海洋地衣芽孢杆菌脂肪酶的酶学性质表征及催化机制研究

论文摘要

甘油单酯脂肪酶是一类专一性地作用于甘油单酯底物的水解酶,其独特的催化特性使其在工业应用中极具应用价值。另外,甘油单酯脂肪酶在哺乳动物生理调节方面也起到了关键的作用。开展工业需求或参与生理代谢关键酶三维结构的研究,有助于理解该类酶的结构与功能关系及丰富酶学理论,具有科学与实际应用研究价值。本课题以海洋地衣芽孢杆菌的甘油单酯脂肪酶Geobacillus sp.12AMOR1（GMGL）为研究对象,研究了重组酶的制备、酶学性质及三维结构的解析,结合定点突变和分子动力学模拟等手段研究及阐述GMGL识别及水解底物的过程。主要研究内容如下:（1）GMGL的制备和酶学性质研究。利用全基因合成技术获得了来源于海洋地衣芽孢杆菌的甘油单酯脂肪酶基因,构建了GMGL原核表达载体并在大肠杆菌BL21（DE3）宿主中实现了高表达,利用金属螯合亲和层析方法对GMGL重组酶蛋白进行“一步法”的分离纯化,SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白条带均一,纯度大于90%。酶学性质表征结果显示:GMGL的最适反应温度为60 oC,该酶在70oC的T1/2为60 min;最适反应pH为8.0,在偏碱性的环境中较为稳定。水解甘油单酯底物及酯化甘油与脂肪酸的实验证实,GMGL为甘油单酯脂肪酶。（2）GMGL晶体结构的解析。采用凝胶过滤层析获得更高纯度的GMGL蛋白,并优化获得酶蛋白可衍射的结晶条件:蛋白浓度为12 mg/mL、0.2 M Ammonium sulfate、0.1 M MES monohydrate（pH 6.6）、28%w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000、20 oC。通过分子置换的方法解析出分辨率2.19?的GMGL蛋白结构（PDB ID:5XKS）。GMGL结构属于典型的α/β水解酶类,由9个α-helix和9个β-sheet构成。GMGL的催化三联体由Ser97、Asp196和His226组成,氧负离子洞由Phe29和Met98的主链-NH-基组成。（3）GMGL底物选择性的研究。通过晶体学分析,选择了催化口袋中可能影响链长选择性的Leu142、Ile145和Ile170等位点,构建了Leu142Ala、Ile145Ala和Ile170Phe突变体。考察了野生型及突变体作用于不同脂肪酸链长的对硝基苯酚酯底物的kcat/Km值,结果显示:相对于野生型,Leu142Ala、Ile145Ala和Ile170Phe对于pNP-C6底物的选择性分别有2.3、1.2和2.2倍的提高。（4）GMGL识别及水解底物的过程。分子动力学分析发现单甘酯酶的结构中存在独特的“孔洞结构”,选择孔洞附近的S32、S35、S147和E156氨基酸位点,共构建了12个突变体（S32W/S32V/S32A、S35W/S35V/S35A、S147W/S147V/S147A、E156W/E156V/E156A）,并利用硬脂酸单甘酯为水解底物检测酶突变体的水解活力。结果显示:相对于野生型,所有突变体均表现出不同程度的抑制现象,提示该“孔洞结构”可能是参与水解产物甘油的释放通道。综合生化实验数据及生物计算分析,进一步提出了GMGL通过酶的“诱导契合”识别及水解底物的过程。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐薇

导师: 蓝东明

关键词: 甘油单酯脂肪酶,晶体结构,底物选择性,诱导契合机制,甘油释放通道

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华南理工大学

分类号: Q55

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001530

总页数: 89

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