王维利[1]2003年在《Caspase-3及Survivin在肝细胞肝癌中的表达及意义》文中提出细胞凋亡是细胞在有关基因调控下发生的遵循自身程序主动结束自己生命的过程。肿瘤的发生发展是细胞丧失自发凋亡反应能力的最终结果。然而，细胞凋亡的机制仍未完全阐明。近年来的研究表明，细胞凋亡受一些凋亡相关基因蛋白的调控，如：PCNA、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等，但这些蛋白是抑制或诱导凋亡观点不一。Caspase-3是最重要的细胞凋亡效应性蛋白裂解酶，Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白，它具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和调节细胞有丝分裂的重要作用。有研究认为Survivin可通过直接抑制Caspase-3的凋亡作用而致癌。 鉴于上述状况，本研究选用细胞凋亡蛋白酶Caspase-3和凋亡抑制蛋白Survivin的抗体应用免疫组化S-P法和间接双标法-异种动物抗体法分别检测48例肝细胞肝癌(Heptocellular Carcinoma HCC)、40例癌旁组织、25例肝硬化及8例正常肝组织中Caspase-3和Survivin的表达，以探讨细胞凋亡蛋白酶Caspase-3和凋亡抑制蛋白Survivin在HCC组织中的表达特点、意义及相互关系。 结果发现 ①Survivin主要定位于细胞核或细胞浆内，在正常肝脏未见表达，在肝硬化、癌旁组织及HCC组织中表达阳性率分别为8％、5％及43.8％，经统计学处理，Survivin在肝硬化、癌旁组织与HCC组织中的表达具有显着性差异(P＜0.01)。Survivin在高、中、低分安徽医科大学硕士学位论文化HCC组织中表达阳性率分别为3 7.5%、46.4%、41 .7%，其表达的差异无统计学意义(尸>0.05)。②Caspase一3主要定位于细胞浆内，在正常肝组织、肝硬化、癌旁组织及HCC组织中表达阳性率分别为87.5%、84%、85%及60.4%，经统计学处理，Caspase一3在正常肝脏与HCC组织中的表达具有显着性差异(尸<0.05)，caspase一3在肝硬化、癌旁组织与HCC组织中的表达具有显着性差异(p<0.01)。Caspase一3在高、中、低分化HCC组织中表达阳性率分别为62.5%、42.9%、16.7%，其表达的差异无统计学意义(尸>0.05)。③easpase一3和Survivin在HCC组织中表达呈明显的负相关性(:一0.39，尸<0.01)。④S盯vivin和Caspase一3表达的阳性率与HCC患者的性别、年龄、AFP值、肝硬化、肝功能、肿瘤有无包膜、是否伴有门静脉癌栓均无明确关系(尸>0.05);但Survivin表达阳性率与HCC的大小相关，即Survivin在直径)sem的HCC中的阳性表达显着高于直径<scm的HCC(P<0.05)。 上述结果提示，在HCC中Survivin的高表达及CasPase一3的失表达可能与HCC的生长有关，在HCC中Caspase一3和Survivin表达的负相关性可能与HCC的发生发展有密切关系，与预后的关系有待进一步研究。
张建民[2]2003年在《Survivin、NF-κB和nm-23h1在肝细胞肝癌中的表达及意义》文中指出目的：研究凋亡抑制因子Survivin，核因子NF-κB和转移抑制基因nm-23h1在肝细胞肝癌(HCC)中的表达情况，旨在探讨HCC发生的机制及其与HCC病人临床病理特征的关系，为判断HCC侵袭转移的可能性提供依据。方法：以相应癌旁肝组织、10例肝硬变组织、11例肝血管瘤旁正常肝组织作为对照，采用免疫组织化学方法检测41例HCC中Survivin、NF-κB和nm-23h1蛋白的表达情况，所得结果用统计学卡方检验及列联表等级相关分析进行比较。结果：1 Survivin蛋白在肝硬变组织、肝血管瘤旁肝组织、癌旁肝组织中不表达：41例HCC组织中，20例表达阳性，占48.8％，HCC与非癌组织中Survivin蛋白的表达差异有显着性(P＜0.01)；门静脉浸润阳性与阴性的HCC组织中Survivin表达率分别为88.9％(8／9)和37.5％(12／32)，两者比较，差异有显着性(P＜0.05)；单发肿块与多发肿块HCC组织中，Survivin蛋白表达率分别为40％(12／30)和72.7％(8／11)，两者比较，差异有显着意义(P＜0.05)。