论文摘要
研究背景:髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）是一类髓系起源的异质性群体,包含髓样前体细胞和不成熟髓样细胞,后者又包括不成熟的巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞。感染、肿瘤、炎症、创伤或自身免疫性疾病等病理状态下,MDSCs在骨髓、脾脏、淋巴结、血液以及外周组织局部大量聚集。MDSCs发挥免疫调节作用时,经历扩增和活化两个过程。首先慢性炎症相关的因子（IL-6、GM-CSF、SCF、PGE等）扩增髓样前体细胞和不成熟髓样细胞并募集其至外周,被募集到外周的MDSCs被局部组织来源的因子（如IL-4、IL-13和TGF-b等）进一步活化。活化后的MDSCs表达高水平精氨酸酶1（ARG1）和一氧化氮合酶（iNOS）。ARG1分解或消耗T细胞活化所必需的L-精氨酸,导致T细胞活化受阻;iNOS活性的上调导致NO产量增加,其能够通过阻断信号蛋白（如JAK3或STAT5）的磷酸化来抑制IL-2受体的下游通路或直接诱导T细胞凋亡。MDSCs也可通过分泌Th2型细胞因子IL-10和通过膜型TGF-b1分别抑制巨噬细胞和NK细胞的功能。MDSCs正是通过对T细胞、巨噬细胞和NK细胞的影响,从而介导了对机体特异性和固有性免疫的抑制作用。MDSCs还可以表达多种促血管形成因子,如血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMPs）,这些因子能够直接促进肿瘤血管的生成,从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。MicroRNAs（miRNAs）是一类高度保守的,含有17-25个核苷酸的非编码RNA分子,其通过与靶基因的3’端非编码区（3’-UTR）的碱基特异性结合来调控靶基因的表达。越来越多的研究表明,miRNAs对MDSCs的活力和免疫学活性发挥重要的调控作用。miR-20b是miRNA 106a-363基因簇家族中的一员,定位在哺乳动物的X染色体。目前关于miR-20b的研究多集中在其对肿瘤细胞的影响上。如miR-20b过表达增加畸胎瘤细胞的凋亡和促进其分化。在结直肠癌中,上调表达的miR-20b抑制PTEN的表达导致结直肠癌B7-h1过表达,从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。然而近期有研究发现miR-20b还可以影响免疫细胞的活性,如抑制Th17细胞的分化从而降低EAE疾病的严重性。最近又有研究表明,过表达miR-20b可降低巨噬细胞的活力并诱导其凋亡。但miR-20b是否可影响MDSCs的活力及生物学活性还不清楚。目的:探讨miR-20b对MDSCs活力及生物学活性的影响及其相关机制。方法:使用小鼠肝癌细胞株H22构建小鼠肝癌移植瘤模型,免疫磁珠法分选正常及荷瘤小鼠的骨髓、脾脏及局部组织MDSCs,荧光定量PCR检测MDSCs miR-20b的表达。H22肿瘤细胞培养上清（tumor cell-conditioned medium,TCCM）或IL-33或IL-6+GM-CSF刺激正常小鼠骨髓来源MDSCs 24h,荧光定量PCR检测MDSCs miR-20b表达;IL-33刺激MDSCs不同时间点（0h、6h、12h、24h）,荧光定量PCR检测MDSCs miR-20b、ARG1及MMP2的表达;分选正常小鼠骨髓、荷瘤鼠脾脏及肿瘤局部组织MDSCs,荧光定量PCR检测MDSCs细胞中miR-20b、ARG1及MMP2的表达;荷瘤鼠脾脏来源MDSCs转染表达miR-20b inhibitor的慢病毒（lv-sponge）或其对照慢病毒（lv-ctrl）后72h,荧光定量PCR检测miR-20b表达情况;lv-sponge或lv-ctrl感染荷瘤鼠脾脏来源MDSCs 48h后,继续加入TCCM刺激24h,荧光定量PCR检查ARG1及MMP2的表达情况。将荷瘤鼠脾脏来源MDSCs转染lv-sponge或lv-ctrl 72h,然后用CFSE荧光标记,CMTMR标记的H22细胞单独或与CFSE标记的各种MDSCs混合放入铺有Matrigel的Transwell上室,进行体外侵袭实验,8h后离心收集下室细胞,荧光显微镜拍照并计数;荷瘤鼠脾脏来源MDSCs转染lv-sponge或lv-ctrl慢病毒,72h后流式细胞术检测CCR2表达;将荷瘤鼠脾脏来源MDSCs放入Transwell小室的上室,下室培养液中加入CCL2或PBS,进行细胞迁移实验,8h后将小室取出,离心收集下层细胞进行计数。