单增李斯特菌lmo2193基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究

论文摘要

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一种胞内致病菌,主要感染免疫功能低下的个体,可致败血症、脑膜炎、胎儿感染或流产等。寡肽转运蛋白（Oligeopeptide transporter,Opp）是寡肽转运系统中运送胞内生长所必需的氨基酸及调控细菌毒力的一类蛋白质。在基于利用泛基因组技术对LM的研究中,首次发现lmo2193基因具有Opp活性,但其具体功能尚未知。本研究以新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2为研究材料,对lmo2193基因进行克隆、生物信息学分析及原核表达后通过重叠延伸PCR与同源重组技术构建lmo2193基因缺失株及回补株,并将缺失株分别与野毒株、回补株进行比较,分析其环境适应性、生物被膜形成能力、细胞粘附侵袭性、胞内增殖毒力影响等探究lmo2193基因作为Opp在LM中的功能及其对致病性的影响。目的:（1）生物信息学分析推测LM90SB2菌株lmo2193基因功能。（2）构建该基因的缺失株及回补株。（3）研究该基因缺失对LM环境适应性及生物被膜形成能力的影响。（4）研究该基因缺失对LM毒力的影响。方法:（1）PCR扩增lmo2193基因,克隆测序,进行生物信息学分析,并表达该蛋白,用SDS-PAGE凝胶电泳与Western Blot技术鉴定。（2）PCR扩增上下游臂,利用重叠延伸PCR扩增融合片段,与穿梭质粒pKSV7连接,电转至野毒株感受态中筛选阳性转化子,双重压力传代培养筛选基因缺失株;将该基因与整合型质粒pIMK2连接,电转至缺失株感受态中筛选基因回补株;检测遗传稳定性。（3）在不同环境压力条件下对缺失株与野毒株、回补株的生长曲线及不同时间段生物被膜形成进行比较。（4）分别利用缺失株、野毒株、回补株感染不同来源的细胞,对细胞粘附、侵袭性及胞内增殖能力进行比较;感染小鼠,检测LD50及比较肝脏、脾脏、脑组织载菌量的差异。结果:（1）生物信息学分析显示:lmo2193蛋白为ATP超家族,推定该基因为oppD;原核表达该基因,获得60 kDa左右的融合蛋白,与预期一致。（2）成功构建了具有良好稳定遗传性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回补株CLM90SB2ΔoppD。（3）在不同温度、EtOH浓度、pH、NaCl浓度条件下LM90SB2ΔoppD比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD生长缓慢;LM90SB2ΔoppD的网格密集程度与生物被膜形成量均低于LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD。（4）LM90SB2ΔoppD对四种细胞的粘附及侵袭率相比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD均有所下降;在SIEC细胞内,三株细菌增殖量均逐渐减少,而在RAW264.7、MBMEC和HBMEC,菌量均呈逐渐增多趋势;小鼠实验中,LM90SB2ΔoppD的毒力水平较LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD分别提高了1.34、0.5个数量级;LM90SB2ΔoppD在各组织载菌量均低于LM90SB2与CLM90SB2ΔoppD。结论:（1）推定LM90SB2菌株lmo2193基因功能为OppD。（2）成功构建了稳定遗传性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回补株CLM90SB2ΔoppD。（3）LM90SB2菌株lmo2193基因的缺失会使其环境适应性及生物被膜形成能力降低。（4）LM90SB2菌株lmo2193基因缺失会使其毒力下降。

