Pseudomonas saccharophila麦芽四糖淀粉酶的重组表达、发酵优化及其应用研究

论文摘要

麦芽四糖淀粉酶（maltotetraohydrolase或maltotetraose amylase,EC 3.2.1.60）具有外切酶活性,属于GH13家族的淀粉水解酶类,从淀粉的非还原末端,特异的依次切割第4个α-1,4糖苷键,生成以麦芽四糖为主的麦芽低聚糖。麦芽四糖是由4个α-D型葡萄糖基以α-1,4糖苷键连接成的直链麦芽低聚糖,是一种功能性食品,其甜度低、保湿性好,具有易消化吸收、低渗透压等特点和抑制肠内腐败菌、保持肠道健康、促进人体对Ca2+吸收等功能,主要应用于食品与医疗领域。本研究首先将嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）来源的麦芽四糖淀粉酶在食品安全菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WS11）中重组表达。接着对重组酶进行分离纯化并考察了酶学性质。然后对重组菌在摇瓶和3-L罐中的发酵培养基进行优化,实现了麦芽四糖淀粉酶的高效表达。最后对利用重组酶制备麦芽四糖的工艺条件进行了优化,并考察了重组酶在延缓面包老化中的应用效果,为麦芽四糖淀粉酶工业化生产和应用奠定了基础。主要研究结果如下:（1）构建了重组菌B.subtilis/pHY300PLK-g4,在33℃条件下,摇瓶发酵48 h后,麦芽四糖淀粉酶的胞外酶活力为147 U·mL-1,SDS-PAGE结果显示分别在57 kDa（定义为I型麦芽四糖淀粉酶）和47 kDa（定义为II型麦芽四糖淀粉酶）处各有一条蛋白条带,结果表明Pseudomonas saccharophila来源的麦芽四糖淀粉酶在B.subtilis WS11中成功表达。对重组酶进行硫酸铵沉淀并用Mono Q阴离子交换柱进行纯化,然后考察了重组酶的酶学性质。结果表明,以可溶性淀粉为底物,I型酶的最大反应速率(Vmax)、米氏常数（Km）、催化常数(kcat)和催化效率(kcat/Km)分别为1739.24μmol·min-1·mg-1、0.13 mg·mL-1、1673.73s-1和12434.84 mL·mg-1·s-1;II型酶的分别为1390.67μmol·min-1·mg-1、0.42 mg·mL-1、1097.70 s-1和2638.70 mL·mg-1·s-1。I型酶和II型酶的最适温度均为55℃,I型酶的最适pH为7.5,II型酶的最适pH为7.0。（2）对重组菌进行发酵优化,首先在摇瓶水平优化重组菌产麦芽四糖淀粉酶的发酵培养基组成,结果表明最佳氮源和碳源成分分别为:25 g·L-1豆粕粉和25 g·L-1工业蛋白胨、5 g·L-1甘油。在此条件下,摇瓶发酵48 h后麦芽四糖淀粉酶的酶活力为236 U·mL-1。以摇瓶发酵培养基为基础,在3-L罐水平上优化了重组菌发酵产酶的培养基组分并降低成本。结果表明,在37℃,pH 7.0下,使用12 g·L-1葡萄糖,25 g·L-1工业蛋白胨和25 g·L-1豆粕粉作为初始培养基,以250 g·L-1葡萄糖,180 g·L-1工业蛋白胨和70 g·L-1豆粕粉为补料培养基进行发酵,至78 h时,酶活力达到最高为1907 U·mL-1,是摇瓶优化前的13倍。然后,考察了重组菌在15-L发酵罐中的生长情况和产酶效果,发酵至96 h时,酶活力达到最高为1219 U·mL-1,具有一定的工业应用价值。（3）考察了反应温度、反应初始pH、加酶量、底物浓度和反应时间对重组麦芽四糖淀粉酶制备麦芽四糖的影响。最终确定了I型酶制备麦芽四糖的最佳转化条件:温度50℃、初始pH 7.5、加酶量30 U·g-1麦芽糊精（DE 5-7）,底物浓度150 g·L-1,转化12 h,麦芽四糖最大转化率可以达到73.2%;II型酶制备麦芽四糖的最佳转化条件:温度50℃、初始pH 7.0、加酶量30 U·g-1麦芽糊精（DE 5-7）,底物浓度250 g·L-1,转化12 h,麦芽四糖最大转化率可以达到73.0%,I型和II型酶在各自的最佳转化条件下,制备麦芽四糖的转化率接近。（4）研究了重组麦芽四糖淀粉酶在延缓面包老化中的应用效果,以高筋面粉、鸡蛋、牛奶、糖、盐和黄油制作吐司面包,以不加酶作空白对照,分别对添加I型酶和II型酶的实验组吐司面包进行质地剖面分析,各项指标显示,添加I型酶的吐司面包效果更好。然后对I型酶的加酶量进行优化并考察贮存期内面包的质地剖面分析参数变化,贮存7天后,添加0.45 U·g-1面团的I型酶的面包的主要参数硬度（g）、粘度（g）和弹性分别为6058.008、-83.419和1.082,而对照组分别为8685.562、-268.709和0.805,表明了重组酶可以延缓面包老化。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 麦芽四糖概述

