三峡库区耐淹水植物中华蚊母内生真菌多样性，生物活性及其次级代谢产物研究

论文摘要

三峡大坝建成后,三峡库区形成了夏季水深145 m,冬季水深175 m,长2000km,面积300 km2新的水力波动带,它形成了三峡库区物种多样性和生物分布独特的生态条件。许多野外实地调查表明,由于无法适应淹没时间的倒转、洪水持续时间的延长以及新的水力波动带（垂直高度达到30 m）,大部分坝前河岸植被正逐渐消失。一般来说,在淹水条件下,植物对氧气和光的获取有限,从而产生过量的活性氧（ROS）,这被认为是阻碍淹水植物生长和发育的关键因素。在淹水条件下,植物被迫经历氧化途径,它们通常会形成由一些抗氧化酶和特定代谢物组成的抗氧化防御系统,将这些过量的ROS转化为对自身无害的物质,以保证自身不受侵害。作为共生体,在淹水条件下内生真菌可以产生抗氧化剂,阻断活性氧的连锁反应,帮助寄主植物对各种生物和非生物胁迫作出反应。毫无疑问,天然的抗氧化剂对人类健康也至关重要。此外,由于癌症的发病率越来越高,以及抗生素耐药性导致的超级细菌的新出现和快速进化,基于更安全可靠的植物内生真菌来源的天然产物和新型药物的研究至关重要。药用植物中华蚊母（Distylium chinense）具有极强的耐淹水能力,属于金缕梅科珍稀和常绿灌木,是三峡库区特有植物。到目前为止,有关中华蚊母植物内生真菌的研究与开发还尚不深入,国内外均未见到中华蚊母植物内生真菌多样性的相关报道。基于此,我们以三峡库区代表性植物中华蚊母内生真菌作为研究对象,对实验室前期分离得到的154株内生真菌进行鉴定并对所有菌株进行抗氧化、抗微生物和抗癌活性筛选,得到广谱活性菌株白囊耙齿菌（Irpex lacteus）DR10-1,进一步对其次级代谢产物进行化学成分的分离与鉴定。主要研究结果如下:1、对154株中华蚊母内生真菌进行形态学和分子生物学鉴定,结果表明,154株内生真菌分别属于2个亚门,6个纲,9个目,13个科,27个分类群。27个分类群中包括1个目、6个属和20个种。它们分别为间座壳目（Diaporthales spp.）;拟茎点霉属（Phomopsis sp.）、间座壳属（Diaporthe sp.）、异茎点霉属（Paraphoma sp.）、黑团孢属（Periconia sp.）、耙齿属（Irpex sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）;新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、炭角菌（Xylaria venosula）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、白囊耙齿菌（Irpex lacteus）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、菌根担子菌（Mycorrhizal basidiomycete）、苜蓿茎点霉（Phoma medicaginis）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、赭绿青霉（Penicillum ochrochloron）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、丝核菌（Rhizoctonnia bataticola）、盘状三毛孢菌（Robillarda sessilis）、鬼伞菌（Coprinellus xanthothrix）、大伏革菌（Phlebiopsis crassa）、猪苓菌（Polyporus umbellatus）、Diaporthe longicolla、黄囊耙齿菌（Flavodon flavus）、撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerta）和艾瑞丝间座壳菌（Diaporthe eres）。其中,从门的水平分析,子囊菌门（Ascomycota）为优势种群,一共有132株内生真菌,占菌株总数的85.7%;从纲的水平分析,粪壳菌纲（Sordariomycetes）为优势菌纲,一共有75株内生真菌,占菌株总数的48.7%;从目的水平分析,葡萄座腔目（Botryosphaeriales）为优势菌目,一共52株内生真菌,占菌株总数的33.8%;从分类群的水平分析,拟茎点霉属（Phomopsis sp.）和新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）为优势分类群,分别有38和36株内生真菌,占菌株总数的24.7%和23.4%。结果表明,中华蚊母内生真菌在数量、分布和种群结构等方面都存在很大差异,具有丰富的物种多样性。2、对154株内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物进行了生物活性筛选,包括抗氧化活性、7种病原微生物的抗微生物活性以及2种癌细胞的抗癌活性。