翟宏军[1]2004年在《高强度聚焦超声治疗中晚期原发性肝癌的效果及对免疫状态的影响》文中研究说明第一部分 高强度聚焦超声治疗中晚期原发性肝癌的疗效观察 目的:观察高强度聚焦超声(HIFU)对中晚期原发性肝癌(PLC)的治疗效果。方法:追踪随访自2002年5月至2003年12月底川医海扶治疗中心治疗的81例原发性肝癌患者的预后情况。结果:术后疼痛症状缓解率为60.9%,纳差症状缓解率为43.9%;术后3月生存率69.1%,6月生存率33.3%,9月生存率16.7%,1年生存率10.8%;术后生存期较其自然病程延长;术后常见死亡原因为肝功能衰竭、上消化道大出血、恶病质、癌块破裂大出血,其中以肝功能衰竭、上消化道大出血为主;患者术后生存期与肝癌分期、肝硬化基础病变及治疗后AFP下降程度密切相关。结论:高强度聚焦超声治疗中晚期肝癌可一定程度上减轻患者症状、改善患者生存质量、延长患者生存时间,是一种很有发展前景的无创外科治疗肝癌的方法。
周炼钢[2]2014年在《TACE联合HIFU消融治疗肝癌对免疫功能影响的临床研究》文中研究表明目的：研究TACE联合HIFU消融治疗肝癌疗效和对患者机体免疫功能的影响,为TACE联合HIFU治疗肝癌提供一定的理论依据。探讨TACE联合FIFU治疗肝癌对免疫功能的影响及其临床意义,为临床上TACE联合HIFU治疗肝癌的应用价值提供科学依据。方法：收集本院肝癌患者46例,分成单纯TACE组(对照组)及TACE联合HIFU治疗组(实验组),每组患者各23例。观察两组患者疗效及术前及术后1、3、6、12个月免疫指标(CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、CD4+T细胞/CD8+T细胞比值)及其临床症状的变化情况。结果：对照组术后1月与术前比较CD3+、CD4+、及NK比例及CD4+/CD8+比值升高,CD8+T比例降低；术后3月时与术前比较CD3+、CD4+、及NK比例及CD4+/CD8+比值稍升高,CD8+T比例稍降低；术后6月术前比较CD3+、CD4+、及NK比例及CD4+/CD8+比值略有升高,CD8+比例略有降低；术后12月与术前比较CD3+、CD4+、及NK比例及CD4+/CD8+比值略有降低,CD8+比例略有升高。实验组术后1月与术前对比CD3+、CD4、及NK比例及CD4+／CD8+比值明显升高,CD8+比例明显降低；术后3月与术前比较CD3+、CD4、及NK比例及CD4+/CD8+比值明显升高,CD8+比例明显降低；术后6月与术前比较CD3+、CD4+、及NK比例及CD4+/CD8+比值稍升高,CD8+比例稍降低；术后12月与术前比较CD3+、CD4+、及NK比例及CD4+/CD8+比值略有升高,CD8+比例略有降低。两组数据比较,实验组术后1月、3月与对照组比较增高,有统计意义,术后6月、12月时稍高于对照组,差异没有统计学意义。术后患者临床症状变化如下：全身乏力明显改善的联合治疗组占87.5%(14/16),而对照组46.7%(7/15)；消瘦明显改善的治疗组占75%(9／12),而对照组46.15%(6/13)；纳差明显改善的占84.61%(13/15),而对照组41.67%(5/12)；肝区疼痛明显缓解的治疗组占75%(11/13),而对照组42.85%(6/14)。实验组与对照组术后3个月、6个月、12个月的生存率分别为100.00%、91.31%、78.26%与100.00%、69.60%、56.52%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、单纯TACE治疗后患者免疫功能的改变为治疗后1个月明显增强,3、6、12个月后免疫功能较治疗前改变不明显。2、TACE联合HIFU消融治疗后对比单纯TACE治疗后1、3个月患者免疫功能明显增强,治疗后6、12个月免疫功能与单纯TACE治疗组相同。3、TACE联合HIFU消融治疗肝癌患者改善患者临床症状及提高生存率效果优于单纯TACE治疗。
李强[3]2008年在《高强度聚焦超声致大鼠急性肝损伤后机体炎症反应及乌司他丁的保护效应》文中研究指明背景和目的探讨高强度聚焦超声(High Intensive Focused Ultrasound,HIFU)作用于正常大鼠肝脏所致的大鼠急性肝损伤后,大鼠血清中炎性因子水平的变化及蛋白酶抑制剂乌司他丁(Ulinastatin,UTI)对其的影响。材料和方法Wistar大鼠24只随机分为对照组(C组)、单纯高强度聚焦超声致伤组(H组)和乌司他丁处理组(U组),每组8只。前两组置于JC型HIFU治疗仪的超声治疗探头上方,治疗介质为脱气自来水。聚焦部位为剑突下1cm肝叶,焦距10mm,治疗频率0.8MHz,直线扫描方式,B超实时监控,焦点直径为0.5cm,治疗功率为280w/cm~2,治疗时间为8s。同一部位重复辐照3次,造成HIFU致肝组织损伤(病理切片证实),从而建立高强度聚焦超声致大鼠急性肝损伤模型。在致伤后1、3、6、12和24h采用双抗体夹心酶联免疫吸附法分别检测叁组血清中IL-2、IL-10和TNF-α三种炎性细胞因子的含量。结果与对照组比较,HIFU组血清IL-2和TNF-α在致伤3h即明显升高(P＜0.01),并分别于6、12h达到高峰,并持续在高水平至24h才开始下降。U组在致伤后3h始亦高于C组(P＜0.01),但与H组比较其升高幅度明显降低(P＜0.01)。H组血清IL-10在致伤1h较空白对照组降低(P＜0.01),之后逐渐升高,至12h升至最高,但仍低于C组水平。U组在致伤后各时相点IL-10均明显高于C组(P＜0.01)并较H组亦明显升高(P＜0.01)。结论高强度聚焦超声致大鼠急性肝损伤后大鼠机体发生显着炎症反应,乌司他丁可在一定程度上抑制致炎因子的释放,并可上调抑炎因子水平,有助于减轻各种蛋白酶与炎症介质对主要器官功能的损害,显示出一定的保护效应。
