着抑制Ang II激活VSOR Cl-电流,峰电流下降81.60±5.88(P<0.05,n=4)。5.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对Ang II诱导H9C2细胞肥大的影响:免疫荧光染色检测细胞面积结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌细胞面积明显增加(P<0.05,n=100),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=100);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组细胞面积明显减小(P<0.05,n=100);实时定量PCR结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌ANP和β-MHC m RNA表达量明显增加(P<0.05,n=6),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=6);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组心肌ANP和β-MHC m RNA表达量明显减小(P<0.05,n=6)。6.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对Ang II诱导细胞ROS生成影响:荧光探针DCFH-DA检测结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌内ROS含量明显增加(P<0.05,n=5),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=5);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组心肌内ROS含量明显减小(P<0.05,n=5)。其中Ang II+si RNA组比Ang II+DIDS组ROS含量减少的更为显着(P<0.05,n=5)。7.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对H9C2心肌细胞中NADPH氧化酶活性的影响,结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌细胞NADPH氧化酶活性明显增加(P<0.05,n=5),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=5);与Ang II组相比,Ang II+si RNA组心肌细胞氧化酶活性明显减小,而Ang II+DIDS组无差异(P<0.05,n=5)。研究结论:1.Ang II可显着地增加心肌细胞面积及肥大基因ANP、β-MHC的m RNA表达,成功构建了Ang II诱导心肌细胞肥大模型。2.Ang II处理H9C2心肌细胞可显着增加LRRC8A蛋白和m RNA表达量,并呈浓度和时间依赖性的正相关,同时Ang II也可激活VSORCl-电流,该电流可被沉默LRRC8A所阻断。3.应运DIDS及沉默LRRC8A阻断VSOR Cl-通道可以抑制Ang II诱导的心肌肥大。4.沉默LRRC8A可有效抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS的生成,此可能为其抑制Ang II诱导细胞肥大的机制。(本文来源于《第四军医大学》期刊2017-05-01）
夏跃胜[3]（2015）在《容积敏感性氯通道通过自噬调节心肌缺血/再灌注损伤的作用及机制》一文中研究指出在突发性的心血管事件中,及时恢复血流供应是挽救缺血心肌的关键措施,如冠状动脉搭桥术(bypass operation of coronary artery,CABG),心肌梗死溶栓(myocardial infarction thrombolysis)、冠脉痉挛(coronary artery spasm)及心搏骤停行心肺复苏等,但血流恢复过程中,大量伴随的病理事件加重了心肌损伤,即心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。