单增李斯特菌群体感应抑制剂的筛选及控制效应研究

论文摘要

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.m）生活范围非常广泛,可以在碱性、酸性及低温条件下生长,具有极强的抗逆性。另外,产生的内化素（inlA和inlB）、溶血素（LLO）等多种毒力因子,极易引发高的致死率,易于形成的生物膜（Biofoilm）也对加工工具与储藏环境的清洗造成不便,增强了L.m对外界环境理化因素的耐受力。该菌已被WTO世界卫生组织定义为四大食源性致病菌之一。L.m污染导致的高致病率与死亡率主要是受细菌群体感应系统（Quorum sensing,QS）调控产生的生物被膜与毒力因子造成的。因此,可以利用外源化合物作为群体感应抑制剂（Quorum sensing inhibitors,QSIs）阻断信号分子与受体的结合,靶向干扰细菌QS功能的正常发挥,继而控制L.m的危害。本实验通过检测哈维氏弧菌BB170生物发光的强弱,对4-羟基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（DMHF）和16株海洋源乳酸菌代谢物进行AI-2类QSIs的筛选,通过质粒克隆技术构建了一株表达绿色荧光蛋白的报告菌株,通过检测绿色荧光的强弱对一种合成肽及红树林源芽孢杆菌代谢物进行Agr类QSIs的筛选。再通过对L.m的生长、生物膜与动力的形成、毒力及毒力基因表达的测定,评价QSIs对L.m的QS干扰效果,主要实验内容与结果如下:1、通过指示菌哈维氏弧菌BB170的生物发光实验对本实验室所保存的16株海洋源乳酸菌的乙酸乙酯粗提物和食品香料DMHF进行AI-2类QSIs的筛选。针对单增李斯特菌的Agr类QS系统筛选QSIs,先通过基因合成技术设计合成pⅡ-EGFP片段,再经SalⅠ/XbaⅠ双酶切后克隆于载体质粒p ERL3模板中,利用T4 DNA连接酶构建重组质粒p ERL3-PⅡ-EGFP,并电转化于L.m野生株EGDe,利用设计的特异性引物对构建的质粒与报告菌株进行PCR鉴定,获得一株可筛选Agr类QSIs报告菌株L.m p ERL3-PⅡ-EGFP。利用荧光倒置显微镜观察构建的报告菌株发光的强弱,对本实验室保存的17株芽孢杆菌上清液与根据文献设计L.m的AIP结构类似物的合成肽进行Agr类QSIs的筛选。结果显示:筛选得到6株乳酸菌代谢产物对L.m的AI-2活性的抑制率均高于75%,占筛选材料35%,尤其菌株戊糖片球菌B-1对AI-2活性值抑制率高于98.5%。食品级香料100μg/mL的DMHF对L.m AI-2抑制率高达80%;成功构建了携带重组质粒的报告菌株L.m p ERL3-PⅡ-EGFP,并筛选得到2株解淀粉芽孢杆菌上清液有良好的Agr类QS抑制活性,占筛选材料11.8%,合成肽能完全抑制报告菌株的发光。2、通过光密度值定量测定QSIs作用下L.m的生长曲线,评价筛选得到的QSIs的抑菌效果;利用半固体穿刺培养的方法检测L.m在低浓度的QSIs作用下的动力;利用结晶紫染色法和光学显微镜观察结合分别测定和观察不同的QSIs作用下L.m的生物膜含量与形貌特征。结果显示:利用QSIs靶向干扰QS系统的这一策略,筛选得到200μg/mL的DMHF、500 nM的合成肽、500μg/mL的戊糖片球菌乙酸乙酯提取物B-1、解淀粉芽孢杆菌上清提取物HY-4、HY-5均可以实现以较低的剂量有效地控制病原菌生长、生物膜的形成与毒力因子的表达。推迟L.m进入生长期的时间并有效降低其最终生长浓度,并抑制鞭毛的运动,形成的生物膜结构疏松间接控制了L.m的感染和致病能力。而50 nM合成肽可以良好的抑制报告菌株发光,证明其有一定的Agr类群体感应抑制效果,但未能观察得到其对L.m的生长、动力及生物膜的抑制效果。3、为探索筛选得到的QSIs对L.m毒力的作用效果,本研究通过溶血平板法直观检测溶血环表示QSIs作用下L.m的产毒能力的变化,并结合RT-qPCR法检验QSIs对L.m关键毒力基因的表达,包括溶血素hly、内化素inlA、肌动球蛋白act A和agrD基因。同时分析了AgrD基因的表达来进一步判定构建的Agr类报告菌株筛选结果的准确性。结果显示:溶血平板实验直观的表现出QSIs对L.m的溶血素LLO的表达的抑制效果。采用RT-qPCR定量检测毒力基因的表达,与阴性对照相比,100μg/mL的DMHF对hly和inlA毒力基因的抑制率均为50%;500μg/mL戊糖片球菌B-1对hly、inlA、actA毒力基因显著抑制高达80%;500 nM合成肽对hly、inlA毒力基因表达有良好的抑制效果,而对actA基因抑制效果不佳;500μg/mL解淀粉芽孢杆菌HY-5相较HY-4的抑制效果更好,且对agrD基因的显著抑制验证了合成肽与解淀粉芽孢杆菌HY-5、HY-4是Agr类QSIs。