贾建伟[4]2013年在《参桃软肝胶囊抗肝癌作用及其机理初探》文中认为目的本试验目的在于从体内试验、体外实验实验入手,研究参桃软肝胶囊治疗肝癌的机理。方法1.体外实验：制备低、中、高剂量含药血清,取处于对数增长期的肿瘤细胞,实验分为6组,即正常对照组,正常血清组,低剂量含药血清组,中剂量含药血清组,高剂量含药血清组和阳性对照组。采用MTT法检测含药血清对于HepG2人肝癌细胞增殖情况的影响；采用流式细胞术检测含药血清对HepG2人肝癌细胞的早期凋亡情况的影响；采用RT-PCR检测含药血清对HepG2人肝癌细胞内bax和bcl-2mRNA水平的影响；采用wb检测含药血清对细胞内bax、bcl-2和活化的caspase-3蛋白水平的影响。2.体内试验：建立H22荷瘤小鼠模型,将荷瘤小鼠随机分为五组,分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组,每组8只。阴性对照组(生理盐水),低剂量组(参桃软肝胶囊混悬液0.35g/kg),中剂量组(参桃软肝胶囊混悬液0.7g/kg),高剂量组(参桃软肝胶囊混悬液1.4g/kg),阳性对照组(顺铂注射液2.0mg/kg),每天2次,共3周,停药后24小时取材。观察药物对荷瘤小鼠的抑瘤作用以及促进肿瘤组织内肿瘤细胞凋亡作用；检测荷瘤小鼠血浆及肿瘤组织内TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、检测荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对H22细胞的杀伤活性、检测荷瘤小鼠外周血及脾脏淋巴细胞CD4+和CD8+细胞比例,以药物对荷瘤小鼠的免疫功能影响；针对肿瘤组织,采用免疫组化法检测CD34和VEGF水平、采用RT-PCR法检测bcl-2和bax mRNA水平、采用免疫组化检测活化的caspase-3水平、采用western blot方法检测bcl-2,bax和活化的caspase-3的蛋白水平,以探讨参桃软肝胶囊的抗肝癌机制。结果1.体外实验1.1参桃软肝胶囊含药血清作用于HepG,人肝癌细胞后,与用药前相比,形态发生改变,细胞数量减少。1.2含药血清对HepG2人肝癌细胞增殖的影响,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2的增殖没有明显的影响(P>0.05),低、中和高剂量含药血清和顺铂都能够明显抑制肝癌细胞的增殖(P<0.05)。其中,低、中和高剂量含药血清处理组随着血清中中药有效成分浓度的增加,抑制细胞增殖的能力逐渐加强,呈现一定的剂量依赖关系。1.3流式细胞术结果显示,普通培养的人肝癌细胞HepG2自然凋亡率比较低,约为5%-10%左右,正常的大鼠血清对HepG2细胞的凋亡没有明显的影响,低、中和高剂量含药血清和顺铂都能够明显诱导HepG2细胞的凋亡。1.4RT-PCR结果显示,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2胞内Bax和Bcl-2mRNA水平没有明显的影响(P>0.05),低中高剂量的含药血清和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax基因的转录(P<0.01),抑制Bcl-2基因的转录(P<0.01),明显上调Bax/Bcl-2基因的比值。其中低中高剂量含药血清组Bax mRNA水平的上调,Bcl-2mRNA水平的下调,同药物浓度呈现一定的剂量依赖关系。1.5western blot结果显示,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2胞内Bax、Bcl-2和活化的caspase-3蛋白水平没有明显的影响(P>0.05),低、中、高剂量的含药血清和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,明显上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,活化caspase-3。其中,低、中、高剂量组中,随着药物浓度的增加,这种作用不断增强。2.体内实验2.1模型组肿瘤最大,重量最重；阳性对照组肿瘤最小,肿瘤最轻；低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组介于它们之间,随着药物浓度的增加,抑瘤效果不断增强,同模型组相比,各组瘤重明显的降低,具有显着差异(P<0.01)。2.2模型组小鼠肿瘤组织本身就存在一定的自然凋亡率,在2%-5%左右,低、中、高剂量给药处理和腹腔注射阳性化疗药物,都能够明显的在体内诱导肿瘤细胞的凋亡,细胞的凋亡率明显增加,其中以阳性对照组最为明显(50%-70%),其次为中药高剂量组(40%-60%),接着是中药中剂量组(30%-50%),最次是中药低剂量组(20%-30%)。2.3荷瘤小鼠血浆中细胞因子的含量明显的低于正常对照组(P<0.01),给予中药处理,随着药物浓度的增加,能够明显的增加血浆内细胞因子的含量,同模型组比,具有明显的差异(P<0.01)；阳性化疗药物处理的小鼠,血浆内这些细胞因子的含量并没有得到改善(P>0.05)。小鼠肿瘤组织内这些细胞因子的含量也有类似于血浆的趋势,中药组均能明显提高局部肿瘤组织内细胞因子的含量,从而改善机体的免疫状态,而阳性化疗药物则没有此作用。2.4同正常小鼠比,荷瘤小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞中CD4+细胞比例明显降低,CD8+细胞比例明显升高,CD4+/CD8+的比值明显降低。中药低、中、高剂量组均能明显改善小鼠的细胞免疫功能(P<0.01),而阳性化疗药物则没有改善作用(P>0.05)。