论文目录

摘要

Abstract

英文缩略词表

第一章绪论

1 研究目的及意义

2 国内外研究进展

2.1 单增李斯特菌

2.2 LM感染致病机制

2.2.1 细胞生物学感染过程

2.2.2 进入细胞

2.2.3 逃离或停留在液泡中

2.2.4 入侵肠道、肝及胎盘

2.3 LM营养代谢机制

2.3.1 胞质溶胶的作用

2.3.2 营养代谢途径

2.3.3 整合代谢和毒力基因表达

2.4 寡肽转运蛋白研究进展

2.4.1 OppA

2.4.2 OppB

2.4.3 OppC

2.4.4 OppD

2.4.5 OppF

3 研究内容

3.1 LM90SB2 菌株lmo2193 基因克隆、生物信息学分析及原核表达

3.1.1 基因克隆及生物信息学分析

3.1.2 基因编码的蛋白的诱导表达及鉴定

3.2 LM90SB2 菌株lmo2193 基因缺失株和回补株的构建

3.2.1 lmo2193 基因缺失株的构建

3.2.2 lmo2193 基因回补株的构建

3.3 lmo2193 基因缺失对LM90SB2 环境适应性与生物被膜形成的影响

3.3.1 不同环境适应条件下的影响

3.3.2 生物被膜形成量及形成能力的影响

3.4 lmo2193 基因缺失对LM90SB2 毒力的影响

3.4.1 细胞水平毒力试验

3.4.2 动物水平毒力试验

第二章试验研究

试验一 LM90SB2 菌株lmo2193 基因克隆、生物信息学分析及原核表达

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 引物的设计合成

1.2.2 LM90SB2 菌株DNA的制备

1.2.3 目的基因的扩增与测序

1.2.4 同源性及生物信息学分析

1.2.5 重组表达质粒的构建

1.2.6 重组蛋白的诱导表达

1.2.7 Western Blot鉴定

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增及克隆

2.2 同源性分析比对

2.3 系统进化分析

2.4 蛋白理化性质分析

2.5 信号肽和蛋白跨膜区分析

2.6 蛋白结构及功能预测分析

2.7 重组表达质粒的鉴定

2.8 重组蛋白的诱导表达

2.9 Western Blot鉴定结果

3 讨论

4 小结

试验二 LM90SB2 菌株lmo2193 基因缺失株和回补株的构建

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.1.4 引物的设计合成

1.2 方法

1.2.1 上下游臂的扩增

1.2.2 重叠延伸PCR（SOE-PCR）

1.2.3 融合片段的克隆测序

1.2.4 重组质粒pKSV7Δlmo2193 的构建

1.2.5 野毒株LM90SB2 感受态的制备

1.2.6 电击转化

1.2.7 同源重组与基因缺失株稳定遗传性检测

1.2.8 基因回补株的构建

1.2.9 生长曲线的测定

2 结果与分析

2.1 lmo2193 基因上下游臂的扩增

2.2 lmo2193 基因重叠延伸PCR扩增

2.3 融合片段双酶切鉴定

2.4 pKSV7Δlmo2193 双酶切鉴定

2.5 电击转化阳性转化子筛选与鉴定

2.6 同源重组的筛选鉴定与遗传稳定性

2.7 基因回补株的鉴定

2.8 生长曲线的测定

3 讨论

4 小结

试验三 lmo2193 基因缺失对LM90SB2 环境适应性与生物被膜形成的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 不同温度条件下生长曲线测定

1.2.2 不同Et OH浓度条件下生长曲线测定

1.2.3 不同p H条件下生长曲线测定

1.2.4 不同NaCl浓度条件下生长曲线测定

1.2.5 生物被膜形成能力的测定

2 结果与分析

2.1 不同温度条件下生长曲线的测定

2.2 不同EtOH浓度条件下生长曲线的测定

2.3 不同pH条件下生长曲线的测定

2.4 不同Na Cl浓度条件下生长曲线的测定

2.5 生物被膜形成能力的测定

3 讨论

4 小结

试验四 lmo2193 基因缺失对LM90SB2 毒力的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞株及动物

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

1.2.2 细菌悬液制备

1.2.3 细胞的粘附、侵袭及胞内定殖试验

1.2.4 小鼠动物试验

2 结果与分析

2.1 细胞粘附、侵袭试验

2.2 细胞内增殖试验

2.3 小鼠存活率

2.4 LD50 的测定

2.5 小鼠组织载菌量的测定

3 讨论

4 小结

第三章全文结论

第四章创新点

参考文献

附录一

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李红欢

导师: 马勋,王静

关键词: 单核细胞增生李斯特菌,基因,基因缺失,基因回补,生物学特性

来源: 石河子大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 石河子大学

基金: 国家自然基金项目,项目名称:基于单核细胞增多性李斯特菌分选酶SrtA的蛋白组学和免疫蛋白组学研究,项目编号:31360614

分类号: S852.61

总页数: 75

文件大小: 6526K

下载量: 102

单增李斯特菌lmo2193基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