Survivin基因蛋白表达与HCC的门静脉浸润，肿瘤数目呈正相关(P＜0.05)。2 NF-κB蛋白在HCC组织中阳性表达率为68.3％(28／41)；41例相应癌旁肝组织中有5例表达，占12.2％，10例肝硬变组织中1例表达，11例正常肝组织未见表达，肝细胞肝癌与非癌组织中NF-κB蛋白的表达差异有显着性(P＜0.01)；NF-κB的表达与HCC的临床病理特点无显着相关性，而与Survivin的表达密切相关(P＜0.05)。3 nm-23h1蛋白在41例HCC组织中14例为阳性染色，27例为阴性染色。nm23-23h1阴性表达与肝被膜浸润和门静脉浸润显着相关(P＜0.05)，其阴性表达与Survivin蛋白表达呈明显相关(P＜0.01)。结论：1Survivin、NF-κB在HCC中的高表达提示二者可能参与了HCC的发生、发展，可望作为基因治疗的靶点；2 Survivin在HCC中的阳性表达和nm-23h1在HCC中的阴性表达与HCC的恶性生物学特征相关，可能表明肿瘤的预后不良；3 Survivin与NF-κB、Survivin与nm-23h1在HCC中的表达显着相关，提示它们可能在HCC的发生、发展中起协同作用。
虞长春, 吴强, 吴正升, 凌晓光, 杨枫[3]2006年在《Caspase-3和Survivin在肝细胞癌中的表达及意义》文中研究表明目的研究caspase-3和survivin在肝细胞癌中的蛋白表达及其临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学S~P法检测44例原发性肝细胞肝癌组织中caspase-3和survivin蛋白的表达情况。结果肝细胞癌中caspase-3和survivin阳性率均为75.0%。Survivin的表达与肿块大小、分期有相关性(P<0.05,P<0.01),与年龄、分级无明显相关性(P>0.05),caspase-3的表达与患者年龄、肿块大小、分级、分期均无相关性(P>0.05);Caspase-3和survivin的蛋白表达呈显着负相关(P<0.05)结论Survivin与caspase-3关系密切,survivin可能通过抑制caspase-3活性,在肿瘤生长和进展过程中发挥重要作用。
彭绍华, 杨剑锋, 谢平平, 邓虹, 厉浩[4]2005年在《肝细胞肝癌组织中survivin和caspase 3、Ki67的表达及意义》文中提出目的研究survivin和caspase3、Ki67在肝细胞肝癌(HCC)及癌旁肝组织中的表达及其意义。方法利用RNA提取试剂获取新鲜肝癌组织RNA,用RT-PCR方法测定survivin基因mRNA;用免疫组化方法检测肝细胞肝癌及其癌旁组织中caspase3和Ki67蛋白的表达。结果17例新鲜HCC组织,survivin基因表达阳性13例,阳性率为76.5%,癌旁肝组织和正常肝组织survivin表达全为阴性。13例survivin表达阳性的肝癌组织其caspase3蛋白表达平均染色强度为0.98±0.35.显着低于4例survivin表达阴性的HCC组织1.36±0.47(P<0.01),而survivin表达阳性的HCC组织其Ki67表达强度平均评分为2.787±0.71,又显着高于survivin表达阴性的HCC组织1.662±0.38(P<0.01)。88例肝癌组织caspase3蛋白的阳性表达率明显低于癌旁肝组织(18.5%vs38.6%,P%0.01),caspase3蛋白的表达强度与HCC的分化程度相关,分化愈差,caspase3蛋白表达愈弱(F=8.651,P<0.01);Ki67在肝癌组织中其平均表达强度评分为2.44±1.12,在癌旁肝组织中为散在灶性表达,Ki67表达强度评分与HCC分化程度有关,分化愈差,Ki67表达强度评分愈高(F=9.121,P<0.01)。结论本文结果提示在HCC发生过程中survivin的表达或许可通过抑制caspase3而抑制细胞凋亡,促使细胞增殖,使HCC呈现无限制的生长及恶性程度不断增高。