2.5同正常小鼠相比,荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对H22细胞的杀伤活性明显减弱,中药低、中、高剂量组能够明显增强荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性(P<0.01),而且杀伤活性均高于正常非荷瘤小鼠。阳性化疗药物对荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性没有改善作用(P>0.05)。2.6同模型组,阳性对照组、中药低、中、高剂量组MVD计数明显减少,具有明显的统计学意义(P<0.01)；各组之间VEGF表达水平无明显差异。2.7中药低、中、高剂量组的中药和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax基因的转录(P<0.01),抑制Bcl-2基因的转录(P<0.01),明显上调Bax/Bcl-2基因的比值。其中低中高剂量组Bax mRNA水平的上调,Bcl-2mRNA水平的下调,同药物浓度呈现一定的剂量依赖关系。2.8模型组中,活化的caspase-3日性细胞比例最低,阳性对照组最高,低中高剂量中药处理组介于2者之间,呈现一定的剂量依赖关系。2.9低中高剂量的中药和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,明显上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,其中低中高剂量组中,随着药物浓度的增加,这种作用不断增强。小鼠肿瘤组织内活化的caspase-3蛋白水平表达趋势也与上面免疫组化的结果类似,与模型组相比,低中高剂量组和阳性组小鼠肿瘤组织内活化的caspase-3蛋白水平明显增加,其中低中高剂量组中,活化的casapse-3蛋白水平的增加同剂量呈现一定的依赖关系。结论1.参桃软肝胶囊含药血清可能抑制HepG2人肝癌细胞生长,并诱导其凋亡。2.参桃软肝胶囊可能抑制H22肝癌小鼠肿瘤细胞生长,并诱导凋亡的作用。3.参桃软肝胶囊可能具有改善机体的免疫功能状态的作用。4.参桃软肝胶囊可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。5.参桃软肝胶囊可能通过调节Bax/Bcl-2比值,活化casapse-3蛋白来实现抗肿瘤的作用。
李海青[5]2011年在《改良法兔VX2肝移植瘤模型建立及综合治疗的实验研究》文中认为肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率居第叁位。早期肝癌最有效的治疗方法是手术切除。但由于其发病隐匿、就诊较晚及合并肝硬化致肝功能差等原因,手术切除率仅20%-30%。对不能手术切除的中晚期肝癌患者采用微创治疗,仍可取得较好疗效。随着现代物理学技术向医学领域的延伸以及现代影像技术、微电子学、计算机信息处理等在医学领域的应用,微创治疗已成为中晚期肝癌治疗中不可缺少的重要组成部分。肝癌常用的微创治疗可以分成两大类：一类是血管内微创治疗,包括肝动脉灌注化疗(transcatheter arterial infusion, TAI)、肝动脉栓塞(transcatheter arterial embolization,TAE)和肝动脉化疗栓塞(1ranscatheter arterial chemoembolization,TACE);另一类是非血管性微创治疗,包括经皮化学消融和经皮物理消融,前者常用的有经皮穿刺无水乙醇注射(percutaneous ethanol injection therapy, PEI)、经皮穿刺乙酸注射(percutaneous acetic acid injection therapy, PAI),后者包括经皮穿刺微波凝固(percutaneous microwave coagulation therapy,PMCT)、经皮穿刺靶向氩氦刀冷冻消融(percutaneous targeted argon-helium cryoablation, PAHCA)、经皮穿刺射频消融(percutaneous radio-frequency ablation,RFA)、经皮穿刺激光间质热疗(percutaneous laser-induced thermo therapy, LITT)及高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasound,HIFU)等。其中微波凝固、氩氦刀冷冻消融和射频消融在临床上被广泛应用。这叁种微创治疗都属于经皮物理消融技术,即采用冷或热效应来杀灭肿瘤细胞,达到“一次性损毁”的治疗效果。所谓“一次性损毁”是指使用该项技术治疗肝癌时能一次性毁灭、杀死其治疗范围内的肿瘤细胞。各种微创技术治疗肝癌各有其优缺点,临床疗效各有千秋。TACE联合PMCT治疗肝癌的效果目前国内外尚无相关实验对比研究的报道。兔VX2肝癌模型是少数建立在大动物身上的肝癌模型,比较适合于肝癌的微创治疗实验研究。其瘤源VX2肿瘤细胞株起源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞癌,经过72次移植传代后正式建立株,命名为VX2,是目前最为理想的肝癌实验模型之一,被广泛应用于肝癌肿瘤学、肿瘤治疗学、放射生物学、抗癌药物药代动力学及肿瘤影像学等实验研究。本实验研究的目的在于采用数字减影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)设备导引下使用Angiotech SKATER穿刺针经皮穿刺接种瘤组织块于肝脏制作兔VX2肝移植瘤模型,并使用经动脉化疗栓塞、微波凝固和经动脉化疗栓塞+微波凝固叁种微创治疗技术进行分组治疗,通过对比各组CT测量肿瘤体积、外周血CD3+、CD4+细胞分布、肿瘤组织坏死率比较各自的治疗效果,为临床上正确地选择肝癌综合治疗技术提供理论依据和实验依据。本研究内容分为两个部分。