焦红敬[1]2018年在《基于细胞膜片技术构建血管化组织工程移植物的研究》文中提出目的:本研究采用细胞膜片技术(CST)培养血管化干细胞膜片,将其包裹到聚四氟乙烯管的外面,构建血管化组织工程(TE)移植物,并将该移植物埋植到SD大鼠背部皮下,观察此移植物与宿主血管吻合情况并评估体内血管形成能力,为器官移植出现血液供应不足时提供一种新的血管化策略。材料和方法:(1)成人骨髓间质干细胞(hMSCs)的培养及传代:复苏hMSCs并培养,观察hMSCs的形态,采用MTT实验探究hMSCs的生长趋势;(2)hMSCs膜片的制备及表征:将hMSCs种植于培养皿中,连续培养14天形成hMSCs膜片,通过H&E染色和SEM等方法对其表征;(3)血管化干细胞膜片和血管化组织工程移植物的构建及其表征:通过连续培养hMSCs 14天构建细胞膜片,于膜片上种植人脐静脉内皮细胞(HUVECs),形成血管化干细胞膜片,将其包裹到聚四氟乙烯管的外面,构建血管化TE移植物。利用SEM、CD31免疫荧光染色、拉伸实验等方法对其表征;(4)血管化组织工程移植物的体内实验:将血管化TE移植物hMSC/HUVEC植入到SD大鼠背部皮下,以管状hMSCs膜片作为对照,2周、4周后分别进行H&E染色和CD31免疫荧光染色,探究此移植物与宿主血管吻合情况并评估体内血管形成能力。结果:(1)倒置光学显微镜下观察hMSCs呈纺锤样,MTT结果显示随着培养时间的延长,hMSCs增殖呈明显的S形;(2)H&E染色结果显示:hMSCs膜片有大量的细胞外基质分泌,厚度可达到100~150?m;SEM结果显示:细胞排列紧密有序,有大量细胞外基质形成;(3)CD31免疫荧光染色结果表明:于hMSCs膜片上种植HUVECs 1、3天后微腔形成不明显,7天后可见大量微腔的形成;拉伸实验结果显示:此移植物应变达到30%,应力达到1.5MPa;(4)血管化组织工程移植物的体内实验:移植物埋植SD大鼠皮下2、4周后对提取的组织采用HE染色,结果显示hMSC/HUVEC移植物中有大量血管生成,但在不含HUVECs的hMSCs移植物中观察到少量血管;免疫荧光分析结果显示,hMSC/HUVEC移植物形成血管样结构显着增强,形成了相互连通的复杂毛细管状网络,然而,hMSCs移植物形成的管样结构不明显。结论:通过体外和体内数据分析表明,基于细胞膜片技术成功培养血管化干细胞膜片,制备内衬为HUVECs,外层由hMSCs膜片组成的hMSC/HUVEC移植物,并且成功埋植到SD大鼠皮下,发现此移植物与宿主血管发生功能性的吻合并有大量血管样结构的生成。由此证明此移植物为组织生长提供了必需的干细胞和血液供应,为组织工程提供了一种新型血管化策略。
夏文森[2]2006年在《组织工程方法构建全生物化血管移植物的实验研究》文中研究表明目的：血管移植物已经常规应用于治疗心血管疾病，但是自体动静脉来源不足，数量有限，不适用于大口径血管和多次移植手术，合成材料作为血管替代物容易形成血栓，尤其不适用于小血管。鉴于这些问题，很多研究试图利用生物材料和自体细胞构建出组织工程血管。脱细胞基质是一种重要的材料，具有较低的免疫原性，良好的生物相容性，较强的机械和生理特性。内皮细胞可以分泌抗血栓因子，对于维持血管功能具有不可替代的作用。本课题试图用组织工程的方法，体外培养血管内皮祖细胞(endothelial progenitot cells，EPCs)，种植到脱细胞基质上，构建出组织工程血管，并移植到细胞供体山羊体内，研究是否可以用于构建血管移植物并希望通过此项研究为组织工程血管临床应用提供实验基础。 方法： 1) 抽取山羊外周血，通过密度梯度法培养的血管内皮祖细胞，摸索体外培养条件，并应用电镜、免疫细胞化学等方法检测EPCs的生长特性、细胞表面标志物和定向分化能力。 2) 观察去垢剂、胰蛋白酶、机械法等对山羊颈动脉去细胞的影响，探讨血管组织工程生物支架的最佳制备方法。 3) 将制备的脱细胞血管支架植入山羊皮下，及在体外种植EPCs，观察脱细胞血管支架的生物相容性。
肖仕辉[3]2012年在《大网膜包裹构建血管化组织工程骨的实验研究》文中进行了进一步梳理目的探讨利用大网膜包裹构建血管化组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损能力,评估大网膜包裹构建大段血管化组织工程骨的可行性及其对骨缺损的修复效果,为组织工程骨用于临床提供及补充实验依据。方法采用全骨髓贴壁培养法结合换液传代分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs),通过观察细胞形态、多向分化诱导及电镜下观察成骨诱导前后细胞的结构改变对其进行鉴定,MTT法测定第叁代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。取成骨诱导后生长状态良好第叁代细胞兔骨髓间充质干细胞接种到自制的生物衍生骨支架材料上构建组织工程骨,将体外构建的组织工程骨(TEB)植入体内,分为大网膜包裹组织工程骨组和单纯组织工程骨组。术后不同时间点观察两组移植物的表面变化及周围组织反应,术后4周,8周,12周行X线摄片检查移植物修复骨缺损情况,行标本大体观察及组织学检测,观察成骨及血管化情况。