张磊[1]2003年在《人组织激肽释放酶cDNA的克隆、表达及其基因治疗高血压的初步研究》文中研究说明人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein，KLK1)是激肽释放酶-激肽系统的核心成员，能裂解激肽原的特异肽键而释放激肽，并通过该系统发挥一系列的生物学功能。本研究的目的是开发人组织激肽释放酶基因工程产品，制备鉴定KLK1的试剂，并探讨用KLK1基因治疗高血压的可行性。根据国际上发表的KLK1 cDNA序列，以人胰腺cDNA第一链为模板，扩增KLK1 cDNA，所得的KLK1 cDNA与已经发表的KLK1 cDNA序列完全相同或有几个核苷酸差异。将KLK1 cDNA的信号肽切除，按正确的阅读框架克隆入pGEX-4T-3载体中谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因的下游，用IPTG诱导实现其在大肠杆菌中的表达。Western-blotting结果显示，表达的约48 kDa的融合蛋白能够被GST单抗特异性识别。以原核表达产物为抗原，分别制备了针对KLK1的多抗血清和单克隆抗体。以KLK1的重组载体注射小鼠也获得了较高效价的特异抗体。把KLK1 cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3中，通过多聚乙酸亚胺介导将真核表达重组载体转染入COS-1细胞，用所制备的抗体做间接免疫荧光反应，结果说明KLK1在真核细胞中获得了表达。通过注射此重组真核表达载体基因治疗自发性高血压大鼠(SHR)，降压幅度达30mmHg，维持2周左右。将KLK1 cDNA克隆入本室构建的乳腺特异性表达载体p205C3中，用获得的重组载体注射哺乳期小鼠中，乳汁中的KLK1活性高达292 U／ml。这些结果表明，本试验克隆的KLK1 cDNA是正确的，以原核表达产物为抗原获得的KLK1抗体为以后的研究提供了宝贵试剂。KLK1在动物细胞中的表达成功，提示了KLK1在动物体内表达的可能性。基因治疗的初步结果证明，所克隆的基因不仅能表达有活性的酶，而且重组载体具有治疗高血压的潜在价值。KLK1在小鼠乳腺中的瞬时表达证明该基因构件可用于乳腺生物反应器的研究和开发。
高波[2]2005年在《表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究》文中认为为了构建鸡输卵管特异表达载体,根据已经发表的鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区序列设计两对引物,用高保真PCR法从中国狼山鸡基因组DNA中分别扩增出长度各为3.0kb的卵清蛋白基因5′-和3′-调控区,将扩增产物克隆入pGEM-T载体,部分序列测定结果证明与国外发表的鸡卵清蛋白基因相应区域同源性为100%。将鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区插入粘粒载体pHC20,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV1。为了证明构建的载体能有效驱动目的基因在鸡输卵管上皮细胞中表达,将绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因通过Xho Ⅰ位点克隆入pOV1载体,将获得的重组载体pOV1EGFP与脂质体或多聚阳离子(PEI)包裹后,分别转染产蛋鸡输卵管上皮细胞和成纤维细胞,转染后48 h在荧光显微镜下观察报告基因的表达,结果证明pOV1载体能有效驱动EGFP报告基因在输卵管上皮细胞中表达,而在鸡成纤维细胞中不表达。为了进一步优化pOV1载体的结构,用限制性内切酶将鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区从pOV1载体中切出,然后克隆入切除CMV启动子和SV40序列的pcDNA3.0载体,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV2;将鸡卵清蛋白基因5′-调控区单独克隆入改造后的pcDNA3.0载体,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV3。将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3的5′-端调控区下游,获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经基因转染剂PEI包裹后,分别经翅静脉注射产蛋鸡,然后将载体注射鸡扑杀,取其输卵管和内脏组织,分别用RT-PCR和酶活性检测法测定报告基因的表达,结果显示LacZ基因在注射鸡的肝、脾、肾、心等组织不表达,在输卵管膨大部表达,而且表达的重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中。载体注射前注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用,在相同的注射剂量下,pOV3LacZ的表
张茹君[3]2009年在《重组杆状病毒介导的人组织激肽释放酶在昆虫细胞中的表达》文中认为昆虫杆状病毒表达系统是应用广泛的外源蛋白表达系统。该系统利用杆状病毒多角体蛋白基因的强启动子,不仅重组蛋白的产量高,而且具有真核细胞的蛋白质翻译后修饰加工机制,重组蛋白的生物活性较强。本研究用高保真PCR,从已被证明能在真核细胞中正确表达的重组载体中扩增人组织激肽释放酶cDNA,引入适当的酶切位点和组氨酸纯化标签后,与杆状病毒转移载体pFastBacl连接,用获得的重组载体pFastBac-KLK1转化含穿梭载体Bacmid的DH10Bac大肠杆菌,筛选获得了重组质粒Bacmid-KLK1;再将Bacmid-KLK1转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒;经3次传代后经间接免疫荧光检测证明,重组病毒感染的昆虫细胞中为重组人组织激肽释放酶表达阳性,经western blot检测证明表达产物的分子量为预期的35kDa,大部分存在于胞浆内。这些研究结果为人组织激肽释放酶检测试剂的研制和开发利用奠定了基础。