第一部分改良法兔VX2肝移植瘤模型的建立目的：探讨DSA设备导引下经皮穿刺瘤组织块接种法制作兔VX2肝移植瘤模型的可行性方法：新西兰大白兔50只,DSA设备导引下采用Angiotech SKATER穿刺针经皮穿刺接种瘤组织块于肝脏,14天后行CT平扫评价肿瘤接种成功率,测量肿瘤体积并随机处死10只实验兔进行病理分析。结果：DSA设备导引下经皮穿刺瘤组织块接种法制作兔VX2肝移植瘤模型成功率为100%。结论：1采用Angiotech SKATER穿刺针经皮穿刺瘤组织块接种法建立兔VX2肝移植瘤模型具有方法简单、成功率高、动物损伤小等特点,能为肝癌临床治疗研究提供成熟的大型实验动物模型。2兔VX2肝移植瘤为富血管性肿瘤,其供血动脉主要为肝动脉,类似于人类原发性肝癌。病理学上肿瘤为巨块型实体瘤、侵润性生长,血供丰富,类似于巨块型肝癌。3应用DSA作为穿刺导向设备,尤其是应用C臂CT的特殊功能,可使穿刺定位更加准确,造模成功率高,表明该方法安全可靠第二部分经导管肝动脉化疗栓塞、经皮微波凝固、经导管肝动脉化疗栓塞+经皮微波凝固对兔VX2肝移植瘤治疗效果对比研究目的：对比TACE、PMCT、TACE+PMCT叁种方法治疗兔VX2肝移植瘤的效果。方法：取制作成功的肝移植瘤模型30只,随机分为TACE组(A组)、PMCT组(B组)和TACE+PMCT组(C组),每组10只,治疗后第14天对比各组CT测量肿瘤体积、外周血CD3'.CD4.细胞分布、肿瘤组织坏死率。结果：治疗后14天,C组的肿瘤体积为(0.624±0.031)cm3,明显小于A组(0.799±0.057)cm.和B组(0.858±0.112)cm3,(P<0.05)；C组外周血CD3+细胞百分数为(66.30±1.36)%,明显高于A组(53.34±2.12)%和B组(60.68±1.06)%,(P<0.05)；C组外周血CD4+细胞百分数为(48.19±1.43)%,也明显高于A组(40.21±1.07)%和B组(44.03±0.08)%, (P<0.05)；C组肿瘤组织坏死率明显高于A组和B组, (P<0.05)。结论：1 TACE.PMCT均可使兔VX2肿瘤产生治疗效果,但单独使用两种治疗后肿瘤仍有残余生存。TACE+PMCT综合治疗是一种安全有效地治疗方法,且优于单一方法的治疗效果,为临床肝癌的综合治疗提供了依据。2本实验结果进一步证实了PMCT或TACE+PMCT治疗有增强机体免疫功能的作用,且后者对免疫功能的增强作用优于前者。
全毅[6]2010年在《TACE联合肿瘤间质注射碘油化疗药物治疗肝癌的临床研究》文中研究说明研究背景原发性肝癌(HCC)的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因变异的复杂过程,与机体的免疫状况密切相关,尤其是与T细胞的细胞免疫有关,但受多种因素的调节,肿瘤患者的机体免疫功能不同程度地发生紊乱。多数学者认为在机体的抗肿瘤免疫中细胞免疫占主导地位,研究表明,T淋巴细胞和NK细胞的比例及功能变化与肿瘤的发展、扩散有明显的相关性。有研究表明HCC患者外周血中CD3,CD4降低,CD8增高,免疫功能低下,恶变细胞所产生的免疫抑制是肿瘤患者免疫功能低下的主要原因。肿瘤免疫主要与T淋巴细胞的细胞免疫有关,T淋巴细胞亚群是反映机体细胞免疫功能的一个指标。T淋巴细胞是由不同亚群组成的,外周血T细胞亚群在数量上的协调比例,特别是CD4/CD8的比值是反映细胞免疫平衡与否的敏感指标,有助于反映机体免疫反应的调节能力。其中CD4+T淋巴细胞一般认为处于细胞免疫的核心,以其主要分泌细胞因子调节肿瘤免疫被称之为辅助性T淋巴细胞(Th),Th是人类主要组织相溶性抗原(MHC)Ⅱ类分子限制性T细胞,由于大多数肿瘤细胞不表达MHCⅡ类分子,故此类分子不能直接识别肿瘤细胞,而是依赖抗原提呈细胞如B细胞、巨噬细胞提呈相关抗原,对之进行特异性激发后,才分泌淋巴因子(如IL-2、r-干扰素等),激活B细胞、巨噬细胞、NK细胞,并通过其活化的细胞发挥抗肿瘤作用。Ts细胞(suppressor T cell)即抑制性T细胞在宿主免疫机制中起着复杂的抑制调控作用。当发生肿瘤后,Ts在功能和数量上都显着增强,抑制机体对肿瘤的免疫效应,从而使肿瘤逃逸机体的免疫监视,促进了肿瘤的生长。大量体外实验证实,Th和Ts细胞在正常情况下保持着恒定的比值,某一亚群变化可直接影响到群体功能,两者相互制约构成机体重要的免疫调节机制。肝癌的发生发展也同时与细胞凋亡存在着密切的关系,体外培养的肝癌细胞和体内发生的肝癌细胞均存在着细胞凋亡现象。未经治疗的肝癌会发生自发性癌细胞凋亡,恶性程度越高凋亡指数越大。肝癌时肿瘤细胞的增殖指数与凋亡指数呈正相关,从正常肝脏、癌前病变到肝癌,凋亡率随增殖率增高而增高,但其增高的幅度明显小于细胞增殖增高的幅度。肝癌组织中肿瘤细胞凋亡明显高于正常肝组织及癌周肝组织。细胞凋亡在肿瘤的发生发展中可能具有双面作用：细胞凋亡可能抑制癌细胞生长；也可能通过凋亡筛除那些生命力低下或表型类似正常细胞的肿瘤细胞,而选择侵袭力强增殖旺盛的细胞克隆,促进肿瘤发生发展。所以研究细胞凋亡的机制及凋亡在疾病过程中的作用,不但可以了解肿瘤发生发展的机理,更重要的是从一个全新的角度认识肿瘤细胞的生物学特性,为肿瘤治疗开辟新的途径提供了重要的理论依据。选择经肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolizaton, TACE)是不能切除肝癌公认的首选治疗方法,经肝动脉化疗栓塞治疗肝癌后,肿瘤细胞被杀死,肿瘤组织出现凝固性坏死,肿瘤细胞负荷减少,使肿瘤释放的TNF减少,免疫抑制因子的产生亦大大减少,减弱了对机体的免疫功能的影响,机体免疫细胞指标有所改善。经手术和栓塞治疗后肝癌患者的免疫功能受抑减轻。但肝动脉化疗栓塞治疗常包括栓塞和化疗两部分,化疗则抑制机体的免疫功能,所以对机体免疫功能的影响颇为复杂。