结果两组移植物植入兔桡骨缺损处后,术口生长良好,未发现明显的全身及局部的毒性和炎症反应,每只动物的手术切口均达到一期愈合。大网膜包裹组在术后12周时X线表明植入物与宿主骨连接处基本愈合,而单纯组术后12周与宿主骨愈合不甚满意。同时大网膜包裹组骨修复区的骨灰度值都高于单纯组织工程骨组,且差异有统计学意义(P<.05)；术后4周,8周,12周通过分析骨组织学切片,表明不同时间点大网膜包裹组新生骨小梁面积都明显高于单纯组织工程骨组,且差异有统计学意义(P<0.01)；同时从骨组织学分析材料的血管化面积,表明在同一时间点大网膜包裹组新生血管面积均高于单纯组织工程骨组(P<0.05),差异有统计学意义。结论利用具有丰富血管网的大网膜包裹组织工程骨植入兔桡骨缺损处,促进组织工程骨的血管化及成骨能力,提高了组织工程骨修复骨缺损的质量。
赵亮[4]2014年在《基于双层蛛丝蛋白血管支架和干细胞构建小直径组织工程血管及其修复动脉缺损的研究》文中研究表明血管移植手术是治疗心血管疾病的主要手段。自体血管和人工合成血管是临床上常用的血管移植物,但自体血管来源有限,难以满足临床需求。人工合成血管如涤纶(Dacron)和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)在大直径血管(内径>6mm)移植中有较佳的效果,但在小直径血管(内径<6mm)移植中容易出现形成血栓、内膜增生、血管狭窄甚至阻塞等现象。组织工程血管技术为小直径血管移植物提供了新来源。目前小直径组织工程血管的构建的方法包括体内构建和体外构建：体外构建包括诱导分化、细胞种植和体内移植叁个过程；体内构建是将复合有种子细胞的血管支架移植到动物体内血管缺损部位,借助动态血流环境和体内刺激构建组织工程血管。基于这两种方法构建的组织工程血管已有报道,但是尚未有能应用于临床。分析认为存在以下问题：血管支架的生物学性能和力学性能不足；血管支架不具有多层次结构,不能为不同的血管细胞提供合适的微环境；应用的种子细胞传代次数有限,增殖能力不强,基质分泌受限,无法形成有效的组织工程血管；静态培养构建的组织工程血管在力学性能和生理功能方面与天然血管存在差异。针对这些问题,本研究结合前期的工作基础,采用集成的解决办法,提出本研究思路：模拟血管多层结构,应用静电纺丝工艺,共混RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR16)、聚己内酯(PCL)、壳聚糖(CS)和明胶(Gt),构建(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)双层蛛丝蛋白血管支架,结合支架的降解性质、生物力学性能、血液相容性和生物安全性的研究,全面评价血管支架的材料与生物学性能。优化SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离及其分化为内皮细胞的方法,研究其生物学特性,探讨信号通路在血管支架与干细胞相互作用过程中的作用机制。模拟动物体内的动态血流环境,将间充质干细胞与血管支架复合动态培养,在体外培养构建形成类似天然血管的组织工程血管。将制备的小直径组织工程血管修复SD大鼠血管缺损,考察其移植体内后结构稳定性及血流通畅性,分析其修复血管的能力,为其临床应用奠定基础。研究结果如下：一、应用静电纺丝技术制备双层蛛丝蛋白血管支架,并对其进行理化性能的表征。同时制备了脱细胞血管支架作为性能评价的参照物,其管壁的弹性良好,管腔内表面光滑。扫描电镜观察显示双层蛛丝蛋白血管支架微观结构为纳米级纤维彼此交错排列形成的叁维多孔网状；接触角仅为47度,亲水性能优良；X射线光电子能谱(XPS)研究表明其光谱区域出现了P2p (134.57eV)信号,证实pNSR16整合进了血管支架中；其具有较强的抗热性能,优于脱细胞血管支架；玻璃化转变温度为32.01℃-44.43℃；经105℃高温处理3小时后,其水分丧失率为11.2%,高于脱细胞血管支架。二、探讨双层蛛丝蛋白血管支架的生物力学性能与降解性能。其爆破强度、拉伸强度和缝合强度大小均与质量分数和管壁厚度成正比,孔隙率、水渗透性和断裂伸长率大小与质量分数和管壁厚度成反比。爆破强度的范围为39kPa-150kPa,高于生理血压；缝合强度大于0.19N,满足体内移植的要求；拉伸强度高于人体桡动脉血管,满足体内移植的要求；水渗透性为0.3-06mL· min-1·cm-2。体外降解结果表明：其降解程度深于同等条件下的(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,血管支架在酶解液中的降解程度均高于在PBS中的降解；吸水率在12周时达到80%-90%,高于对照组；在降解液处理期间,其降解液pH值较为平稳,(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架降解液pH值下降趋势明显；其初始抗弯强度和初始分子量大于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,前者抗弯强度和分子量下降较快,而后者的抗压强度下降较缓慢。