I/R损伤是心血管病中一个重要的病理过程,其机制至今未完全明确,除了炎性反应、钙超载、活性氧(reactive oxygen,ROS)和线粒体功能障碍等有关因素外,同时发现细胞膜离子通道蛋白的功能改变与I/R损伤有关,但目前确切的作用与机制尚不清楚。所以,进一步探讨心肌I/R损伤过程中离子通道的作用和机制,为临床I/R损伤的相关疾病提供新的、有效的治疗策略具有重要价值。自噬(autophagy)是细胞在营养缺乏或应激时降解自身蛋白和受损细胞器并经溶酶体包裹、消化,进行物质再循环利用的一种自我保护方式,在调控细胞损伤、老化和维护细胞内环境稳态方面起重要作用。自噬过强或不足均可引起心肌组织细胞损伤,导致心肌组织发生病理性改变或心脏功能异常。自噬性死亡是继细胞凋亡、坏死形式之后,一种新的溶酶体介导的程序性细胞死亡方式,其在心肌I/R中的调节作用受到了国际学术界的高度关注。在缺血/再灌注损伤中,自噬扮演着不同的角色,缺血期自噬轻度增加,具有一定的心肌保护作用,但再灌注期随着活性氧(ROS)持续升高,促进自噬异常增加,溶酶体相关蛋白(LAMP2)快速消耗,引发溶酶体功能障碍,导致自噬体不能被融合、消化,而在细胞内大量堆积,诱发心肌细胞自噬性死亡。近年来,研究发现细胞膜上各种离子通道蛋白在维护细胞内环境稳定与细胞的重要功能密切相关。本课题组前期在心肌细胞和在体心脏水平上,已证明阻断容积敏感性(VSOR)Cl-通道可抑制I/R过程中心肌凋亡的发生、减少心肌梗死面积,改善心脏功能,其主要机制是I/R导致ROS的增加,激活VSOR Cl-通道,而阻断VSOR Cl-通道也可抑制ROS水平,二者互为因果关系。然而,VSOR Cl-通道是否参与了自噬的调控,目前尚未见文献报道。本研究拟从细胞和在体两个水平I/R损伤心肌的模型上,通过改变氯通道功能,观察其对心肌细胞自噬水平的影响及调控机制。研究目的1.构建SD大鼠I/R损伤心肌梗死模型及原代大鼠心肌细胞模拟I/R损伤模型。2.探讨氯离子通道蛋白改变对心肌I/R损伤模型中心肌存活、心肌梗死面积及心脏功能的影响,进一步探讨自噬在该过程中的调控作用及机制。研究方法1.I/R模型构建:结扎雄性SD大鼠冠状动脉左前降支缺血30 min后,恢复灌注24-96h建立I/R模型。原代SD大鼠心肌细胞,采用缺血缺氧12h,再恢复血氧4h的方法模拟心肌细胞I/R损伤模型。2.实验分组:分为5组:对照组(Sham组),缺血/再灌注组(I/R组),I/R+NAC预处理组(NAC组)、I/R+DCPIB预处理组(DCPIB组)和I/R+3MA预处理组(3MA组)。各组分别在再灌注前10 min采用NAC、DCPIB及3MA进行预处理。3.生化分析仪检测血清心肌酶学指标。4.ELISA技术检测NF-κB和TNF-α水平。5.心脏超声检测大鼠心脏功能指标。6.伊文氏蓝和TTC双染色法检测心肌梗死面积。7.免疫组化、免疫荧光和Western-blot技术分别检测组织及细胞中LAMP2、LC3表达。8.应用荧光分光光度仪和荧光探针(DHE)分别检测组织及细胞中ROS水平。9.透射电镜检测组织细胞中自噬体和溶酶体。10.膜片钳全细胞记录技术为主检测心肌细胞VSOR Cl-电流变化。11.TUNNEL法检测心肌组织细胞的凋亡情况。12.MTT法检测细胞存活情况。13.Real-time PCR技术检测Beclin-1表达及脂质体转染沉默Beclin-1后表达水平。研究结果1.成功构建了SD大鼠I/R损伤心脏梗死模型和原代心肌细胞模拟I/R损伤的细胞模型。2.在体模型中,与Sham对照组相比,I/R组的心脏功能显着下降(P<0.05,n=6);血清中CK、CK-MB和LDH,心肌组织ROS水平、炎性因子NF-κB、TNF-α表达、自噬小体及自噬蛋白LC3表达均明显升高(P<0.01,n=6),而心肌梗死面积和LAMP2表达明显下降(P<0.01,n=6)。3.在体模型中,与I/R组相比,NAC组、DCPIB组和3MA组的心肌梗死面积显着下降(P<0.01,n=6);血清中CK、CK-MB和LDH,心肌组织ROS水平、炎性因子NF-κB、TNF-α表达、自噬小体及自噬蛋白LC3表达均明显下降(P<0.05,n=6),而心脏功能和LAMP2表达明显升高(P<0.01,n=6)。4.在体模型中,随再灌注时间的延长,LAMP2表达在不同组差异显着:I/R组24h内快速降低、3MA组在72h明显下降、而NAC和DCPIB组能持久维持LAMP2高表达(P<0.01,n=6)。