另一方面,一般认为TACE作用机制是局部化疗和血管栓塞引起了肿瘤组织细胞坏死,但近年来发现栓塞引起的缺血缺氧是肿瘤细胞凋亡强有力的基因诱导动因,缺血数分钟就有即刻早期基因表达,缺氧也可以诱导凋亡基因表达增高,缺血至少可诱导80种以上的基因表达,包括促进细胞凋亡基因表达增高,抑制凋亡基因表达下降,使未凝固坏死的肝癌肿瘤细胞发生凋亡。因此,凋亡在TACE治疗肝癌所引起的肿瘤组织死亡中具有重要的作用,并且有可能是TACE治疗肝癌的其中一重要机制。但由于肝癌易转移和复发特性,任何单一治疗手段均不满意。选择经肝动脉化疗栓塞术后,但仍有大量病例常存在瘤灶栓塞不充分,TACE时经血管内注入的栓塞剂-碘油化疗药物混合乳剂少,致使瘤灶内碘油化疗药物沉积不充分,无碘油沉积部分病灶则在短期内快速增生,是此类肝癌患者治疗失败和局部复发进展的主要原因。近年,有研究直接将细胞毒药物或生物制剂直接植入肿瘤组织或其周围的间质组织内,对肿瘤细胞进行直接攻击的方法,即经皮穿刺瘤内抗癌药物注射间质治疗(interstitial therapy, IT)。在肿瘤局部缓慢释放,持续保持较高的浓度,杀灭肿瘤细胞,即为缓释化疗(slow-release chemotherapy)。碘油是一种碘含量37%-39%的脂肪酸乙脂亚麻子油,不透X线,具有X线透视下适时监测其弥散范围的优点,同时能选择性地较长时间滞留在肝肿瘤组织中,不像大多数生物载体那样在体内易被降解或失去活性,也不会因癌细胞突变而失去特异性,可以作为较好的载体进行瘤内药物注射。碘油作为粘稠的油性液体,可以完全包围癌细胞阻碍癌细胞与组织液进行物质交换及氧的获取,使细胞水肿和脂肪变性,重度持续缺氧引发细胞凋亡和死亡。目前仅有少量文献报道经皮肝穿刺瘤内注入碘油化疗药物乳剂进行肿瘤间质治疗肝癌的临床研究,其中对肝癌患者免疫功能的影响、诱导肿瘤细胞凋亡的基础研究甚少。我们采用TACE联合经皮肝穿刺瘤内注射碘油化疗药物,进行肿瘤间质治疗,一方面探讨该序贯治疗模式的临床疗效及其病理变化,一方面通过流式细胞仪(FCM)检测外周血T淋巴细胞亚群免疫功能的变化,所诱导的肿瘤细胞凋亡变化,初探其对免疫功能的影响、诱导肿瘤细胞凋亡在该治疗模式中的作用,并预期是其重要的治疗机制之一。我们将该治疗模式的临床研究和基础研究结合在一起,这是本研究的特色创新之处,尚未见类似报道。目的研究单纯经肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolizaton,TACE)联合经皮肝瘤内碘油化疗药物注射肿瘤间质治疗(interstitial therapy, IT)肝癌的临床疗效,病理变化,介入术前后肝癌患者外周血T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白的变化及意义。探讨联合肿瘤间质治疗后诱导肝癌肿瘤细胞凋亡的变化及其在肿瘤治疗中的作用机制和意义。材料与方法将60例肝癌患者分成两组,对照组(A组)30例行单纯TACE治疗,实验组(B组)30例行TACE联合经皮肝瘤内药物注射碘油化疗药物肿瘤间质治疗。观察患者术后发热等不良反应,术前及术后1周抽取2组患者外周血,常规检测血常规、肝肾功能,观察其变化,术后两月复查和随访,观察2组患者术后一月瘤灶内碘油沉积情况以及术后半年肿瘤局控率,1、2年生存率以及中位生存期。应用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群(CD3+T、CD4+T、CDS+T、CD4+T/CD8+T),检测免疫球蛋白和补体C3、C4水平变化,观察免疫功能的改变。术后一月肿瘤穿刺活检取材,病理染色观察病理改变：采用流式细胞仪Annexin-V/PI双染法检测,观察肿瘤细胞凋亡率、死亡率。结果A组患者术后体温正常者7例,低度发热者3例、中度发热7例、高度发热13例,B组体温正常16例、低度发热8例、中度发热4例、高度发热2例,χ2检验两组比较有显着性统计学差异,P<0.01。配对t检验显示B组白细胞、血红蛋白术前术后差值明显低于A组,两组比较有显着性统计学差异,P<0.01,B组血小板术前术后差值低于A组,有统计学差异,P<0.05。术后A组白细胞明显高于B组,两组比较有显着性统计学差异,P<0.01；术后A组血小板、血红蛋白要低于术后B组,但两组比较无统计学意义,P>0.05。配对t检验显示B组谷丙转氨酶、谷草转氨酶术前术后差值明显低于A组,两组比较有显着性统计学差异,P<0.01,B组总胆红素指数术前术后差值低于A组,有统计学差异,P<0.05,B组血白蛋白术前术后差值低于A组,但两组间比较无统计学差异,P>0.05。术后A组谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素指数均明显高于B组、血白蛋白明显低于B组,两组比较有显着统计学差异,P<0.05。配对t检验显示B组血尿素氮术前术后差值低于A组,两组比较有统计学差异,P<0.05；B组血肌苷术前术后差值低于A组,但无统计学意义,P>0.05。术后尿素氮、肌苷A组均高于B组,但两组比较无统计学意义,P>0.05。A组手术后碘油沉积率于<50%、50-75%、>75%范围者各为8、12、10例；B组分别为0、12、8例,A、B两组手术后碘油沉积率比较有显着性统计学差异,P<0.05；A组手术后甲胎球蛋白降低率于<50%、>50%范围者各为13、17例,B组分别为5、25例,A、B两组甲胎球蛋白比较有统计学差异,P<0.05(见表5)。A组手术后肿瘤缩小率于<25%、25%-50%、50-75%、>75%者各为23、6、1、0例；B组分别为17、12、1、0,但A、B两组比较无统计学意义,P>0.05。A组手术后6个月复查稳定无复发进展的为12例,复发进展的为18例；B组分别为20、10例,A、B两组手术后6月局控率相比较有统计学差异,P<0.05。A组1,2年生存率80%,43%,中位生存期20.5月。B组1、2年生存率90%,60%,中位生存期22月。