成胜权[5]2004年在《Survivin基因对人肝癌细胞增殖和凋亡作用机制的研究》文中研究表明原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界范围内流行率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一，与世界其他国家相比，我国HCC死亡率居各国之首，但是肝癌的治疗一直是一个棘手的问题。目前肝癌治疗的主要手段是手术切除，但手术切除只适用于部分早期患者，而且手术后的高复发率影响最终的疗效。由此可见，对HCC发病机制和治疗手段的研究是当务之急。 Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的一个新成员，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而不见于终末分化的成熟组织。研究发现，Survivin对细胞凋亡和细胞分裂周期有双重调控作用：Survivin直接作用于caspase，主要抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或干扰caspase-9的活性，阻断各种刺激诱导的下游细胞凋亡的共同通路；Survivin特异性地在细胞周期G2／M期表达，通过与细胞有丝分裂纺垂体的微管结合，参与对细胞基因的转录调控；Survivin可以直接抑制caspase-3活性以降低肿瘤细胞对许多化疗药物的敏感性。由于Survivin选择性的组织细胞分布特征以及抑制细胞凋亡特殊的作用机理，可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。 研究证明，HCC的发生发展涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活过程，有针对性地选择在HCC发生发展过程中发挥重要作 第四军医大学博士学位论文.亩亩..亩....口目西面.百面面面面面.面画口口.画.面面面面面面面面面面面面面面面百.面面面百面面面面口肠亩.亩百.口...口...亩百日亩亩亩百百亩亩亩百亩亩草用的癌基因或抑癌基因，利用反义寡核昔酸技术、基因剔除、基因替代以及基因转导等技术，抑制或敲除癌基因的表达，以期达到基因治疗HCC的目的。 肿瘤凋亡抑制基因靶向治疗的优点是可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而对正常组织几乎没有不良影响。RNA干涉(RNAint。rference，RNAi)能够特异、有效地降解mRNA，引起转录后水平的基因沉默，在小鼠和人的体外培养细胞中成功阻断了基因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。利用RNAi技术能否在体内、体外成功敲除人肝癌细胞中Survivin基因的表达，诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖是本实验的主要内容。 研究目的:探讨Survivin基因在人肝癌细胞增殖和细胞凋亡中的作用机制，为人肝癌的基因治疗提供理论依据。 实验方法: 1、应用SABC免疫组织化学染色、RT一pCR和western b10t等技术对87例HCC及其50例癌旁肝组织石蜡标本、8例HCC组织和4种人肝癌细胞系(HepGZ、SMMC一7721、HHCC、HCC一9724)中Survivin、P53、Bel一2蛋白和Survivin mRNA以及细胞凋亡进行检测。 2、通过脂质体介导将Survivin基因转染人肝癌细胞系HopGZ中，建立稳定表达survivin基因的HepGZ细胞模型(S竹一HepGZ);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、流式细胞分析(FCM)以及生长曲线等检测转染前后HepGZ中Survivin蛋白及其mRNA的表达、细胞周期和细胞生长的变化。 3、通过脂质体介导将Survivin基因的dsRNAi真核表达载体转染人肝癌细胞系SMMC一7721，建立dsRNAi的SMMC一7721细胞模型(S一RNAi一7721);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、Westernblot、FCM分析、TUNEL技术、透射电镜、DNA Ladder分析以及生长曲线等检测转染前后S翩C一7721中Survivin蛋白及其mRNA的表达、细胞周期和细胞凋亡、细胞增殖以及细胞生长的变化。 