心肌自噬小体数目与LAMP2表达强度成负相关(P<0.01,n=6)。5.原代心肌细胞I/R模型中,与sham组相比,I/R组中ROS水平、LC3表达、Beclin-1 m RNA表达及TUNEL阳性率均明显升高(P<0.01,n=5),LAMP2表达和细胞存活率显着下降(P<0.01,n=5)。6.原代心肌细胞I/R模型中,与I/R组比较,DCPIB组和NAC组可显着减少ROS生成、LC3表达、Beclin-1 m RNA表达及TUNEL阳性率(P<0.01),LAMP2表达和细胞存活率明显增加(P<0.05,n=5);同时发现,在DCPIB干预下,即使通过增加H_2O_2(1μM)增强ROS含量,DCPIB仍能维持LAMP2表达,降低自噬水平(P<0.01,n=5)。7.原代心肌细胞I/R模型中,与DCPIB和NAC组比较,3MA组的ROS生成、Beclin-1 m RNA表达及TUNEL阳性率均显着增加(P<0.05,n=5),LAMP2表达和细胞存活率下降(P<0.05,n=5)。8.应用全细胞膜片钳技术记录H_2O_2模拟再灌注损伤VSOR Cl-特征性电流(ICl,vol)的产生:高电压呈时间依赖性失活、电流呈外向整流性特性、对氯通道阻断剂敏感性,DCPIB可显着阻断ICl,vol(P<0.01,n=5);该电流也可被NAC显着阻断(P<0.01),但3MA组仅部分阻断(P<0.05,n=5)。9.原代心肌细胞I/R再灌注模型中,si RNA沉默Beclin-1组与I/R组相比,可明显阻断自噬水平(P<0.01,n=5);与DCPIB组比较,细胞存活率下降(P<0.01,n=5)。10.原代心肌细胞I/R再灌注模型中,与I/R组比较,DCPIB组可显着抑制ROS生成、降低LC3、Beclin-1 m RNA表达和TUNEL阳性率(P<0.01,n=5),降低NF-κB表达活性(P<0.01,n=5),持续维持LAMP2表达,细胞存活率明显增加(P<0.01,n=5)。研究结论1.成功构建了稳定的SD大鼠I/R损伤心脏梗死模型和原代心肌细胞模拟I/R损伤细胞模型,为进一步研究奠定了基础。2.阻断VSOR Cl-通道能够明显抑制I/R诱导的心肌损伤、增强心脏功能的保护,减少心肌梗死面积,其作用中除抑制了细胞凋亡的发生外,与抑制过度的心肌细胞自噬性死亡密切相关。3.阻断VSOR Cl-通道可明显抑制I/R诱导心肌自噬性死亡,其机制可能通过抑制ROS产生、阻断ICl,vol及降低NF-k B炎性因子的水平,部分抑制Beclin-1自噬通路,维持LAMP2高表达,减轻自噬体在细胞内堆积有关,从而达到保护心肌细胞的作用。(本文来源于《第四军医大学》期刊2015-05-01）
孟龙,王海波,邓志钦,汪源,伍嘉宝[4]（2014）在《冰片对鼻咽癌细胞容积敏感性氯通道的激活作用》一文中研究指出目的探讨冰片对低分化鼻咽癌(CNE-2Z)细胞氯通道的激活作用及对细胞容积的影响。方法采用全细胞膜片钳技术记录冰片激活CNE-2Z细胞膜电流,分析其电流特性;用活细胞图像法观察并测量冰片对细胞体积的影响。结果细胞外灌流冰片(20μmol·L-1)诱导CNE-2Z细胞膜氯通道开放,产生氯电流,该电流有明显外向优势,无电压及时间依赖性失活,其翻转电位接近氯离子平衡电位,该电流可被氯通道阻断剂tamoxifen抑制,细胞外灌流47%高渗溶液完全抑制该电流。细胞外灌流冰片30 min,细胞体积缩小约9.4%,该作用可被tamoxifen完全抑制。结论冰片可以激活低分化鼻咽癌细胞容积敏感性氯通道,导致细胞体积缩小,氯通道在冰片引起细胞体积缩小中起着重要作用。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2014年12期）
龚卫琴,李源,王晓明,张珊红,臧益民[5]（2007）在《Clcn3~(-/-)鼠心肌细胞容积敏感性氯通道的电生理学研究》一文中研究指出目的研究ClC-3基因敲除(Clcn3-/-)鼠心肌细胞容积敏感性氯通道的电生理学特点。方法制备Clcn3-/-鼠模型,采用膜片钳全细胞记录技术观察小鼠心肌细胞暴露于低渗溶液激活的容积敏感性氯电流及其蛋白激酶C(PKC)敏感性。结果Clcn3-/-鼠心肌细胞在等渗状态下的背景电流很小,低渗刺激后的2.3±1.0 min膜电导改变不明显,随后增大的电流呈外向整流性、电压和时间依赖性部分失活,电流-电压曲线上的反转电位接近氯平衡电位的理论值,反转电位随细胞外氯浓度([Cl-]o)降低向去极化电位方向偏移。氯通道阻断剂DIDS和NPPB可逆性抑制该通道的外向性膜电导,抑制强度分别为88.8%±2.6%和76.3%±2.1%。PKC激活剂PMA明显增大该电流,+100 mV和-100 mV增强幅度分别为110%±7%和110%±6%,而PKC抑制剂chelerythrine预处理能完全消除PMA的电流放大作用。结论Clcn3-/-鼠心肌细胞存在典型的容积敏感性氯通道,PKC激活参与上调该通道的功能性表达。(本文来源于《心脏杂志》期刊2007年01期）