外周血T淋巴细胞亚群的结果显示A组单纯经肝动脉化疗栓塞肝癌患者,手术后一周CD3、CD4及CD4/CD8升高,CD8降低,手术前后CD4及CD4/CD8差异有显着性(P<0.05),CD3、及CD8则无统计学差异；B组联合肿瘤间质治疗后,其外周血T淋巴细胞较A组变化更为明显,手术前后CD3、CD4及CD4/CD8升高,CD8降低,手术前后具有非常显着性统计学差异(P<0.01),且A、B两组术后比较,除CD3外统计学亦有显着性差异(P<0.05)。免疫球蛋白和补体检测结果,A组术后免疫球蛋白和补体有所升高,以IgG、IgA、C4升高明显,手术前后有显着性统计学差异,(P<0.05),但IgM、C3手术前后无显着性统计学差异(P>0.05)；B组手术前后仅IgG有所升高,具有显着性统计学差异(P<0.01),IgA、IgM、C3、C4无显着性统计学差异(P>0.05),B组IgG、IgM手术前后差值较A组升高,有显着性统计学差异(P<0.05), IgA、C3、C4无显着性统计学差异(P>0.05)。A组瘤灶病理以大量肿瘤细胞凝固性坏死改变为主,B组则可见大量肿瘤细胞脂肪样变性坏死。A、B两组患者正常肝脏组织流式细胞仪Annexin V/PI双染法凋亡率相比较无统计学意义；两组正常肝脏组织的坏死率比较也无统计学意义；B组患者肿瘤组织凋亡率显着高于A组,两组相比较有统计学差异,P<0.05；A组肿瘤边缘组织死亡率显着高于B组,两组死亡率比较有显着性统计学差异,P<0.01。结论TACE联合肿瘤间质注射碘油化疗药物治疗肝癌,可以显着提高瘤灶碘油沉积率,提高肿瘤局控率,降低TACE术后残留瘤灶复发率,延长患者生存期,减轻介入术后不良反应。单纯TACE治疗肝癌增强患者细胞免疫功能,对体液免疫影响较小。联合瘤内碘油化疗药物乳剂注射肿瘤间质治疗的方法可以更大程度改善患者细胞免疫和体液免疫功能。经动脉化疗栓塞诱导大量癌细胞进入凋亡,是TACE联合瘤内药物注射碘油化疗药物肿瘤间质治疗肝癌的重要机制,该治疗模式可以促进肝癌细胞凋亡,对于进一步提高肝癌的疗效具有积极的意义,而其所引致的急性凝固性坏死改变、大量急性肿瘤溶解坏死等不良反应较少,因此是一种相对安全、稳妥、有效、和具有前景的肝癌治疗模式。
赵洪[7]2003年在《肿瘤超声热疗的实验研究和临床应用》文中研究表明据WHO预测，恶性肿瘤将成为21世纪危害人类健康的头号杀手。但就目前情况而言，对于一些肿瘤特别是中晚期肿瘤，任何一种常规治疗（手术切除、化学疗法或放射疗法）均不能单独成为一种根治肿瘤的手段。肿瘤温热治疗是通过加热肿瘤组织而促进肿瘤细胞的死亡，而平面多元阵列超声加热系统充分利用了超声波穿透力强、导向性好等特点，能加热深部的肿瘤组织，是近20年发展起来的有效的肿瘤辅助治疗手段；高强度聚焦超声(High Intensity Focused Ultrasound，HIFU)则是近几年快速发展的先进的热疗技术，它能将超声波聚焦于深部肿瘤组织，通过高热效应使肿瘤组织在短时间内（0.1秒～0.5秒）凝固坏死，而对超声波所穿过的组织和靶区周围的正常组织无损。HIFU作为一种有效的和非侵入性的肿瘤治疗方法已开始引起肿瘤热疗领域的关注。本课题在研究不同热剂量超声热疗的局部效应及机理的同时，着重探讨HIFU治疗对机体抗肿瘤免疫功能的影响，以期为HIFU技术应用于临床治疗提供理论依据。本研究发现：如平面多元阵列超声加热系统以治疗热剂量（42.5℃×30分钟，连续照射5次）治疗荷人肝癌（LC）裸鼠，局部肿瘤体积在19天后明显缩小，抑瘤率达91%，且肿瘤细胞的凋亡率增加，肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达下降；而低热剂量（41℃×12分钟，连续照射5次）的治疗会加速肿瘤的生长，19天后肿瘤体积明显大于对照组。本研究发现：HIFU治疗双前肢腋下荷H22肝癌昆明鼠后，受辐照区域病理学表现为肿瘤细胞大片凝固性坏死，对侧未受辐照的同种肿瘤的生长受到抑制，脾脏淋巴细胞对H22细胞的细胞毒作用明显增加；同时也发现HIFU覆盖式辐照后局部肿瘤组织体积明显小于对照组，抑瘤率达82%，分次治疗只要累积治疗体积能覆盖整个肿瘤，也可达到类似效果，但如HIFU只治疗肿瘤组织中的一小部分，则有促进肿瘤生长的可能。本研究还发现HIFU治疗能逆转荷H22肝癌昆明鼠体内Th1向Th2细胞的漂移，经双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测，经HIFU治疗的小鼠外周血IL-2和IFN-γ浓度明显高于对照组， IL-4和IL-10浓度则明显低于对照组。通过流式细胞仪检测发现：HIFU治疗后小鼠机体内非MHC限制性的具有广谱抗癌作用的γδT细胞比例显著上升。在临床应用，中我们首先观察了乳腺癌HIFU治疗的有效性和安全性，因为HIFU辐照浅表肿瘤是相对安全的，并便于观察其疗效。研究证实HIFU用于临床乳腺癌的治疗是安全、有效的。HIFU治疗能使乳腺癌组织整块凝固，病理学检查
邹宁[8]2010年在《微波消融/氩氦刀冷冻联合TLR9激动剂治疗CT26结肠癌小鼠皮下移植瘤的实验研究》文中研究表明癌症的发病率和死亡率逐年上升,近10年来增加更为明显。目前,癌症已经成为中国城市居民的首位死因和农村居民的第二位死因,严重地危害人类的健康。目前肿瘤的治疗手段主要有手术、化疗、放疗、生物治疗等多种治疗手段。肿瘤手术切除是目前临床首选治疗方法。然而,70%以上的肿瘤病人入院确诊时常由于肿瘤负荷较大,病人的身体状况或心肺等功能不能承受大的创伤性(开胸、开腹)手术,失去了根治手术治疗的机会。因而,以直接灭活肿瘤细胞消除肿瘤负荷为目的的微创局部消融治疗手段近年来引起了广泛的关注。局部消融治疗可以为失去常规手术根治性治疗机会的实体肿瘤患者提供新的治疗选择。在很多中晚期肿瘤患者中取得了较好的疗效。随着微创消融技术的开展,对于主要瘤体消融后的残余病灶及影像学难以显示的亚临床病灶的序贯治疗受到临床的广泛关注。