4、以BALB/c裸鼠为研究对象，采用皮下注射H即G2、Svv一HepGZ和S枷C一7721、S一刚Ai一7721细胞悬液，建立肝癌细胞 第四军医大学博士学位论文币亩亩.口.亩百百.亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩面面面面面面面面.口国面面面面面面亩百口百目面.面面面面口.面面面面面百西面亩亩.亩.面......口亩亩百亩亩..百亩亩亩亩.百.亩口的裸鼠动物模型;通过测量和称重等方法观察肿瘤形成和肿瘤的生长状况;采用SABC免疫组织化学染色和RT一PCR检测肿瘤组织Survivin蛋白及其mRNA的表达。 5、应用Western blot、 TUNEL技术、DNA Ladder分析和FCM分析等检测抗肿瘤药物表阿霉素在相同浓度(10 pg/ml)不同时间作用于HepGZ、SVV一HepGZ和SMMC一7721、S一RNAi一7721细胞后，Sury ivin蛋白及其mRNA的表达以及细胞周期和细胞凋亡的变化。 实验结果: 1 .Survivin基因在HCC组织和人类肝癌细胞系表达上调，其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、有否转移、Bd一2的表达、组织分化程度及临床分期等均无相关关系，而与突变型P53的表达密切相关。 2.转染Survivin基因的HepGZ细胞出现了Survivin蛋白及其mRNA的表达，成功建立了稳定表达Survivin基因的HepGZ细胞模型，该细胞模型表现出明显的增殖活性。 3.转染Survivin基因dsRNAi的S枷C一7721细胞，Survivin蛋白及其mRNA表达消失，成功建立了稳定表达S盯vivin基因dsRNAi的SMMC一7721细胞模型，该细胞模型表现为Survivin基因在蛋白水平和转录水平表达受阻，出现细胞凋亡的典型特征，细胞生长明显受抑。 4.转
周华[6]2008年在《肝细胞肝癌Livin、Survivin与IGF-2表达相关性及临床意义研究》文中认为目的:探讨肝细胞肝癌(HCC)组织中凋亡抑制蛋白Livin表达情况及其与各临床病理因素的关系,以及与Survivin、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)表达的相关性。方法:应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(SP)检测60例HCC中Livin、Survivin与IGF-2的表达。应用COX风险模型明确Livin,Survivin和IGF-2的预后意义,应用Kaplan-Meier法计算累积生存率。结果:1.肝细胞肝癌组织中32例Livin表达阳性,阳性率为53.3%;39例Survivin表达阳性,阳性率为65.0%;31例IGF-Ⅱ表达阳性,阳性率为51.7%;HCC中Livin、Survivin的表达阳性率均高于癌旁组织及正常组织(P＜0.05)2.Livin、Survivin的表达与HCC肿瘤镜下门静脉癌栓发生密切相关(P＜0.05)。IGF-2的表达与HCC肿瘤镜下门静脉癌栓发生、肿瘤病理分期以及肝硬化密切相关(P＜0.05)。相关性检验示Livin与Survivin的表达之间无相关性;Livin、Survivin的表达与IGF-2之间有相关性(P＜0.01)3.COX回归模型提示Livin、Survivin为HCC独立预后因素。结论:1.Livin、Survivin在肝癌组织中异常高表达,表明Livin、Survivin的表达与原发性肝癌的发生、发展有关。2.在肝癌组织中Livin的表达与Survivin的表达无明显相关关系,提示两者无协同表达作用,它们在细胞凋亡过程中可能有不同作用机制。3.IGF-2的表达阳性率显着高于正常肝组织,此外IGF-2表达与Livin、Survivin的表达呈显着正相关,说明IGF-2在细胞中的强表达对HCC的发生发展起着重要的作用,并且可以通过与Livin、Survivin相互作用抑制细胞凋亡。4.Livin和Survivin表达与患者肿瘤大小、肝硬化、肝功能及HCC病理学分级均无相关关系(P＞0.05),与肿瘤镜下门静脉癌栓形成有相关性;COX模型多因素分析表明患者Livin及Survivin的表达是HCC患者术后生存独立影响因素,提示它们可能成为原发性肝癌预后不良的重要的监测指标和肝癌生物学治疗的新靶点。