miRanda算法预测FOXO1 3’-UTR区是否存在miR-20b的结合位点;分离正常及荷瘤小鼠骨髓来源MDSCs,荧光定量PCR和免疫印迹分别检测MDSCs FOXO1 mRNA和蛋白表达;构建含有FOXO13’-UTR的双荧光素酶报告基因重组质粒载体;重组质粒与miR-20b mimics或scramble共转染Hela细胞,检测报告基因海肾荧光素酶的活性;lv-sponge或lv-ctrl慢病毒转染荷瘤鼠脾脏来源MDSCs 48h及72h后,流式细胞术检测MDSCs凋亡率;FOXO1 siRNA将MDSCs中FOXO1干扰24h,再转染lv-sponge或lv-ctrl慢病毒72h后,流式细胞术检测MDSCs凋亡率。结果:与正常小鼠MDSCs相比,荷瘤鼠骨髓、脾脏和局部组织中MDSCs细胞miR-20b表达均明显升高（p<0.05）。TCCM以1/2、1/5、1/10稀释度刺激正常小鼠骨髓来源MDSCs 24h后,与ctrl组相比miR-20b相对表达量上调（p<0.01）;与ctrl组相比,IL-6和GM-CSF联合共刺激组miR-20b相对表达量无明显变化（p>0.05）,而IL-33刺激组miR-20b相对表达量上调（p<0.01）;与TCCM单独刺激组相比,IL-33抗体阻断组miR-20b相对表达量下调（p<0.05）;与刺激0h相比,IL-33刺激6h、12h和24h miR-20b、ARG1和MMP2的mRNA相对表达量上调（p<0.01）。相对于lv-ctrl慢病毒感染组,lv-sponge慢病毒感染组miR-20b相对表达量下调（p<0.05）;MDSCs转染lv-sponge和lv-ctrl慢病毒72h后,与lv-ctrl组相比,ARG1及MMP2的mRNA相对表达量明显降低（p<0.01）。与H22细胞+lv-ctrl转染MDSCs组相比,H22细胞+lv-sponge转染MDSCs组H22细胞侵袭入下室的数目明显减少（p<0.01）;lv-ctrl慢病毒转染组和lv-sponge慢病毒转染组MDSCs表面CCR2的表达无明显差异（p>0.05）;与PBS组相比,CCL2组MDSCs迁移数量明显增加（p<0.01）,但相对于lv-ctrl慢病毒组,转染lv-sponge慢病毒的MDSCs对于CCL2趋化迁移的数目明显减少（p<0.01）。利用miRanda算法可以预测到FOXO1 3’-UTR区存在miR-20b的结合位点;荷瘤鼠MDSCs FOXO1蛋白表达水平明显低于正常小鼠MDSCs（p<0.01）,FOXO1mRNA水平无明显变化（p>0.05）。琼脂糖凝胶电泳法和测序法证明成功构建pmiR-RB-ReportTM-FOXO1 3’-UTR双荧光素酶报告载体;FOXO1重组质粒+miR-20b mimics共转染组荧光素酶活性明显低于空质粒+miR-20b mimics组（P<0.05）;与lv-ctrl组相比,lv-sponge感染组MDSCs FOXO1蛋白表达上调（p<0.05）。lv-sponge感染48h组MDSCs凋亡细胞的比例与ctrl和lv-ctrl感染组相比,并无明显变化（p>0.05）;但与ctrl组和lv-ctrl感染组相比,lv-sponge感染72h组MDSCs annexinⅤ阳性细胞比例明显增加（p<0.01）;与lv-sponge感染组相比,lv-sponge+FOXO1 siRNA组细胞凋亡率明显降低（p<0.01）。结论:荷瘤鼠骨髓、脾脏及肿瘤组织MDSCs中miR-20b表达增高;肿瘤起源的因子（特别是IL-33）诱导MDSCs miR-20b表达上调;miR-20b增加MDSCs的迁移性并上调其促进H22细胞侵袭的能力;miR-20b靶向FOXO1抑制MDSCs的凋亡。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 何晶
导师: 宋传旺
关键词: 凋亡
来源: 蚌埠医学院
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 蚌埠医学院
分类号: R392
总页数: 64
文件大小: 2745K
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标签：凋亡论文;