体内降解结果表明：血管支架在整个植入期内不断降解,(pNSR.16/PCL/CS)/(pNSRl6/PCL/Gt)支架降解程度更深,纤维断裂严重,12周时失重率为20.3%,其降解速度明显快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,后者在12周时仅降解了13.2%。叁、评价双层蛛丝蛋白血管支架的生物安全性与血液相容性。在血管支架浸提液培养条件下的间充质干细胞呈现梭形,团聚式增殖。大鼠腹腔注射血管支架生理盐水浸提液,7天内实验组大鼠全部存活,与对照组比较,外观未见异常改变,脏器指数在统计学上无显着性差异。皮肤刺激试验结果表明,实验组大鼠平均记分在0-0.4范围内,无红斑、水肿形成,属于极轻微刺激反应类型,HE染色表明无炎症出现。在敷贴试验中实验组大鼠皮肤无明显变化,无红斑和水肿,平均反应等级都为0。彗星电泳试验表明血管支架浸提液不会对细胞造成DNA损伤,细胞核完整。注射血管支架浸提液的SD大鼠的体温升高值低于0.2℃,表明浸提液不含致热源物质,植入动物体内后其无热源作用。经支架浸提液处理的间充质干细胞的染色体畸变率均<5%,符合生物安全要求。注射血管支架浸提液后,昆明小鼠PCE的微核率为3.1±1.5‰,无致畸性,表明支架浸提液不会造成细胞DNA损伤。血管支架的溶血率仅为1.5%,符合IS010993小于5%的要求；复钙化凝血时间和动态凝血时间实验结果证实其具有良好的抗凝血性能,且与(PCL/CS)/(PCL/Gt)相比在统计学上具有显着性差异；血管支架上黏附的血小板极少,P-选择素表达量仅为0.389,其吸附蛋白的量明显低于(PCL/CS)/(PCL/Gt)。在浸入新鲜血液中后,12h内血管支架管腔持续通畅,无血栓出现。对血管支架进行生理盐水溶液浸提,在浸提25d内,其抗凝血性能始终良好。作为血管组织工程支架材料,双层蛛丝蛋白血管支架具有良好的血液相容性。四、优化SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)分离及向内皮细胞分化的方法,研究干细胞的生物学特性。MSc多呈梭形和星形,细胞形态均一,细胞生长旺盛。分离自骨髓的MSC的CD105和CD90因子的表达率分别为82.54%和94.98%,而CD45因子的表达率仅为7.32%。第4代MSC多呈梭形,细胞呈团聚分布,增殖能力强,增殖指数达到20.31%,潜伏期短,自第2天就进入对数生长期；第8代MSC的增殖能力显着减弱,增殖指数仅为9.24%,细胞形状呈现不规则状,胞体变大,有老化现象。第2代和第4代MSC冻存复苏后的存活率均高于80%,第8代MSC的存活率大约为60%。MSC在诱导5d时CD31即有较弱表达,随着诱导时间的延长,表达随之增强。诱导10天后,所有代数的MSc均表达CD31,但是第2代、第4代和第6代MSC表达CD31的阳性率与第8代相比有差异。在4h时,不同代数的MSC在双层蛛丝蛋白血管支架上有了不同程度的黏附,第6代之前的干细胞的黏附率皆在40%左右,然而第8代干细胞的黏附率为27%。五、评价双层蛛丝蛋白血管支架的细胞相容性与组织相容性,探讨信号通路在血管支架与干细胞相互作用过程中的作用机制。在血管支架浸提液培养条件下的大鼠骨髓MSC集落生成率、平均集落面积和分裂指数都显着高于对照组。血管支架毒性等级均低于1级,无细胞毒性。与血管支架浸提液复合培养的MSC生长状态良好,台盼蓝拒染率高于95%,复合培养48h后,细胞G0/1期比例降低,S、G2/M期比例均升高。MSC在血管支架上能良好地黏附生长,增殖旺盛,能够迁移到血管支架内部。Notch信号通路对干细胞在双层蛛丝蛋白血管支架上的增殖起着重要的作用,pNSR16与Notch信号通路有相互作用关系,pNSR16有可能是Notch受体的配体结构类似物,起着配体作用。而不含有RGD叁肽的胶原蛋白与Notch信号通路无相互作用关系,由此认为pNSRl6中的RGD序列能有效促进细胞的增殖。与血管支架复合培养的MSC中Notch信号通路下游基因Hesl的表达量高于对照组,且第6代MSCHesl基因表达比值低于第4代。血管支架皮下植入2周后,血管支架上的炎性细胞数量少于对照组,不会诱发严重的炎症反应。双层蛛丝蛋白血管支架的组织相容性优于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,且前者的降解速度快于后者。六、应用动态培养的方法将间充质干细胞和双层蛛丝蛋白血管支架复合培养构建小直径组织工程血管。培养7天后,细胞和支架表面结合紧密,细胞在纳米纤维支架上充分铺展,并且可以迁移到血管支架纤维内部生长,细胞与血管支架纤维表现出很好的相容性,与材料融合成为叁维细胞网状结构,且将材料纤维大部分包埋,形成了组织工程血管。组织工程血管的缝合强度为0.95±0.12N,是天然血管的29.6%。随着时间的持续,组织工程血管中的羟脯氨酸含量和DNA含量不断增加,羟脯氨酸含量在第14天和第28天分别达到0.16ug/mg和0.2ug/mg,且与对照组相比在统计学上有显着性差异。七、探讨组织工程血管修复SD大鼠腹主动脉缺损的效果。在移植手术期间,重新恢复血流时组织工程血管以及吻合口均未出现渗血漏血现象,置换后可观察到血管搏动良好。术后动物恢复良好,未见发炎现象。体重为350-450g的SD大鼠腹动脉管径与人体主要冠状动脉(LAD中远段)相比无明显差别。经血液生理生化指标分析,证实该组织工程血管对肝肾无明显毒性作用。