龚振斌[7]2012年在《异黏蛋白（metadherin）在肝细胞肝癌中的表达及其作用》文中进行了进一步梳理目的：肝细胞肝癌（HCC）是全球最为常见的致死性恶性肿瘤之一，导致HCC发病的主要危险因子是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virous，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virous，HCV）的感染以及酗酒、黄曲霉素B1（AflatoxinB1）摄入。HBV是HCC最为主要的致病因子，全球有约有53%的HCC患者是与HBV感染相关的。由于我国的高HBV感染率，HCC在我国的发病率位居前列，是导致我国男性肿瘤患者死亡的第二大原因。欧美等西方国家近年来由于HCV感染率的上升，HCC的发病率亦呈上升趋势。HBV和HCV感染导致HCC的的机制并不相同，随着科学技术的发展，对HCC发病机制认识较前明显加深，推动HCC的诊断技术以及治疗技术取得很大进展。但由于缺乏有效的早期诊断和病程判断的标志物，大部分HCC患者在确诊时已失去手术机会，这些患者以及那些根治性手术后肿瘤复发、转移的患者因无有效的非手术治疗手段，预后极差。因此深入研究肝癌发病机制，以期获得一个可以有效进行早期诊断或预后判断的指标和有效的治疗靶点成为广大科研工作者的重要工作。Metadherin（MTDH）在多种恶性肿瘤中表达升高，参与多个重要的信号调控通路，如Ha-ras、NF-κB和Wnt/β-catenin，并参与了肿瘤细胞凋亡、增殖、迁移和转移的调控过程，但其致瘤机制并不完全明了，在HCC发病中的机制更是知之甚少。本实验我们观察了MTDH在HCC中的表达状况，并对其在HCC中发病中的机制作用进行了初步的研究。方法：分别采用qRT-PCR和Western blotting方法检测乙型肝炎和乙肝相关性HCC新鲜组织中MTDH mRNA和蛋白的表达水平，而后用免疫组织化学染色方法检测了上述组织的石蜡包埋切片中MTDH的表达水平。进一步统计分析了MTDH表达水平与乙肝相关性HCC临床参数之间的关系。细胞实验中采用Western blotting方法筛选MTDH高表达和低表达的HCC细胞系，而后分别以MTDH-shRNA或者pCMV-MTDH转染MTDH高表达和低表达HCC细胞系，对转染细胞通过MTT、流式细胞计数仪、western blotting、细胞划痕实验、transwell小室实验等实验方法检测增值、凋亡、迁移等相关指标和下游有关分子。最后，采用裸鼠荷瘤实验观察MTDH-shRNA抑制MTDH表达对成瘤的影响。结果：1、MTDH mRNA和蛋白在乙型肝炎和乙肝相关性HCC组织中均有不同程度的升高，但在正常肝脏组织中未见其表达。MTDH表达主要在细胞核，乙型肝炎组织切片中伴有肝硬化和不伴有肝硬化组之间MTDH表达无统计学差异(P=0.139)。MTDH表达水平与乙肝相关性HCC临床AJCC分期(P=0.020)，T分级(P=0.007)、N分级(P=0.044)、血管侵犯(P=0.006)和组织分化程度(P=0.020)显着相关。Spearman相关性分析MTDH表达和临床参数之间相关性显示MTDH表达与组织学分化程度(0.274; P=0.019)、AJCC分期(0.285; P=0.015)和T分级(0.244; P=0.048)显着相关。统计分析显示MTDH表达染色指数与乙肝相关性HCC患者总体生存时间之间存在显着负相关(Spearman correlation coefficient-0.385； P=0.001)。随后我们采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验方法分析了MTDH对患者总体生存的影响。显示MTDH表达水平与乙肝相关性HCC患者生存时间显着相关(P=0.001)。MTDH高表达组患者平均生存时间为30个月(95%CI，23.4-36.8月)，5年累计生存率为19.4%，但MTDH低表达组患者平均生存时间为49个月(95%CI，42.5-52.8月)，5年累计生存率为65.1%。多变量Cox回归分析显示MTDH表达水平、AJCC分期、T分级和肿瘤分化程度是乙肝相关性HCC患者预后的独立预测因子。