临床治疗研究结果显示,局部肿瘤组织消融后,对残余病灶局部药物注射(如低浓度乙酸、低浓度氢氧化钠、高渗盐水、酒精、化疗药物等),可以加强局部治疗效果。但氩氦刀冷冻治疗和微波消融后对局部细胞免疫功能的影响及如何提高治疗后局部抗肿瘤免疫治疗作用,是近年来局部消融免疫研究的重点。CpG ODN是一个人工合成的强大免疫激活剂。它在肿瘤治疗中最具特征性的免疫活性是它能激活DC,使其活化、增殖、分化,增强对初始T细胞的激活,诱导多种细胞因子特别是IL-12和IFN-γ的产生,调节免疫应答向Th1型分化。此外,CpG ODN能诱导多克隆B细胞增殖；也能刺激NK细胞,使其产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子,产生免疫调节作用；也能激活T细胞,启动特异性抗肿瘤免疫应答。这些是其发挥抗肿瘤免疫的主要机制。本课题设计采用微波消融／氩氦刀冷冻治疗BALB/c小鼠皮下移植CT26结肠癌模型,在消融后1h瘤周注射TLR9激动剂-CpG ODN,观察这种联合治疗对荷瘤小鼠的治疗作用,以及对小鼠免疫状态的影响。第一部分TLR9激动剂-CpG ODN对于小鼠淋巴细胞的活化作用及对DC成熟的影响目的：检测CpG ODN对BABL/c小鼠脾来源淋巴细胞的活化作用及CpG ODN刺激后DC表面分子表达情况方法：分离小鼠脾中的淋巴细胞,使用不同浓度的CpG ODN刺激该淋巴细胞,流式细胞术检测CD69+CD4+T细胞、CD69+CD8+T细胞和CD69+CD19+B细胞所占的比率。从小鼠骨髓中分离出DC, CpG ODN刺激后,流式细胞仪检测DC表面表达的共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ分子的比率。结果：1.不同浓度的CpG ODN均能活化小鼠脾淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞,表现为CD69+CD4+T细胞、CD69+CD8+T细胞和CD69+CD19+B细胞水平较空白对照组中相应的细胞水平显着性增高(相应地F=10.501,F=16.570,F=1564.965,P均<0.001)。2. CpG OND刺激后的DC,流式细胞术检测其表面分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达均较未加刺激剂的DC明显增高(相应地,F=59.680,P<0.001；F=47.233,P<0.001；F=18.674,P=0.003),LPS促成熟的DC与CpG OND刺激后的DC的表面分子CD80, CD86和MHCⅡ的表达无显着性差异(P均>0.05)。第二部分微波消融／氩氦刀冷冻联合TLR9激动剂-CpG OND对小鼠CT26结肠癌的治疗作用目的：观察微波消融或氩氦刀冷冻联合CpG OND对小鼠结肠癌CT26的治疗效果。方法：实验选用BALB/c小鼠及小鼠结肠癌CT26细胞造模。造模成功的小鼠随机分成瘤周注射PBS组、瘤周注射CpG ODN组、微波消融组、微波消融联合CpG ODN组、氩氦刀冷冻组和氩氦刀冷冻联合CpG ODN组六组。观察小鼠肿瘤的生长趋势、计算小鼠的中位生存期、体积抑瘤率。观察微波消融组、微波消融联合CpG ODN组、氩氦刀冷冻组和氩氦刀冷冻联合CpG ODN组四组小鼠的肿瘤局部复发率。计算治愈小鼠针对CT26再挑战时的成瘤率。结果：1.微波消融治疗、微波消融联合CpG ODN、氩氦刀冷冻及氩氦刀冷冻联合CpG ODN这四种治疗对于小鼠控制肿瘤的生长都具有显着作用,能够完全消融掉皮下移植的肿瘤。与对照组(PBS组)相比,抑瘤率分别为97.64%、97.84%、96.22%、97.75%。与对照组相比,单纯瘤周注射CpG ODN对小鼠的控制肿瘤生长没有显着性作用。2.微波消融治疗组、微波消融联合CpG ODN组、氩氦刀冷冻组及氩氦刀冷冻联合CpG ODN组这四组小鼠的中位生存时间较对照组(PBS组)显着性延长(P=0.000),CpG ODN组与PBS组小鼠的中位生存时间无显着性差异(P=0.756)。3.微波消融治疗组小鼠的局部复发率为26.7%,而微波消融组联合CpGODN组的局部复发率为6.7%。但两组的局部复发率无显着性差异(P=0.330)。氩氦刀冷冻治疗组小鼠的局部复发率为33.3%,氩氦刀冷冻联合CpG ODN组肿瘤局部复发率为6.7%,两者有显着性差异(P=0.002)4.在肿瘤再攻击实验中,微波治疗组小鼠在肿瘤完全治愈后再次给予CT26细胞攻击时成瘤率为75.0%,微波联合CpG ODN组的成瘤率为25.0%。后者的成瘤数量少于前者,但两者相比无显着性差异(P=0.132)。氩氦刀治疗组小鼠的成瘤率为75.0%(6/8),联合治疗组治愈的小鼠成瘤率为12.5%(1/8),两者相比有显着性差异(P=0.041),后者成瘤率较前者低。第叁部分微波消融／氩氦刀冷冻联合TLR9激动剂-CpG OND对荷瘤鼠免疫状态的影响目的：研究局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG OND对荷瘤鼠免疫状态的影响。方法：小鼠的处理分组与第二部分相同。小鼠行不同治疗后21天处死,利用流式细胞术检测小鼠外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞的比例。采用酶联免疫吸附试验检测小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ的含量。使用免疫组化法检测各种治疗后的小鼠肿瘤组织中CD3+T细胞、CD45R0阳性细胞的浸润情况及颗粒酶B、FasL蛋白的表达情况。结果：1.与对照组(PBS组)相比,无论是局部消融还是局部消融联合CpG ODN对荷瘤小鼠外周血中的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞的比例都没有显着性差异(相应地,F=0.768,P=0.588；P=2.447,P=0.057；P=2.040,P=0.136)。