在移植体内12周后组织工程血管的断裂强度为3.4MPa,相对于移植前的强度(6.1MPa)有所降低,但仍然高于天然血管的断裂强度,说明小直径组织工程血管在体内组织液环境中能保持一定程度的力学强度。在12周的移植期内胶原蛋白的合成与分泌不断增加,羟脯氨酸的相对含量在2周时约为12.5%,在12周时增加到46.7%。12周后移植血管内壁覆盖有较多的细胞。结论：本研究成功构建了双层蛛丝蛋白血管支架,其具有良好的抗热性、亲水性、血液相容性、生物力学性能、适宜的降解性能和生物安全性。优化了大鼠骨髓MSC的分离方法,分离的MSC增殖性良好,在体外培养条件下不同代数的MSC的生物学性能有一定的差异。MSC与双层蛛丝蛋白血管支架的细胞相容性良好,蛛丝蛋白可能是与Notch信号通路的Notch受体相互作用,促进下游基因Hesl的表达,促进细胞的增殖。应用动态培养的方式构建了小直径组织工程血管,并应用于SD大鼠腹主动脉的缺损修复,12周的移植期内无血栓,大鼠身体状况良好,表明小直径组织工程血管应用于临床具有一定的可行性。
王莉[5]2015年在《一种具有原位血管再生潜能的小口径肝素化血管移植物的制备》文中指出心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是世界上发病率和死亡率最高的疾病之一，严重影响人类的健康。近年来随着我国人口的老龄化和居民饮食结构的改变，心血管疾病的发病率更是呈逐年上升趋势。血管移植术是目前有效治疗心血管疾病的手段，临床上应用的血管移植物主要有二个来源：自体血管和人工组织工程血管。虽然自体血管是最理想的血管移植物，但是常由于患者自身病变以及来源有限等不能满足临床需求，商品化的人工血管口径较大（＞6mm），且易形成血栓，不能满足冠状动脉以及周围动脉小口径血管的要求。因此寻求一种机械性能和生物性能俱佳的血管支架材料日益成为研究者关注的热点。为此本研究利用人新生儿脐动脉为原材料，通过酶-去污剂去细胞技术进行去细胞处理，制备去细胞血管支架。然后通过交联剂EDC和NHS，将肝素共价结合在去细胞血管支架上，制备出生物力学和血液相容性俱佳的肝素化血管支架。方法：1.以新生儿脐动脉为血管材料，通过酶-去污剂去细胞技术，制备去细胞血管支架。通过HE染色、Hoechst染色观察去细胞血管支架细胞的形态学结构。2.通过交联剂EDC和NHS，将肝素以共价键的形式结合在去细胞血管支架上，制备肝素化血管支架。并通过甲苯胺蓝染色和傅里叶变换衰减全反射红外光谱分析（ATR-FTIR）来评价肝素化血管支架的肝素负载情况。3.通过HE染色、Masson叁色染色和VG染色观察天然脐动脉、去细胞血管支架和肝素化血管支架的形态学结构变化；通过扫描电镜检测叁种血管支架的内腔表面的超微结构形态；通过对胶原蛋白和蛋白多糖含量的测定来评价肝素化血管支架对血管基质的保留情况；通过对生物力学的测定来评价叁种血管支架机械强度和顺应性的变化。4.分别通过血小板黏附试验和动静脉分流试验（AV-shunt），观察肝素化血管支架分别在体外和体内情况下的血液相容性。结果：1. HE染色、Hoechst染色发现，去细胞血管支架，不仅完全将血管中的细胞成分去除，而且血管基质结构保留完整，形态保持良好。2.甲苯胺蓝染色结果发现肝素沿着ECM中的纤维走向分布，表明肝素结合在血管支架基质纤维的表面；肝素化血管支架ATR-FTIR图谱中出现了肝素分子的特征性吸收峰，并且酰胺键的吸收峰值变强，表明肝素已成功以共价键的形式固定在了血管支架上。3. HE染色、Masson叁色染色和VG染色结果表明肝素化血管支架胶原纤维和弹力纤维均得到很好的保留；扫描电镜检测发现，去细胞血管支架经肝素化处理以后，内腔表面由多孔样结构重新变得光滑；在对胶原蛋白和蛋白多糖含量的测定结果发现肝素化血管支架较好地保留了天然血管ECM的主要成分胶原蛋白和蛋白多糖；通过对叁种血管支架爆破强度和拉伸曲线的检测，发现肝素化血管支架生物力学性能相比去细胞血管支架得到很大程度的优化。4.在血小板黏附试验中，肝素化血管支架相比去细胞血管支架能显着地降低表面血小板的黏附和活化；在动静脉分流活体实验中得到与血小板黏附试验相一致的结果，并且对动静脉分流后血管支架血栓面积的统计表明，肝素化血管支架的血栓面积百分比远远低于去细胞血管支架，更能直观地说明肝素化血管支架在活体实验情况下能有效地抑制血栓形成。结论：1.通过酶-去污剂去细胞方法，成功制备去细胞血管支架，血管基质形态和结构保留完整。2.成功制备出以共价键结合的肝素化血管支架。3.肝素化血管支架，保留了天然血管基质的复杂的叁维结构和胞外基质成分，并且其生物力学性能相比去细胞血管支架得到很大程度的优化，满足血管移植物的要求。4.肝素化血管支架在体外实验和活体实验均能抑制血栓的形成，具有良好的血液相容性，为临床应用提供实验依据。