2、采用Western blotting方法检测了HepG2、MHCC97-H、Huh73个HCC细胞系中MTDH蛋白的表达水平，结果显示MTDH蛋白均为高表达，其表达水平高低顺序依次为HepG2<Huh7<MHCC97-H。随后我们成功建立了稳定表达MTDH-shRNA的MHCC97-H细胞。MTDH-shRNA有效抑制了MHCC97-H细胞中MTDH的表达，进而抑制HCC细胞的增殖、诱导HCC细胞凋亡增加，并使细胞周期停滞于G1/S期。进一步对MTDH相关分子的研究发现，MTDH调控着ERK1/2、FoxO3a、mdm-2、STAT3、caspase3的活性。与此相反，pCMV-MTDH可有效增加HepG2细胞中MTDH表达，并产生与上述相反之效应。3、体内实验显示MTDH-shRNA稳定转染的MHCC97-H细胞成瘤显着小于对照组，且瘤组织MTDH-mRNA表达显着低于对照组。说明MTDH-shRNA病毒转染颗粒可显着抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的生长以及瘤组织中MTDH基因的表达，以MTDH为靶点的RNAi方法对HCC的治疗有着良好的效果。结论：MTDH是一个新的具有一定早期诊断价值和评估HCC进展程度及预后的生物学标志物，对HCC患者的预后判断有预测意义。MTDH的异常表达在HCC的发生中起着重要作用，HBV感染可能是MTDH异常表达的始动因素之一。MTDH通过调控多种信号转导通路分子参与了HCC的发生和进展。RNAi技术可有效抑制MTDH表达，改善HCC细胞恶性的特征，并有良好的抑瘤效果，提示以MTDH为靶点的RNAi方法对HCC的治疗有着良好的效果。
胡良[8]2009年在《Mcl-1参与HBx和游离脂肪酸诱导细胞凋亡的作用机制研究》文中提出第一部分Mcl-1参与HBx诱导细胞凋亡的作用机制研究研究背景和目的持续HBV感染是病毒引起的包括慢性肝炎、肝硬化等在内的慢性肝病的主要原因,并与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关,在我国HBV感染是HCC最主要的病因。在HBV病毒所编码的蛋白中,HBx蛋白是HBV非结构基因编码的多功能病毒调控蛋白,参与HBV的感染、复制等一系列致病过程,并对肝细胞的增殖、凋亡、代谢、应激、迁移等多种生物学功能具有广泛而复杂的影响,被认为是HBV诱导肝癌发生过程中最主要的决定因素之一,而其确切致病机理仍有待进一步阐明。越来越多的证据表明凋亡是HBV病毒诱发慢性肝病的重要介质,相关研究发现HBx可以增强肝细胞对凋亡信号的敏感性。这些证据提示我们HBx可能通过促进肝细胞凋亡实现其诱发肝癌的作用,而HBx促进肝细胞凋亡的具体机制目前尚无定论。Bcl-2家族是细胞内调节凋亡与存活的最重要的一类蛋白家族,家族成员同时包括抗凋亡和促凋亡分子。其中Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1),中文译为髓细胞淋巴瘤-1,是Bcl-2家族中重要的抗凋亡成员。目前发现Mcl-1广泛表达于各类组织细胞,参与胚胎发育、造血干细胞内稳态的维持,以及细胞凋亡的动态调控。但是,Mcl-1是否参与HBx诱导肝细胞凋亡并在其中发挥重要作用目前国内外均未见有系统报道。本研究从细胞和转基因动物水平观察HBx的表达对氧化应激信号诱导的肝细胞凋亡敏感性的影响,同时观察在此过程中Mcl-1表达水平的改变,明确HBx在何种水平、以何种方式调节Mcl-1的表达;再结合腺病毒介导的过表达技术,阐明Mcl-1在HBx诱导细胞凋亡中的作用;并结合临床HBV阳性肝癌患者的肝组织样本从组织水平明确HBx与Mcl-1表达的相关性。实验方法1.构建HBx和Mcl-1过表达及干扰质粒、包装表达HBx、Mcl-1和干扰Mcl-1的腺病毒、筛选建立HBx稳定细胞系;2.通过流式细胞技术观察瞬时表达和稳定表达HBx的细胞系对氧化应激信号敏感性的变化;3.通过双荧光素酶报告基因实验、RT-PCR和real-time PCR技术以及Westernblot方法分别观察表达HBx的细胞系在氧化应激信号暴露下对Mcl-1启动子转录活性、转录水平及其蛋白质水平的影响;4.使用通路特异性抑制剂实验开展HBx对Mcl-1表达调节的机制研究;5.