陈莉[4]2008年在《禽腺联病毒序列促进人组织激肽释放酶在鸡输卵管的表达、鉴定及检测方法建立》文中研究指明腺联病毒(adeno-associated virus, AAV)是很有前景的基因治疗载体。禽腺联病毒(avian adeno-associated virus, AAAV)具有与人AAV类似的潜伏感染特性和基因组结构。为了探索AAAV末端反向重复(ITR)和Rep基因序列能否促进外源基因的整合和表达,本研究将人组织激肽释放酶(hKLK1)鸡输卵管特异表达盒克隆在AAAV ITR之间,并将CMV启动子控制的Rep基因表达盒构建于同一载体,获得重组表达载体pRep2ITR-OV4-KLK1。以不含AAAV序列的鸡输卵管表达载体pOV4-KLK1为对照,通过体外释放实验确定PEI与质粒DNA的包被条件为N/P=5;用生理盐水稀释PEI-质粒DNA复合物,经翅静脉注射产蛋鸡。蛋清中重组酶的活性检测结果显示,在质粒DNA相同的条件下, pRep2ITR-OV4-KLK1表达hK1的水平及维持时间较pOV4K有所提高或延长,但不能维持持久表达。这些试验结果提示,AAAV ITR和(或)Rep序列能促进hKLK1在鸡输卵管上皮细胞中的表达,但不能介导外源基因的整合或整合效率很低。为了进一步研究rhKl的理化特性,对载体注射鸡蛋清进行Western blotting检测,结果显示rhK1能被hKl特异抗体识别,成熟酶的分子量为37 kDa;将鸡蛋清用不同pH的缓冲液稀释,然后进行酶活性检测,结果显示rhK1在pH7-10范围内均有较强活性;将鸡蛋清用含不同金属离子(终浓度为0.01M)的缓冲液稀释,然后进行酶活性测定,结果表明rhKl能被Cu2+、Fe3+和Al3+完全抑制;将鸡蛋清用缓冲液适当稀释,在不同温度下孵育一定时间,然后进行酶活性测定,结果显示37℃孵育20min能显着激活酶活性,而100℃孵育30min能使酶失活。为了建立hK1的定量检测方法,以饱和硫酸铵-葡萄球菌A蛋白纯化的hKl特异单克隆抗体为包被抗体,以亲和层析纯化的GST-hKl融合蛋白为抗原,建立双抗体夹心ELISA方法。在优化的反应条件下,检测已知抗原的批内和批间重复性良好,在抗原浓度在16-125μg/ml范围内具有良好的线性关系;用建立的方法对重组载体注射鸡蛋清进行检测,结果在注射载体后的第3、6、9天,蛋清中的rhK1分别为332μg/ml、476μg/ml和248μg/ml。
余福玲[5]2004年在《重组腺相关病毒介导的人组织激肽释放酶对人血管内皮细胞功能的影响》文中认为目的:1、构建携带人组织激肽释放酶基因(human kallikrein,HK)的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体,检测带有目的基因的重组AAV载体(rAAV/HK)滴度。2、体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC,将构建的rAAV/HK导入内皮细胞中,观察感染后内皮细胞一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(cNOS)的分泌情况。方法:1、试验一:在深圳市人民医院李体远博士合成的HK质粒基础上,扩增HK基因,用Xba I, EcoR I分别酶切HK基因和AAV-MCS质粒,然后连接HK和AAV-MCS的线性片断,形成重组腺相关病毒rAAV-HK质粒,经PCR检测和测序后,将rAAV-HK质粒与辅助质粒pHelper、pAAV-RC共转染到HEK293(人胚肾细胞)内包装成rAAV/HK载体,通过β-半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因pAAV-LacZ在人纤维肉瘤细胞(HT1080)中的表达,计算rAAV/HK载体病毒滴度。2、试验二:在相同条件下体外培养2组血管内皮细胞,一组用不同浓度携带目的基因的rAAV/HK(6.2×103mmol/l、6.2×104mmol/l、6.2×105mmol/l)的病毒液感染HUVEC,以硝酸还原酶法和一氧化氮合酶检测试剂盒分别检测48小时后HUVEC细胞培养液中NO的浓度值和cNOS活力,选取其中NO和cNOS表达最高的为HK干预组。另一组为单纯HUVEC细胞(对照组),同时分别检测对照组培养48小时后HUVEC细胞培养液中NO的浓度值和cNOS活力。结果:1、经PCR检测和测序证实rAAV/HK载体存在HK目的基因片断,其长度为800bp,说明rAAV/HK载体构建成功,rAAV/HK的滴度为6.2×107/ml。RT-PCR表明HK的表达有增加。2、病毒液浓度为6.2×103mmol/l的HUVEC细胞培养液中NO表达高于其他浓度值病毒液。与对照组相比,HK干预组细胞液中的NO、cNOS均增加。体外培养48小时后HK干预组细胞液NO浓度值和cNOS活力分别为40.16±7.61μmol/l和7.71±1.25U/ml;而对照组分别为30.82±3.07μmol/l和5.72±1.23U/ml。经SPSS10.0统计处理,48小时后2组差别具有显着性意义(P<0.05=。<WP=4>结论:本试验构建的rAAV/HK载体能将HK导入人血管内皮细胞,并使内皮细胞的NO、cNOS的分泌增多。本研究结果为今后激肽释放酶-激肽系统在人类高血压的基因治疗提供了理论依据。
参考文献：
[1]. 人组织激肽释放酶cDNA的克隆、表达及其基因治疗高血压的初步研究[D]. 张磊. 扬州大学. 2003
[2]. 表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究[D]. 高波. 扬州大学. 2005
[3]. 重组杆状病毒介导的人组织激肽释放酶在昆虫细胞中的表达[D]. 张茹君. 扬州大学. 2009
[4]. 禽腺联病毒序列促进人组织激肽释放酶在鸡输卵管的表达、鉴定及检测方法建立[D]. 陈莉. 扬州大学. 2008
[5]. 重组腺相关病毒介导的人组织激肽释放酶对人血管内皮细胞功能的影响[D]. 余福玲. 福建医科大学. 2004