1.1.1 麦芽四糖的结构与功能

1.1.2 麦芽四糖的制备工艺

1.2 麦芽四糖淀粉酶概述

1.2.1 麦芽四糖淀粉酶的来源与性质

1.2.2 麦芽四糖淀粉酶的结构

1.2.3 麦芽四糖淀粉酶的制备

1.3 枯草芽孢杆菌表达系统

1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统的简介

1.3.2 提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

1.4 延缓面包老化的研究进展

1.4.1 面包老化的机理

1.4.2 酶制剂延缓面包老化的研究

1.5 立题依据及意义

1.6 本论文的研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 基因克隆表达方法

2.2.1 麦芽四糖淀粉酶基因和表达载体基因的克隆与连接

2.2.2 E.coli JM109 感受态的转化

2.2.3 质粒的提取与限制性酶切

2.2.4 B.subtilis感受态细胞的制备和电转化方法

2.3 发酵方法

2.3.1 培养基

2.3.2 摇瓶发酵

2.3.3 3-L罐发酵

2.4 分析方法

2.4.1 菌浓的测定

2.4.2 蛋白浓度的测定

2.4.3 麦芽四糖淀粉酶的酶活测定

2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

2.4.5 重组麦芽四糖淀粉酶的纯化及酶学性质

2.5 麦芽四糖的酶转化工艺

2.5.1 麦芽四糖的制备

2.5.2 麦芽四糖的检测方法

2.6 面包制作的工艺流程

2.7 面包质构的测定方法

第三章结果与讨论

3.1 麦芽四糖淀粉酶在B.subtillis中的重组表达及酶学性质研究

3.1.1 产麦芽四糖淀粉酶重组菌的构建

3.1.2 重组麦芽四糖淀粉酶在B.subtillis中的表达

3.1.3 重组麦芽四糖淀粉酶的纯化

3.1.4 重组麦芽四糖淀粉酶的酶学性质研究

3.2 重组菌B.subtilis/pHY300PLK-g4 产麦芽四糖淀粉酶的发酵条件优化

3.2.1 重组菌的摇瓶发酵优化

3.2.2 重组菌的3-L罐发酵优化

3.2.3 重组菌的15-L罐发酵

3.3 重组麦芽四糖淀粉酶制备麦芽四糖条件优化

3.3.1 反应初始pH优化

3.3.2 反应温度优化

3.3.3 加酶量优化

3.3.4 底物浓度优化

3.3.5 反应时间优化

3.4 重组麦芽四糖淀粉酶在延缓面包老化中的应用

3.4.1 I型和II型麦芽四糖淀粉酶在延缓面包老化中的应用效果对比

3.4.2 加酶量对I型酶在延缓面包老化中的影响

3.4.3 贮存期内I型酶对延缓面包老化的影响

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨亚楠

导师: 吴敬

关键词: 麦芽四糖淀粉酶,枯草芽孢杆菌,发酵优化,麦芽四糖,面包

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925.1

总页数: 53

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Pseudomonas saccharophila麦芽四糖淀粉酶的重组表达、发酵优化及其应用研究

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