运用荧光TUNEL法和流式细胞技术验证抑制相关信号通路和过表达Mcl-1在HBx诱导的细胞凋亡中的作用;6.建立HBx转基因小鼠肝氧化应激刺激模型,运用组织TUNEL、Western blot方法从体内水平验证HBx对Mcl-1蛋白水平及肝脏细胞凋亡的影响;7.免疫组化结合Western blot方法观察HBV阳性肝癌患者癌组织中HBx与Mcl-1表达的相关性。结果1.HBx明显增强细胞对氧化应激信号诱导凋亡的敏感性,在此过程中伴随Mcl-1蛋白水平的下调;且HBx能剂量依赖性的及时间依赖性的下调Mcl-1蛋白,并不受细胞系的影响;2.HBx下调Mcl-1蛋白主要发生在翻译后水平;3.过表达Mcl-1显着抑制HBx的促凋亡作用;4.HBx主要通过诱导细胞内ROS显着增加,激活caspas-3进而加速降解Mcl-1蛋白实现其促凋亡作用的;5.HBx转基因小鼠肝脏缺血再灌注处理后肝组织中Mcl-1蛋白水平下降,同时伴随肝细胞凋亡明显增加;6.HBV阳性肝癌患者癌组织中Mcl-1与HBx的表达水平存在负相关。结论本研究发现HBx增强肝细胞对氧化应激信号诱导凋亡的敏感性主要通过显着增加胞内ROS,活化caspas-3进而加速Mcl-1蛋白降解来实现。提示ROS/caspase-3/Mcl-1途径在HBx促肝细胞凋亡的过程中可能发挥重要作用。第二部分Mcl-1参与游离脂肪酸诱导细胞凋亡的作用机制研究研究背景和目的大量研究表明非酒精性脂肪肝是与肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血症以及代谢综合征等疾病病程进展密切相关的代谢性疾病。近年来由于生活方式、饮食结构等的改变,非酒精性脂肪肝的发病率不断增加,目前已成为全世界范围内最常见的肝脏疾病,越来越受到人们的重视。然而,由于非酒精性脂肪肝的病因非常复杂,导致至今仍不清楚其确切的发病机制,因而也缺乏有效的治疗手段。游离脂肪酸是肝脏甘油叁脂的主要来源,目前认为游离脂肪酸是引起肝脏脂毒性的重要介质,并在非酒精性脂肪肝的发病和病程进展中具有重要作用。研究发现,非酒精性脂肪肝病理学的重要特点是肝脏细胞凋亡显着增加。然而,对于游离脂肪酸如何诱导肝细胞发生凋亡的具体机制目前不十分清楚,仍有待进一步研究。近年来研究表明,Bcl-2家族中的Mcl-1作为其家族中一个重要的抗凋亡成员,在肝细胞的生存与凋亡的调控中发挥重要作用,然而Mcl-1是否参与游离脂肪酸诱导肝细胞凋亡并在其中发挥重要作用目前国内外未见相关报道。本实验首先观察游离脂肪酸诱导肝细胞凋亡过程中Mcl-1表达的改变,然后结合腺病毒介导的过表达及干扰技术,明确Mcl-1在游离脂肪酸诱导的细胞凋亡中的作用,并进一步阐明游离脂肪酸调节Mcl-1表达的分子机制。实验方法1.构建干扰Mcl-1的腺病毒;2.通过检测caspase活性和Western blot技术明确游离脂肪酸对凋亡的影响;3.Western blot实验检测游离脂肪酸诱导细胞凋亡过程中Mcl-1蛋白水平的改变;4.real-time PCR技术检测游离脂肪酸对Mcl-1转录水平的影响;5.运用腺病毒介导的过表达和干扰技术明确Mcl-1在游离脂肪酸诱导的细胞凋亡中的生物学功能;6.结合通路抑制剂实验开展游离脂肪酸对Mcl-1表达调控的信号通路研究。结果1.游离脂肪酸中的软脂酸可明显诱导肝细胞发生凋亡;2.软脂酸诱导的细胞凋亡过程中Mcl-1的蛋白水平显着下调;3.软脂酸诱导的肝细胞凋亡主要是由Mcl-1所介导的;4.软脂酸主要在翻译后水平促进Mcl-1蛋白通过泛素—蛋白酶体途径降解;5.抗氧化剂和caspase抑制剂均无法阻断软脂酸诱导的Mcl-1的下降;6.JNK通路介导软脂酸对Mcl-1的负向调节。结论本研究发现软脂酸诱导肝细胞凋亡过程中Mcl-1的蛋白水平显着下调,并进一步明确软脂酸诱导肝细胞凋亡主要是通过激活JNK通路、促进Mcl-1下调实现的,提示JNK/Mcl-1途径在软脂酸诱导的肝细胞脂性凋亡过程中具有重要作用。本研究为深入理解非酒精性脂肪肝发病机制提供新的线索,并为该病的治疗提供新的潜在靶点和策略。
参考文献：
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标签：肿瘤学论文; 肝细胞论文; 肝癌论文; 细胞凋亡论文; 游离脂肪酸论文; caspase-3论文; 癌症论文; 健康论文; hbx论文; 调控论文;