杨欣[6]2016年在《PGS/PCL双层血管移植体体内引导重塑重建颈动脉的实验研究》文中认为头颈部恶性肿瘤的发病率占总体恶性肿瘤发病率的6%,侵犯到颈动脉的病例也屡见不鲜,预后很差,连同肿瘤整体切除并重建被肿瘤侵犯的颈动脉,是一种比较理想的治疗手段。而重建颈动脉就需要有适合的血管移植体来替换病变的颈动脉。同样,因心血管疾病引起的冠心病及周围血管性病变的有着更高的发病率,严重影响着人类的健康和生命,还有肾衰竭患者血液透析治疗前动静脉通路的建立等等,临床上有很多疾病的治疗都迫切需要一个理想的血管移植体,它需要具备能够长期在体内履行血管的功能而不会引起相关的并发症的性能。而自体血管的来源有限等缺陷限制了它在临床上的使用。因此自从上世纪初,卡雷尔成功地吻合了人的自体血管,奠定了血管移植手术的基础以来,学者们一直都在为寻找到一个理想的血管移植体而坚持不懈地努力着。然而,到目前为止,已经商品化可以用于临床的移植体仍然主要是由PTFE和涤纶构建的人工血管,这种不能降解的移植体,永远以一个异物的形式存在于人体,所带来的并发症,当然也是驱使人们继续寻找理想血管移植体的原因。还有一些研究机构构建出的TEVG已进入临床转化阶段,但是因为存在的问题还很多,而一直停留在临床实验阶段。因而到目前为止,自体血管的移植仍然是血管移植手术的黄金标准。我们在集前人研究经验的基础上,在体外构建出了pgs/pcl双层血管移植体,内层由可以快速降解的相互连通的多孔状pgs(聚癸二酸丙叁醇酯)管芯构成,外覆有一层厚度大约12微米的菲薄的pcl(聚己内酯)纳米纤维鞘层。可以在常温下长期保存,能够满足临床“即用即得”的需要,同时在体内具有改建和生长的潜能。它多孔连通的结构以及快速降解的特性,能够快速动员机体募集单核细胞、smcs、ecs,而其所具备的柔软、弹性体的力学特性促进了细胞的分化增殖以及细胞外基质的分泌,从而快速补偿材料降解而损失的力学性能。为满足早期抗血流压力的性能,辅以仅有约12μm厚的pcl纳米静电纺丝鞘层。植入体内3个月后,材料几乎完全降解,而被自体的细胞和细胞外基质所替代,形成与自体血管相似的叁层结构。而残留的微量的pcl大约在18个月后也可以完全降解,但是在研究中发现,pgs/pcl血管移植体在改建过程中会呈现出管壁厚薄不均的现象,这就容易发生血管瘤甚至血管破裂。同时也发现有些新生血管管壁变硬,弹性变小;这些都可能导致移植的最终失败。而pgs材料快速降解,pcl鞘层是唯一可以影响中后期改建结果的因素。另外,与大鼠相比较,人有相对更大的血压变化和相对较慢的机体改建能力。因此,研究不同pcl纳米纤维鞘层微观结构的pgs/pcl血管移植体在体内改建的不同表现,从而为进一步优化pgs/pcl血管移植体的结构提供依据,对于最终的临床转化来说非常重要。另外,侵犯到颈动脉的头颈部恶性肿瘤,因为没有合适的血管移植体,而常常使颌面外科医生陷入两难的境地;因此我们尝试用pgs/pcl血管移植体在大鼠体内重建颈动脉,并与临床常用的自体静脉的重建结果做以比较,研究其修复颈动脉的优势,为重建被头颈部恶性肿瘤侵犯的颈总动脉提供一个更有效的治疗手段。我们将实验研究设计为叁个部分,第一部分是利用盐滤沥技术和静电纺丝技术,构建出具有叁种典型微观结构的pcl鞘层的pgs/pcl双层血管移植体;第二部分是将sd雄性大鼠随机分为3组,每组15只,将叁组不同鞘层结构的pgs/pcl血管移植体用显微外科的缝合方法移植到大鼠腹主动脉,分别在术后3个月和12个月取材,通过组织学和生物化学等分析方法,研究鞘层微观结构和力学性能对机体改建的影响,从而为进一步优化鞘层的微观结构参数提供依据。第叁部是将sd大鼠随机分为2组,第一组10只,植入pgs/pcl血管移植体,第二组6只植入大鼠的自体颈外静脉,在第12个月取材,通过组织学和生物化学等分析方法,研究PGS/PCL血管移植体重建颈动脉的优势。我们的研究结果显示,延长静电纺丝时间,显着增加了PCL纳米纤维鞘层的密度和PGS/PCL双层血管移植体的机械力学强度。另外,随着鞘层密度的改变,机体对PGS/PCL双层血管移植体的肌性改建也发生了很大的变化。本组研究中适中密度的PCL纳米纤维丝鞘层结构能够显着提高机体对移植体肌性改建的能力,使募集的平滑肌细胞持续处于一种稳定的分化状态,机体对移植体的改建持续向着一种稳定的、肌性和功能性的方向发展。另外,外膜的血管化和M2型巨噬细胞的渗入,与鞘层密度和微观结构密切相关,通过调整鞘层密度和微观结构可以调节肌性改建和组织细胞的表型。这些发现证实了对缠绕在PGS管芯外的PCL鞘层合理的设计能够启动高质量的肌性改建,从而保证了新生血管具有更强的压力承受能力,优良的缝合操作性能,以及实现在动脉血流动力学环境中的长期与自体血管相当的功能行驶,为进一步的临床转化提供依据。大鼠颈动脉重建的体内实验研究表明,用PGS/PCL血管移植体重建颈动脉,与自体静脉重建颈动脉相比,具有更多的优势,突出表现在:1.新生血管在体内长期的改建过程中未出现管壁过度增生、钙化;2.新生血管壁中出现了大量弹性蛋白的沉积;3.能够形成疏松结缔组织样的外膜结构,不与机体组织发生瘢痕粘连;4.实现了血管壁外膜神经的重建。这个结果暗示了PGS/PCL双层血管移植体可以更好地实现具有收缩性和灵活性并且神经分布比较丰富的肌性颈动脉的重建,为侵犯到颈动脉的头颈部恶性肿瘤的治疗提供一个新的治疗手段。