结果表明,至少表现出一种生物活性的菌株为153株,占总菌株的99.4%。具体说来,99株内生真菌表现出显著的抗氧化活性,占总菌株的64.3%;153株内生真菌至少对一种测试病原体表现出了抗微活性,占总菌株的99.4%;27株内生真菌至少对一种测试癌细胞表现出了抗癌活性,占总菌株的17.5%。3、白囊耙齿菌（Irpex lacteus）DR10-1表现出最广谱的生物活性,包括显著的抗氧化活性,IC50值为2.79±0.04μg/mL;对所有7种测试微生物均表现出了抗微生物活性;对2种癌细胞均表现出了抗癌活性,值得进一步研究。4、对广谱活性菌株白囊耙齿菌（Irpex lacteus）DR10-1进行扩大的液体发酵,对其乙酸乙酯层进行次级代谢产物的分离、纯化和鉴定。经过反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、薄层制备层析等多种色谱技术分离纯化,共分离得到24个化合物,综合运用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、DEPT、HMBC、HM QC等波谱技术,并与相关文献对比,鉴定了这个24个化合物的构型。包括4个新化合物,分别为倍半萜烯irpexlacte A,呋喃环衍生物irpexlacte B、irpexlacte C、irpexlacte D和20个已知化合物,分别为倍半萜烯irlactin E;倍半萜3β-hydr oxycinnamolide;甾醇类stigmasta-4,6,8（14）,22-tetraen-3-one;三萜类20β-hydroxyd ammara-23-en-3-one;苯环衍生物hydroperoxide,2,5-dihydro-5-methoxy-2,5-dimeth yl-2-furanyl、1,2-benzenedicarboxylic acid,1,2-dibutyl ester、1,2-benzenedicarboxyl ic acid,1,2-bis（2-ethylhexyl）ester、1-phenyl-（4’-hydroxy）-n-nonanone、4-hydroxybe nzaldehyde、p-hydroxyl-benzoic acid;含氮化合物indole-3-carboxaldehyde、indol e-3-carboxylic acid、indole-3-carboxamide、3-（3-methyl-1-oxo-2-butenyl）]1H indol e、β-carboline、4-tert-butyl-2-（4-methoxyphenylamino）phenol、bis（1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinolin-6-yl）isophthalate;多元环衍生物5-（tert-butyl）octahydro-1-benzo furan;脂肪族长链化合物1,2,3-propanetriyl tris（hexadecanoate）。5、对4个新化合物进行抗氧化活性,对铜绿假单胞菌的抗微生物活性以及对肝癌（SMMC 7221）、结肠癌（SW-480）、乳腺癌（T47D和MDA-MB-231）的抗癌活性评估。结果表明,4个新化合物表现出中等抗微生物活性,MIC值在23.8和35.4μM之间,化合物irpexlacte A和irpexlacte D表现出显著的抗氧化活性,IC50值分别为2.50和5.75μM,推测它们可能在帮助清除耐淹水植物中华蚊母体内过量的ROS方面发挥了重要作用。4个新化合物没有表现出抗癌活性。活性检测结果表明菌株DR10-1次级代谢物含有丰富的生物活性,是开发新的活性药物的有效来源。上述结果表明,中华蚊母植物蕴藏着丰富的内生真菌资源。同时,活性筛选结果显示中华蚊母植物内生真菌具有丰富的生物活性,这为新药的筛选提供了丰富的真菌资源。另外,对广谱活性菌株白囊耙齿菌（Irpex lacteus）DR10-1次级代谢产物研究结果显示内生真菌DR10-1具有丰富的代谢物,表现在结构多样、生物活性多样,这为天然活性药物提供了宝贵的真菌可持续资源,为后续研究提供了基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 段小祥

导师: 董锦艳

关键词: 中华蚊母,内生真菌,生物活性,次级代谢物

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技,医药卫生科技

专业: 生物学,农作物,药学

单位: 西南大学

分类号: S567.19;Q93-33;R915

总页数: 110

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