但局部氩氦刀冷冻和局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN治疗对CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞的比率有影响,治疗后小鼠外周血中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞的比率较对照组(PBS组)有显着性升高(相应地,P=0.019；P=0.007；P=0.002)。虽然微波消融组该比率与对照组的差异无显着性,但是其P=0.051。CpG ODN组与PBS组该细胞比率无显着性差异(P=0.921)。2.瘤周单次注射CpG ODN对荷瘤小鼠外周血中细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的水平无明显影响(相应地,P=0.581；P=0.445；P=0.799)。局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)及局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN后小鼠外周血中的IL-2、IL-12和IFN-γ的水平均较对照组升高(P均<0.05),而且局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN后小鼠外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ的水平较单独局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)组高。3.免疫组化结果显示：局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)后小鼠肿瘤组织中CD3+T细胞的浸润较对照组显着升高(相应地,P微波=0.028,P氩氦刀=0.007),但仍较局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN低(P均<0.05),差异有显着性。局部消融(微波消融／氩氦刀冷冻)联合CpG ODN组肿瘤组织中CD45RO+细胞较其余四组显着性增高(P均<0.05)。其余四组之间无显着性差异(P=0.099)。微波消融／氩氦刀冷冻联合CpG ODN组的小鼠肿瘤局部颗粒酶B较单纯微波消融／氩氦刀冷冻组显着升高(P均<0.05)。氩氦刀冷冻联合CpG ODN组小鼠肿瘤局部CTL上FasL的表达水平较单纯微波消融／氩氦刀冷冻组显着升高(相应地,P=0.010；P=0.010)。本文结论：1. CpG ODN可以激活多种免疫细胞,促进小鼠脾淋巴细胞发生活化。可以上调小鼠骨髓来源的DC上CD80、CD86和MHCⅡ的表达率。2.与对照组(PBS组)相比,微波消融／氩氦刀冷冻及相应联合治疗组这四组小鼠的中位生存期明显延长,但这四组小鼠的中位生存期之间无显着差异。微波消融／氩氦刀冷冻及相应联合治疗对小鼠肿瘤体积的抑瘤非常显着,但四组之间无明显差异。3.氩氦刀冷冻治疗联合CpG ODN组的肿瘤局部复发率较单纯氩氦刀冷冻组显着降低；氩氦刀冷冻治疗联合CpG ODN组的成瘤率显着低于单纯的氩氦刀冷冻治疗。微波消融联合CpG ODN有降低小鼠肿瘤局部复发率和再次成瘤率的趋势。局部消融联合CpG ODN治疗组的小鼠肿瘤局部免疫活性细胞CD3+增多,局部免疫活性增强,可能与联合治疗组的局部复发率下降有关。肿瘤特异性记忆性细胞的增多可能是联合治疗组小鼠对于同样肿瘤细胞再次攻击时抵抗力提高的原因。说明局部消融联合CpG ODN能提高小鼠的免疫功能。4.微波消融／氩氦刀冷冻组及相应联合CpG ODN治疗组这四组小鼠外周血中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞的比率较对照组(PBS组)显着增高,然而该比率在这四组之间无显着差异；四组小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ水平增高,且微波消融／氩氦刀冷冻联合CpG ODN治疗组的小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ水平较单纯微波消融／氩氦刀冷冻组更高。这些细胞因子水平的增高可能与免疫细胞活性增强有关。
参考文献：
[1]. 高强度聚焦超声治疗中晚期原发性肝癌的效果及对免疫状态的影响[D]. 翟宏军. 四川大学. 2004
[2]. TACE联合HIFU消融治疗肝癌对免疫功能影响的临床研究[D]. 周炼钢. 昆明医科大学. 2014
[3]. 高强度聚焦超声致大鼠急性肝损伤后机体炎症反应及乌司他丁的保护效应[D]. 李强. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[4]. 参桃软肝胶囊抗肝癌作用及其机理初探[D]. 贾建伟. 广州中医药大学. 2013
[5]. 改良法兔VX2肝移植瘤模型建立及综合治疗的实验研究[D]. 李海青. 山东大学. 2011
[6]. TACE联合肿瘤间质注射碘油化疗药物治疗肝癌的临床研究[D]. 全毅. 南方医科大学. 2010
[7]. 肿瘤超声热疗的实验研究和临床应用[D]. 赵洪. 复旦大学. 2003
[8]. 微波消融/氩氦刀冷冻联合TLR9激动剂治疗CT26结肠癌小鼠皮下移植瘤的实验研究[D]. 邹宁. 南方医科大学. 2010
标签：肿瘤学论文; 肝癌论文; 肿瘤论文; 肿瘤细胞论文; 对照组论文; 原发性肝癌论文; 肿瘤免疫论文; 化疗药物论文; 肝癌晚期治疗方法论文; 细胞免疫论文; 肝癌症状论文; 放化疗论文; 癌症论文; 健康论文;