赵洁[7]2010年在《基于细胞膜片技术构建小口径组织工程血管》文中研究指明利用组织工程技术构建的血管是人类病变血管的理想替代物。组织工程血管移植物(Tissue-engineered vascular graft, TEVG)是目前组织工程研究领域中的重点内容之一。研究内容包括支架材料、种子细胞与构建方法叁方面内容。目的：本实验以临床应用为出发点,研究如何在较短时间内利用自体细胞体外构建出具备管状形态和一定机械强度的组织工程血管移植物,目的在于：①在避免使用外源内部支架的前提下,研究如何单纯利用患者自体骨髓间充质干细胞体外构建血管移植物；②研究骨髓间充质干细胞是否具备类似血管内皮细胞抗血小板黏附的特性；③在细胞膜片技术的基础上,探索体外构建具备管状形态的小口径组织工程血管移植物的构建方法；④观察将体外构建的小口径血管移植物植入动物颈总动脉缺损处后继续分化的能力,管状形态和通畅的保持。方法和结果：实验中,对兔骨髓间充质干细胞的特性进行了检测分析,证明其具有抗血小板黏附的特性。兔骨髓间充质干细胞经体外连续培养数天后能够形成具有一定机械强度和可操作性的细胞膜片,该细胞膜片由5-7层细胞构成,厚度约为50μm。扫描电镜结果显示构成细胞膜片的间充质干细胞排列紧密且有序,细胞外基质丰富。利用细胞膜片和外支撑体复合的方法在体外成功构建出小口径组织工程血管,且得到的血管移植物具有一定的机械强度。采用该策略,我们构建了组织工程自体血管移植物,并将其植入兔子颈总动脉缺损处,进行体内实验研究。实验结果显示体外构建的自体血管移植物在植入体内四周后保持通畅,没有形成血栓,也没有发生堵塞,狭窄等现象。扫描电镜结果表明血管移植物在植入体内2周后发生内皮化,4周时移植物完全内皮化。组化结果显示血管移植物在体内能够保持良好的管状结构,并且其内部结构在体内机械环境的作用下发生改建,得到了与天然动脉血管结构类似的组织工程血管。结论：实验结果表明,间充质干细胞具有类似血管内皮细胞抗血小板黏附的特性,经连续培养数天后可以形成由细胞与细胞外基质组成的叁维立体的细胞膜片,通过外支撑的辅助可以体外构建出小口径的血管移植物。体内研究结果显示,由间充质干细胞膜片体外构建的血管移植物在体内能够保持通畅长达四周,并在体内机械环境的作用下,内部结构发生改建,形成类似天然动脉血管的胶原纤维与弹性纤维的层状结构。此外,血管移植物在动物体内可发生内皮化,四周时移植物内壁完全内皮化,保证其在体内的长期畅通。以上结果表明通过该策略可以在体外构建出用于血管重建的全生物化小口径移植物,并且我们相信通过不断的探索和研究,该方法将有助于人类病变血管的血管重建,以避免使用外源材料给患者带来的并发症,并最终应用于临床治疗。
刘庆阳[8]2005年在《组织工程动脉血管组织构建的初步实验研究》文中认为[目的] 1)运用细胞培养技术获取犬的血管平滑肌细胞，并培养扩增，为组织工程动脉的构建提供种子细胞；2)评价bFGF调控犬血管平滑肌细胞增殖的合理剂量，及其对平滑肌细胞在生物可降解材料上生长的影响；3)对新合成的生物可降解材料进行细胞毒性及生物相容性评价，探讨它们作为组织工程动脉血管支架材料的可行性；4)进行组织工程动脉组织构建的初步实验，为最终获得组织工程动脉移植体并应用到临床奠定实验基础。 [方法] 1)采用组织贴块法培养犬的血管平滑肌细胞，并进行细胞传代培养。观察细胞的形态、生长情况，进行免疫组织化学染色，及电镜检测。了解平滑肌细胞的纯度、细胞形态学特征及细胞的增殖生长情况。 2)对培养的平滑肌细胞给予不同剂量的bFGF，作用不同时间后应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测，比较不同剂量bFGF组之间的平滑肌细胞增殖情况。用含3ng／mL bFGF的培养液在生物可降解载体上培养平滑肌细胞，并设对照组，作用不同时间后比较两组间平滑肌细胞增殖的情况。 3)应用L929细胞株进行生长抑制实验，结合MTT法分别对几种新合成支架材料的细胞毒性进行评价。通过测定接触角比较几种材料的亲水性；将犬的主动脉平滑肌细胞接种于支架材料上，MTT法测定其相对增殖率，比较细胞在不同材料支架上的增殖情况，并应用FITC荧光染色和扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况。 4)将平滑肌细胞种植于胶原膜上，培养13天后形成多层生长的平滑肌细胞层，再将内皮细胞接种在其表面培养两天，形成单层内皮细胞层和多层平滑肌层组成的血管组织。 [结果] 1)通过常规的组织贴块法及酶消化法即可获得高纯度的平滑肌细胞。光镜下细胞具有典型的形态学特征；免疫组化染色显示平滑肌细胞α-肌动蛋白抗体染色阳性。电镜提示平滑肌细胞具有典型细胞形态学特征。 2)使用MTT法测定，不同浓度bFGF组的平滑肌细胞的吸光度值均高于无bFGF组(P＜0.05)，3ng／mL浓度以上组同1ng／mL组之间有显着差异(P＜0.05)，应用3ng／mL bFGF的平滑肌细胞在PEGT／PBT载体上的增殖明显高于对照组(P＜0.05)。 3)水凝胶、PHBV、PU、PHBV和PU共混体的细胞毒性均在0-Ⅰ级。平滑肌细胞可以在T20、PHBV、PEGT／PBT载体材料上黏附生长，