徐洪涛,高连茹,杨晔,王军[6]（2006）在《氯通道阻断剂DIDS对心室肌容积敏感性氯通道电流的作用》一文中研究指出目的:研究氯通道阻断剂DIDS对容积敏感性氯通道电流的作用。方法:采用全细胞膜片钳方法记录急性分离小鼠心室肌细胞容积敏感性氯通道电流(volumesensitivechloridechannelcurrent,Icl,vol)。将小鼠心室肌细胞暴露于低渗溶液,激活容积敏感性氯通道电流。结果:该电流呈外向整流特征,去极化正电压时呈时间依赖性失活,其反转电位[(-34.5±0.8)mV]接近氯离子平衡电位的理论值(ECl=-38.6mV)。该通道的阴离子选择性为I->Br->Cl-。细胞外应用氯离子通道阻断剂DIDS(500μmolL),在+40mV,+60mV,+80mV,+100mV时能够明显阻断该电流,呈电压依赖性。在+100mV,可阻断电流的91.5%±1.1%(P<0.05)。结论:氯通道阻断剂DIDS能够呈电压依赖性地阻断小鼠心肌细胞容积敏感性氯通道电流。(本文来源于《心肺血管病杂志》期刊2006年01期）
徐洪涛,高连如,王军,臧益民[7]（2005）在《NPPB对心室肌细胞容积敏感性氯通道的影响》一文中研究指出目的 观察氯通道阻断剂对小鼠心室肌容积敏感性氯通道的影响。方法 采用急性分离的小鼠心 室肌细胞,低渗溶液激活容积敏感性氯通道电流,膜片钳全细胞记录法记录电流。结果 低渗溶液激活了一 个明显的容积敏感性氯通道电流,该电流具有明显的外向整流特征,能被5 硝基 2(3 苯丙胺) 苯甲酸可逆性 明显抑制,对内外向电流的抑制率几乎相等[(79.1±2.5)%比(77.1±2.2)%]。结论 小鼠心室肌细胞容积 敏感性氯通道电流具有外向整流性及时间依赖性失活特性,能被氯通道阻断剂所抑制,且该抑制作用具有一 定的电压依赖性。(本文来源于《海军总医院学报》期刊2005年01期）
徐洪涛,郭启煜,高连茹,费宇行,朱智明[8]（2003）在《氯通道阻断药对小鼠心室肌容积敏感性氯通道的影响》一文中研究指出目的 :观察氯通道阻断药 5 硝基 2 (3 苯丙胺 ) 苯甲酸 (NPPB)和他莫昔芬对小鼠心室肌容积敏感性氯通道的影响。 方法 :采用急性分离的小鼠心室肌细胞 ,低渗溶液激活容积敏感性氯通道电流 ,膜片钳全细胞记录法记录电流。 结果 :低渗溶液激活一个明显具有外向整流特征的容积敏感性氯通道电流。NPPB能可逆性抑制该电流且对内外向电流的抑制率几乎相等〔外向抑制 (79.1± 2 .5 ) % ,内向抑制 (77.1± 2 .2 ) %〕。而他莫昔芬对该电流的抑制以外向电流占优势〔外向抑制 (75 .1± 1 .2 ) % ,内向抑制 (4 1 .2± 3.2 ) %〕。 结论 :小鼠心室肌细胞容积敏感性氯通道电流对NPPB和他莫昔芬十分敏感 ,且他莫昔芬的抑制作用具有电压依赖性(本文来源于《医学研究生学报》期刊2003年07期）
徐洪涛,王军,高连茹,臧益民[9]（2003）在《小鼠心肌细胞的容积敏感性氯通道》一文中研究指出目的 :记录并研究急性分离小鼠心肌细胞容积敏感性氯通道电流的电生理学特征。方法 :采用全细胞膜片钳记录方法 ,记录急性分离的小鼠心肌细胞暴露于低渗溶液时 ,细胞体积增大后 ,出现的容积敏感性氯通道电流(volume_sensitivechloridechannelcurrent,ICl,Vol)。结果 :小鼠心肌细胞容积敏感性氯通道电流以外向电流占优势 ,在去极化正电压时有时间依赖性失活 ,电流_电压曲线显示其反转电位 [(_34.5± 0 .8)mV]接近氯离子平衡电位的理论值 (ECl=_38.6mV) ,且反转电位随细胞外氯离子浓度的改变而改变 ,Nerst方程常数为 4 3.9。电流的激活依赖于细胞内ATP。该通道的阴离子选择性为I_>Br_>Cl_,相对通透比为 2 .32∶1 .2 8∶1。结论 :小鼠心肌细胞具有明显的容积敏感性氯通道电流 ,且该电流具有外向整流性及时间依赖性失活特性(本文来源于《军事医学科学院院刊》期刊2003年03期）