论文目录

摘要

Abstract

1 绪论

1.1 单增李斯特菌概况

1.1.1 单增李斯特菌的生物学特征

1.1.2 单增李斯特菌的危害

1.1.2.1 单增李斯特菌的毒力因子

1.1.2.2 单增李斯特菌的生物膜

1.2 细菌的群体感应系统

1.2.1 细菌群体感应系统的分类

1.2.2 单增李斯特菌的群体感应系统

1.3 群体感应抑制剂QSIs

1.3.1 天然群体感应抑制剂

1.3.2 人工合成群体感应抑制剂

1.3.3 群体感应抑制剂的筛选方法

1.4 本研究目的意义、研究内容与创新点

1.4.1 研究目的与意义

1.4.2 研究内容

1.4.3 创新点

2 单增李斯特菌群体感应抑制剂的筛选

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌种及培养基

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 单增李斯特菌AI-2类QSIs的筛选

2.2.1.1 潜在AI-2 类抑制剂的制备

2.2.1.2 AI-2类QSIs的筛选

2.2.2 单增李斯特菌Agr类 QSIs的筛选

2.2.2.1 Agr类启动子及荧光质粒的选择

2.2.2.2 PⅡ-EGPF目的片段的获得

2.2.2.3 报告质粒p ERL3-pⅡ-EGFP的构建与鉴定

2.2.2.4 单增李斯特菌感受态细胞的制备

2.2.2.5 报告菌株L.m-p ERL3-pⅡ-EGFP的构建与鉴定

2.2.2.6 潜在Agr类抑制剂的制备

2.2.2.7 Agr类 QSIs的筛选

2.2.3 统计学分析

2.3 结果与分析

2.3.1 单增李斯特菌AI-2 类群体感应抑制剂的筛选

2.3.2 Agr类报告质粒p ERL3-PⅡ-EGFP的构建与鉴定

2.3.3 Agr类报告菌株L.m pERPL3-PⅡ-EGFP的构建与鉴定

2.3.4 报告菌株的荧光检测

2.3.5 Agr类 QSIs的筛选结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

3 群体感应抑制剂对单增李斯特菌生长特性的研究

3.1 材料与仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 筛选得到的群体感应抑制剂的制备

3.2.2 QSIs对 L.m 生长的影响

3.2.3 QSIs对 L.m 动力的影响

3.2.4 QSIs对 L.m 生物膜形成的抑制

3.2.4.1 生物膜形成的定量检测

3.2.4.2 生物膜的形貌观察

3.2.5 统计学分析

3.3 结果与分析

3.3.1 QSIs对 L.m 生长曲线的影响

3.3.2 QSIs对 L.m 动力形成的影响

3.3.3 QSIs对 L.m 生物被膜形成的抑制

3.3.4 QSIs对 L.m 生物膜形貌的影响

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 群体感应抑制剂对单增李斯特菌溶血性及关键基因表达的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器

4.2 试验方法

4.2.1 QSIs对 L.m 溶血活性的影响

4.2.1.1 兔血平板的制备

4.2.1.2 QSIs作用下L.m 溶血活性测定

4.2.2 QSIs对 L.m 基因表达的影响

4.2.2.1 QSIs作用下L.m总RNA的提取

4.2.2.2 QSIs作用下L.m 提取的RNA纯度检测

4.2.2.3 QSIs作用下L.m提取的RNA完整性检测

4.2.2.4 QSIs作用下L.m 提取的RNA逆转录c DNA

4.2.2.5 RT-qPCR定量检测

4.3 结果与分析

4.3.1 QSIs对 L.m 溶血素形成的抑制

4.3.2 QSIs作用下L.m提取的RNA纯度检测结果

4.3.3 QSIs作用下L.m 提取的RNA完整性检测结果

4.3.4 RT-qPCR结果

4.3.4.1 溶解曲线结果

4.3.4.2 QSIs对关键基因的表达抑制结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 不足与展望

参考文献

致谢

作者简介

导师简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴雅茜

导师: 刘颖

关键词: 单增李斯特菌,群体感应抑制剂,控制效应

来源: 广东海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 广东海洋大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27788/d.cnki.ggdhy.2019.000096

总页数: 63

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