刘宾[9]2009年在《脱细胞组织工程血管支架材料的实验研究》文中认为随着社会的发展,心血管疾病和创伤日益成为威胁人们健康及生命的重要因素。冠状动脉搭桥术、严重创伤致血管损伤和缺损、多种血管移植手术在外科中的应用以及整形外科游离皮瓣转移中血管蒂的长度不足等,使得血管移植材料的研究日益成为人们关注的热点。作为一种全新的技术,组织工程在提供合适的血管移植物研究方面取得了迅速的发展。组织工程血管是一种用组织工程学方法构建的具有良好生物相容性和力学特性的血管替代物,其基本的构件是血管支架材料和种子细胞,而血管支架的研究一直是目前血管组织工程研究领域的难点和重点。组织工程血管支架材料主要分为人工合成的生物可降解高分子聚合物和天然生物支架材料两大类。高分子可降解材料的应用目前虽然得到广泛的认可,但是由于材料价格较为昂贵,合成技术要求高,难以大规模应用。另外由于材料本身的性质影响,其对种子细胞的亲和性不足,构建的组织工程血管顺应性尚不理想,对血液动力学方面可能会有较大影响。而作为天然生物支架材料的脱细胞血管基质,由于其与细胞亲和力强,能为细胞生长、繁殖、分化提供近似体内组织发育的细胞外基质支架,且生物相容性、顺应性以及免疫排斥性低等特点都优于合成材料,因此在血管组织工程中得到越来越多的重视和应用。目前国内外常用的主要脱细胞方法包括:机械法,酶消化法,化学去垢剂法等。以上几种方法各有利弊,物理方法对支架结构的破坏较小但脱细胞效果较差,而化学去垢剂方法脱细胞效果较好却容易破坏血管的胶原结构。另外,在利用化学去垢剂制备生物材料时,去垢剂的残留会导致脱细胞生物材料具有一定程度的细胞毒性。酶消化法制备脱细胞基质材料简单易行,但是高浓度的酶可引起支架胶原结构的破坏,而低浓度酶又无法完全去除动脉壁深部的细胞成份,脱细胞效果并不理想。因此寻找一种更高效和安全的脱细胞方法一直是脱细胞组织工程血管支架研究的一个热点。同其它异体移植材料一样,脱细胞血管支架的研究应用也面临着传播供体潜在疾病以及在移植物处理应用过程中二次污染的问题。传统的生物材料灭菌方法主要有以环氧乙烷为代表的化学法和以钴60照射为代表的电离辐射法两种。但是这些方法都存在操作要求条件较高,过程较复杂以及可能降低材料的机械强度等缺点。因此,我们希望找到一种操作简便、灭菌效果确实、费用低廉、残留低且对材料的生物特性影响较小的脱细胞血管支架消毒方法。目前仍没有足够的证据表明细胞能够长入脱细胞血管基质支架材料内部。因此,如何在保留脱细胞血管支架足够机械强度的前提下,提高脱细胞血管基质材料的疏松性和孔隙率,这也是目前组织工程脱细胞血管支架研究中一个亟待解决的难点。最后,脱细胞血管材料制备后如何长期保存也是一个需要解决的问题,我们希望找到一种简单可行的储存技术来长期保存制备的脱细胞血管支架以达到临床和科研上“随取随用”的目的。本实验采用天然血管作为组织工程血管支架的来源:1.通过反复冻融及超高压处理,摸索上述处理与完全去除血管材料固有细胞所需核酸酶酶浓度的关系,以及对血管材料生物力学特性的影响,从而得到一种体外快速高效构建组织工程化小血管支架材料的方法。2.在上述试验的基础上,我们将0.1%的过氧乙酸作为脱细胞血管支架的消毒剂,对经过氧乙酸处理的脱细胞血管支架进行组织学评估、超微结构观察、生物力学以及细胞毒性测定,以观察过氧乙酸对脱细胞血管支架材料生物相容性和生物力学特性的影响。3.利用超声处理的空化效应,对制备的脱细胞血管支架进行不同强度及不同时间的超声处理。对经超声处理后支架材料的孔隙大小、生物相容性、细胞毒性、生物力学效应及与种子细胞亲和性进行评估,从而得出脱细胞血管材料基质疏松的最佳超声强度参数以及作用时间。4.利用冷冻干燥技术,对制备好的脱细胞血管支架进行真空冷冻干燥处理。通过对经冻干处理并保存的脱细胞血管支架材料的各种生物学特性的分析,以判断冷冻干燥技术是否可以作为脱细胞生物支架材料长期保存的一种方法。本研究结果表明:1.采用反复冻融加超高压结合低浓度核酸酶消化、缓冲液冲洗的脱细胞方法可以在较短的时间内完全除去支架内细胞成份,且对材料的主要生物力学指标以及胶原结构无明显影响。相对于单一的超高压处理或反复冻融处理,反复冻融及超高压两种方法结合不仅能明显提高制备脱细胞血管支架的效率,其对于超高压设备参数的要求也明显降低,使得超高压生物处理这一过程在国产设备上即能完成。因此,其为今后脱细胞血管支架的快速高效制备提供一种新的思路和方法。2.体外试验表明经过0.1%浓度过氧乙酸处理过的脱细胞血管材料,其细胞毒性、生物力学及胶原含量与未经过氧乙酸处理前相比没有明显的差异。因此应用0.1%浓度过氧乙酸作为组织工程血管支架制备过程中的消毒灭菌剂是可行的。3.超声处理参数为强度300瓦,处理间隔1秒,处理时长1分钟时,脱细胞兔股动脉支架材料的疏松程度和材料的生物力学强度处于一个较均衡的水平。即材料疏松程度较未处理前明显提高,而生物力学强度无明显降低。因此,针对不同长度及厚度的血管材料,应用不同参数的超声处理,可以达到在不明显降低材料生物力学特性的前提下,使脱细胞血管基质材料结构明显疏松的目的。4.经过冻干保存处理的脱细胞血管材料,其细胞毒性、生物力学以及其自身胶原结构与未经处理前相比没有明显的差异,冻干保存后的材料在体内依然具有良好的生物相容性。因此我们认为:冷冻干燥处理作为组织工程脱细胞血管支架此类管状生物材料的长期储存方法是可行的。综上所述,通过系列的试验,我们找到了一种组织工程脱细胞血管支架材料快速制备、简便高效消毒及长时间储存的方法。同时我们也初步解决了脱细胞血管基质材料结构致密,种子细胞无法长入的问题,在组织工程脱细胞血管支架的研究上又前进了一步。