容积敏感性氯通道论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
心肌肥厚是指心脏在长期负荷增加的情况下,心肌组织出现的增生性变化,表现为心肌细胞肥大,心肌纤维细胞增生,基质重构。虽然心肌肥厚在应激初期具有血流动力学方面的代偿意义,但持续性心肌肥厚可使心肌细胞损伤、纤维化,心脏收缩和舒张功能出现障碍,最终可导致心力衰竭甚至猝死。因此,深入研究心肌肥厚的发生发展机制,具有重要的临床意义。大量研究表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)对心肌肥厚形成和发展起重要作用。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAAS的主要效应物质,它可以通过多种途径诱导心肌肥厚,活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)是其中的关键信号通路之一。容积敏感外向整流性氯通道(volume-sensitive outwardly rectifying chloride channel,VSOR Cl-)也称容积敏感性氯通道,在哺乳动物各组织细胞中广泛表达,参与了细胞增殖、迁移、分化、凋亡等多种生理病理过程,但顾名思义,其最主要的生理功能是调节细胞容积。当细胞容积增大时,VSOR Cl-通道开放,使水伴随着氯离子及其他渗透性物质排出细胞,维持细胞容积,此称之为调节性容积减少(regulatory volume decrease,RVD)。而心肌肥厚的最主要生理学基础是心肌肥大,即心肌细胞容积不可逆性增大,那么,在Ang II诱导心肌细胞肥大的过程中,是否有VSOR Cl-通道的参与?它发挥了何种作用?是通过什么机制?基于此科学假设,本研究在Ang II诱导心肌细胞肥大的模型上,观察VSOR Cl-通道的变化,并通过氯通道阻滞剂4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸(4,4-diisothiocya nostilbene-2,2’disulfonic acid,DIDS)及沉默VSOR Cl-通道的通道蛋白LRRC8A来阻断VSORCl-通道,检测其对Ang II诱导心肌细胞肥大的影响,并探讨其可能的机制。研究目的:1.构建Ang II诱导心肌细胞肥大模型。2.观察Ang II对VSOR Cl-电流及VSOR Cl-通道蛋白LRRC8A的表达的影响。3.探讨阻断VSOR Cl-通道对Ang II诱导心肌肥大的作用及可能的机制。研究方法:1.实验分组:分正常对照组、Ang II组、Ang II+si RNA组、Ang II+DIDS组、si RNA组、DIDS组,分别检测细胞面积、肥厚基因m RNA表达、ROS水平和NADPH氧化酶活性。2.H9C2心肌细胞培养及Ang II刺激构建心肌肥大模型。3.鬼笔环肽免疫荧光染色H9C2细胞显示细胞骨架检测细胞面积。4.实时定量PCR检测H9C2心肌肥大标志物ANP和β-MHC以及LRRC8A的m RNA的表达情况。5.Western-blot技术检测H9C2细胞中LRRC8A的蛋白表达水平。6.全细胞膜片钳技术检测H9C2心肌细胞VSOR Cl-电流变化。7.含有si RNA的腺病毒转染H9C2心肌细胞。8.荧光探针DCFH-DA染色检测H9C2心肌细胞内ROS水平。9.活性试剂盒检测NADPH氧化酶活性。研究结果:1.Ang II诱导H9C2心肌细胞肥大模型的构建:按Ang II经典刺激浓度10-6mol/L分别处理H9C2心肌细胞0h、12h、24h、36h、48h、72h。心肌细胞面积及肥大基因ANP、β-MHC的m RNA水平呈时间依赖性升高,其中心肌细胞面积在48h达到最大(P<0.05,n=100),肥大基因ANP、β-MHC的m RNA水平在36h达到最大(P<0.05,n=6),确定了检测上述各指标的最佳作用时间。2.Ang II对H9C2心肌细胞LRRC8A的影响:Ang II处理H9C2心肌细胞,能使LRRC8A的m RNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性升高。