孙光孝（Kwang-Hsiao, Sun）[10]2017年在《海藻酸盐水凝胶粘附细胞于静电纺丝聚己内酯血管支架的机体研究》文中认为心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是全世界主要的死亡原因之一。自1949年首次应用于临床后,血管旁路手术已是治疗CVD最常用的方法之一。例如,冠状动脉旁路移植术(Coronary artery bypass grafting,CABG)现已成为冠心病(coronary artery disease,CAD)患者(特别是有多支血管病变的高危患者)血运重建的金标准。在美国,每年进行140万例动脉旁路手术治疗缺血性心脏病及周围血管疾病(包括约500,000例的CABG)。自体来源血管移植物与人造小直径(内径<6 mm)血管移植物(small-diameter vascular grafts,SDVGs)相比,有更好的近、远期通畅率。然而,由于某些原因,如:已存在的血管疾病、截肢、自体血管已被取用等,临床上常没有适合的自体动静脉可用。因此,构建理想SDVGs替代自体血管是当前的热门课题。根据文献报道,在植入机体前,于人工合成或天然移植物的支架表面预先种植细胞,是一种有效的构建理想组织工程血管移植物(tissue engineered vascular graft,TEVG)的方法。但是,在种植细胞后,因等待细胞成熟而产生的时间间隔,仍然是预种植细胞移植物应用于临床的一个障碍。本研究中,我们应用一种创新的人造血管支架细胞种植技术,并通过此技术所构建新型TEVG。从SD大鼠(Sprague-Dawley rats)身上提取大鼠脂肪干细胞(rat adipose-derived stem cells,rADSCs)并将其诱导培养成大鼠内皮祖细胞(rat endothelial progenitor cells,rEPCs)作为构建 TEVG 用的种子细胞。rEPCs通过免疫荧光技术及流式细胞技术对进行鉴定。采用静电纺丝技术制备聚己内酯(polycaprolactone,PCL)支架,通过体内外实验,评估其纤维形貌、机械性能、生物适应性方面的性能。使用海藻酸盐水凝胶粘附细胞法(alginate hydrogel conglutinating cells,AHCC)将rEPCs种植于PCL支架上,成功通过此法构建了TEVG。然后在体外通过AHCC法在PCL支架表面上种植rEPCs并进行观察,以验证AHCC法种植细胞的可行性;同时建立大鼠肾下腹主动脉血管移植物移植的动物模型,观察短期内该TEVG的通畅率、移植物表面内皮化情况、组织形态学变化、免疫组化学变化、移植物表面组织的形貌等情况。实验结果如下所示。免疫荧光及流式细胞技术结果显示,细胞明显表面表达CD34、CD133、VWF抗原。且所诱导的rEPCs具有强大的增殖活性、保持rEPCs状态传代较长、经冻存后细胞生长状态仍可保持良好,是构建TEVG的理想种子细胞。大鼠模型体内外实验结果表明,静电纺丝PCL支架具有亚微米级纤维直径、良好的机械性能、无细胞毒性、良好的生物适应性的特性,表明该支架是构建TEVG的理想支架。体外实验结果表明,AHCC法组支架在相同时间点下具有更好的细胞粘附、增殖性,具有种植时间短、效率高、无毒性、预期通畅率高等特点,是一种有效的细胞种植技术。大鼠模型体内实验发现,在大鼠肾下腹主动脉植入的TEVG,其在1周、2周、4周时间点的观察结果显示,与对照组[空白PCL(blank PCL,BP)支架;空白海藻酸盐水凝胶覆膜(blank alginate hydrogel coating,BAHC)支架;自然沉降种植细胞(natural sedimentation seeding cells,NSSC)支架]相比,AHCC组支架表面可观察到较好的内皮组织再生、排列情况,以及与天然血管内膜形貌较相似的表面形貌。这些结果表明,与对照组相比,AHCC组支架具有较高的通畅率。通过AHCC法,种子细胞能够直接粘附于血管支架表面,从而节省了等待细胞粘附的时间。根据本研究的实验结果,AHCC法可作为一种有效的种植细胞于血管支架的方法。我们能使用AHCC法在短时间内快速构建能够迅速内皮化的TEVG。AHCC法具有节省时间和较好的通畅率等优点。
参考文献：
[1]. 基于细胞膜片技术构建血管化组织工程移植物的研究[D]. 焦红敬. 兰州大学. 2018
[2]. 组织工程方法构建全生物化血管移植物的实验研究[D]. 夏文森. 第四军医大学. 2006
[3]. 大网膜包裹构建血管化组织工程骨的实验研究[D]. 肖仕辉. 广西医科大学. 2012
[4]. 基于双层蛛丝蛋白血管支架和干细胞构建小直径组织工程血管及其修复动脉缺损的研究[D]. 赵亮. 福建师范大学. 2014
[5]. 一种具有原位血管再生潜能的小口径肝素化血管移植物的制备[D]. 王莉. 吉林大学. 2015
[6]. PGS/PCL双层血管移植体体内引导重塑重建颈动脉的实验研究[D]. 杨欣. 第四军医大学. 2016
[7]. 基于细胞膜片技术构建小口径组织工程血管[D]. 赵洁. 西北大学. 2010
[8]. 组织工程动脉血管组织构建的初步实验研究[D]. 刘庆阳. 中国协和医科大学. 2005
[9]. 脱细胞组织工程血管支架材料的实验研究[D]. 刘宾. 第四军医大学. 2009
[10]. 海藻酸盐水凝胶粘附细胞于静电纺丝聚己内酯血管支架的机体研究[D]. 孙光孝（Kwang-Hsiao, Sun）. 南京大学. 2017