10-6mol/L Ang II分别作用36h和48h时,LRRC8A的m RNA和蛋白表达水平达到最大(P<0.05,n=6;n=3)。3.腺病毒RNAi干扰实验:含有si RNA的腺病毒转染H9C2心肌细胞72小时后,可有效下调LRRC8A的m RNA及蛋白表达水平,从4个候选序列中,筛选出沉默效果最好的片段供实验使用。4.Ang II对H9C2心肌细胞VSOR Cl-电流的影响:在等渗条件下,Ang II 20μmol/L作用10分钟能激活VSOR Cl-电流,而si RNA沉默LRRC8A可以显着抑制Ang II激活VSOR Cl-电流,峰电流下降81.60±5.88(P<0.05,n=4)。5.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对Ang II诱导H9C2细胞肥大的影响:免疫荧光染色检测细胞面积结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌细胞面积明显增加(P<0.05,n=100),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=100);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组细胞面积明显减小(P<0.05,n=100);实时定量PCR结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌ANP和β-MHC m RNA表达量明显增加(P<0.05,n=6),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=6);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组心肌ANP和β-MHC m RNA表达量明显减小(P<0.05,n=6)。6.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对Ang II诱导细胞ROS生成影响:荧光探针DCFH-DA检测结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌内ROS含量明显增加(P<0.05,n=5),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=5);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组心肌内ROS含量明显减小(P<0.05,n=5)。其中Ang II+si RNA组比Ang II+DIDS组ROS含量减少的更为显着(P<0.05,n=5)。7.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对H9C2心肌细胞中NADPH氧化酶活性的影响,结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌细胞NADPH氧化酶活性明显增加(P<0.05,n=5),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=5);与Ang II组相比,Ang II+si RNA组心肌细胞氧化酶活性明显减小,而Ang II+DIDS组无差异(P<0.05,n=5)。研究结论:1.Ang II可显着地增加心肌细胞面积及肥大基因ANP、β-MHC的m RNA表达,成功构建了Ang II诱导心肌细胞肥大模型。2.Ang II处理H9C2心肌细胞可显着增加LRRC8A蛋白和m RNA表达量,并呈浓度和时间依赖性的正相关,同时Ang II也可激活VSORCl-电流,该电流可被沉默LRRC8A所阻断。3.应运DIDS及沉默LRRC8A阻断VSOR Cl-通道可以抑制Ang II诱导的心肌肥大。4.沉默LRRC8A可有效抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS的生成,此可能为其抑制Ang II诱导细胞肥大的机制。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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